Name: Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde workflow voor kwantitatieve analyse van fluorescerende eiwitten in Drosophila-modellen van neurodegeneratie. Deze methode minimaliseert selectiebias en maximaliseert reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de Sheila en David Fuente neuropatische pijn onderzoek programma Graduate Fellowship (naar J.M.B.), de Lois Pope LIFE Fellows Program (aan cl, Y.Z., en J.M.B.), de Snyder-Robinson Foundation predoctoraal Fellowship (naar cl), de Dr. John T . Macdonald Stichting (CL), contracten, subsidies van de National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 en R56NS095893 (voor R.G.Z.), en door Taishan geleerde Project (provincie Shandong, Volksrepubliek China) (R.G.Z.).

<ol><li>Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Neurology+and+Epidemiology+of+the+Major+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671(2012).</li>
<li>Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor autophagy in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 134-139 (2014).</li>
<li>Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+kinetics+and+their+pathological+role+in+a+Drosophila+Huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model.</a> Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).</li>
<li>DeVorkin, L., Gorski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+Drosophila+using+fluorescent+reporters+in+the+UAS-GAL4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22135655">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894502">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Nmnat+functions+as+a+switch+to+enhance+neuroprotection+under+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress.</a> Nature Communications. 6, 10057(2015).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+synthase+NMNAT+acts+as+a+chaperone+to+protect+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration.</a> Nature. 452 (7189), 887(2008).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermine+synthase+deficiency+causes+lysosomal+dysfunction+and+oxidative+stress+in+models+of+Snyder-Robinson+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome.</a> Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).</li>
<li>Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+structure+of+synaptic+contacts+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and structure of synaptic contacts in Drosophila.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).</li>
<li>Maday, S., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+biogenesis+in+primary+neurons+follows+an+ordered+and+spatially+regulated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway.</a> Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+lysosomal+dysfunction+causes+cargo-specific+deficits+of+axonal+transport+leading+to+Alzheimer-like+neuritic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy.</a> Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).</li>
<li>Vincent, L., Soille, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/a381/9dda9a5f00dbb8cd3413ca7422e37a0d5794.pdf">Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).</li>
<li>Najman, L., Schmitt, M. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/546254/">Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation.</a> IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).</li>
<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier geschetste protocol kan worden gebruikt om krachtig en reproducibly kwantificeren cel biologische processen gevisualiseerd door fluorescentie gebaseerde imaging. Biologische context en technische beperkingen moeten zorgvuldig worden overwogen bij de proefopzet. Fluorescerende markers van subcellular structuren van belang, of immunohistochemische, kleurstof gebaseerde of genetisch uitgedrukt, moet worden onderscheiden boven achtergrond door morfologie en intensiteit. De UAS/GAL4 -systeem wordt veel gebrui...

Neurodegeneratieve ziekten miljoenen mensen elk jaar en de incidentie neemt toe met een verouderende bevolking1. Terwijl elke neurodegeneratieve ziekte heeft een unieke etiologie, zijn aggregatie van eiwitten van de misfolded en de verdeling van het proteostasis-netwerk gemeenschappelijk pathologische kenmerken van veel van deze ziekten. Ophelderen hoe verstoring van deze fundamentele en onderling verbonden processen misgaat is om bij te dragen tot de neuronale cel en dysfunctie dood essentieel voor het begrip van neurodegeneratieve ziekten, alsmede het begeleiden van therapeutische interventies. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming voorziet in onderzoek van deze complexe en dynamische processen in neuronen en heeft bijgedragen aan ons begrip van de neuronale celbiologie. Analyse van fluorescently tagged eiwitten is uitdagend, met name wanneer de experimenten zijn uitgevoerd in vivo, als gevolg van de zeer compacte weefsels, diverse celtypes en morfologische heterogeniteit. Handmatig geassisteerde kwantificering is betaalbaar en eenvoudig, maar is vaak tijdrovend en onder voorbehoud van menselijke bias. Daarom is er behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies.
We hebben een eenvoudige en flexibele workflow met behulp van Fiji/ImageJ, een krachtige en vrij toegankelijke beeldverwerking software2,3, kwantitatieve om gegevens te extraheren uit imaging fluorescentiestudies in experimentele modellen van geschetst neurodegeneratie met behulp van Drosophila. Door het volgen van dit protocol om te kwantificeren aggregatie van eiwitten en autophagic flux — twee biologische functies die zeer relevant voor neurodegeneratieve ziekte pathologie zijn cel — we de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van deze aanpak aangetoond. Onderzoek van fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) eiwitten in de Drosophila optic kwab bleek het aantal, de grootte en de intensiteit van de eiwit-aggregaten. Wij een tandem fluorescerende verslaggever van autophagic flux binnen het visuele systeem van Drosophila , waarin verschillende emissie signalen afhankelijk van de compartimentaire omgeving4gevisualiseerd. Ratiometric gebaseerde analyse van de tandem verslaggever toegestaan voor een kwantitatieve en compleet beeld van autophagy-lysosoom flux van autophagosome formatie, rijping en vervoer tot degradatie in het lysosoom en daarnaast gemarkeerd kwetsbaar compartimenten verstoord in neurodegeneratieve omstandigheden. Nog belangrijker is, in beide analyses uitgevoerd we semi-geautomatiseerde drempelmethode en segmentatie stappen in ons protocol aan onbewuste bias te minimaliseren, vergroten van de macht van de bemonstering en bieden een standaard om vergelijkingen tussen soortgelijke studies. De eenvoudige werkstroom is bedoeld om krachtige Fiji/ImageJ plugins (ontwikkeld door informatici die zijn gebaseerd op wiskundige algoritmen) toegankelijker voor neurobiologists en de biowetenschappen Gemeenschap in het algemeen.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Dissectiebak</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriologische Petri-schaal</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Dissectiebak</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dissectietool</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS-oplossing</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat Dibasisch&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS-oplossing</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat Monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS-oplossing</td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Was- en antilichaam incubatieoplossing.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td>Fixatie</td></tr><tr><td>Weggeef microcentrifugebuisjes (0,5mL, blauw)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fixatie, wassen en antilichaam incubatie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Vlakke en matte Micro Slides (25&times;75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Glijbanen voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>Micro Dekglasjes, rechthoekig (22&times;40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Glijbanen voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>Rubbercement</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Monteren</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montage Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Monteren</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Onzichtbaar Plakband (19mm&times;25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Monteren</td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Antilichaam incubatie</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Kleurstof voor nucleïnezuur. Oplossen in gedeïoniseerd water om een stockoplossing van 5 mg/mL te maken en bewaren bij -80&deg;C. Verdun tot een werkconcentratie van 10-20 &mu;g/mL in PBTx.</td></tr><tr><td>3,5X-90X Stereo Zoom Inspectie Industriële Microscoop</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Dissectiescoop. Uitgerust met 6W LED Dual Gooseneck Verlichter</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Met SCF_MPI_CBG plugins (versie 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Confocale-laser Scanning Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in drosophila door onbevooroordeelde analyse van fluorescently tagged eiwitten met behulp van imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Met de stijgende prevalentie van neurodegeneratieve ziekten is het steeds belangrijker om te begrijpen van de onderliggende pathofysiologie, dat tot neuronale disfunctie en verlies leidt. Fluorescentie gebaseerde imaging tools en technologieën inschakelen ongekende analyse van subcellular neurobiologische processen, maar er nog behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen is voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies . We hebben een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie gebaseerde imaging studies met behulp van Drosophila modellen van neurodegeneratie ontwikkeld. Specifiek, beschrijven we een aanpak van het gemakkelijk-aan-volg, semi-geautomatiseerde Fiji/ImageJ met twee cellulaire processen te analyseren: ten eerste, we kwantificeren totale eiwitgehalte en profiel in de Drosophila optic kwab met behulp van fluorescentie-gelabeld mutant huntingtin eiwitten; en ten tweede, wij beoordelen autophagy-lysosoom flux in het visuele systeem van de Drosophila met ratiometric gebaseerde kwantificering van een tandem fluorescerende verslaggever van autophagy. Nog belangrijker is, bevat het protocol hier geschetste een semi-automatische segmentatie stap om ervoor te zorgen dat alle TL structuren worden geanalyseerd om te minimaliseren van selectie bias en om resolutie van subtiele vergelijkingen te verhogen. Deze aanpak kan worden uitgebreid voor de analyse van andere cel biologische structuren en processen betrokken in neurodegeneratie, zoals eiwithoudende puncta (stress korrels en synaptische complexen), zo goed als membraan-gebonden afdelingen (mitochondriën en membraan mensenhandel blaasjes). Deze methode biedt een gestandaardiseerde, maar aanpasbare referentiepunt voor beeldanalyse en kwantificering, en kon vergemakkelijken van betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid over het veld, en uiteindelijk mechanistische inzicht van neurodegeneratie vergroten.

Kwantificering van het aantal, het gebied en de intensiteit van fluorescently tagged mutant Htt aggregaten in de Drosophila optic kwab
Om te onderzoeken misfolded eiwit samenvoeging in het centrale zenuwstelsel van een Drosophila model van de ziekte van Huntington, RFP-gelabeld mutant menselijke Htt met een niet-pathologische (UAS-RFP-hHttQ15) of pathologische uitbreiding ( UAS-RFP-hHttQ138) en m...

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

We ontwikkelden deze methode om kwantitatieve gegevens te extraheren uit fluorescentie-gebaseerde beeldstudie om complexe en dynamische cellulaire biologische processen in Drosophila-modellen van neurodegeneratie te extraheren. Het grootste voordeel van deze techniek is de aanpasbare, semi-automatische workflow voor beeldanalyse om selectiebias te minimaliseren, de steekproefomvang te maximaliseren en reproduceerbaarheid in het hele veld te bereiken. Deze aanpak kan worden uitgebreid voor de analyse van andere proteïne-puncta en membraangebonden compartimenten die betrokken zijn bij neurodegeneratie en die uiteindelijk ons mechanistische begrip van neurodegeneratieve ziekten zullen verbeteren.Om de lamina intact te houden tijdens de dissectie onder een stereomicroscoop, plaatst u twee pincetten onder de retina en scheur door het midden van het oog om de retina te verwijderen. Houdt de pincetten parallel aan het laminaoppervlak en trekt eventueel overgebleven retinale weefsel dat aan de lamina is gehecht weg. Dissecteer drie tot vijf hersenen voor elke groep en breng de hersenen over naar een microcentrifugebuis met een geschikt fixeermiddel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.Na drie 15-minuten wasbeurten met PBS plus Triton X-100, of PBTx, vervangt u de laatste was met het primaire antilichaam van belang, verdund in PBTx met 5% normaal geitenserum voor een overnachtelijke incubatie in een aliquotmixer bij vier graden Celsius. De volgende ochtend verwijdert u het overtollige antilichaam met drie 15-minuten wasbeurten in PBTx en incubeert u de hersenen in een geschikt secundair antilichaam, verdund in PBTx met 5% normaal geitenserum, gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie wast u de hersenen drie keer zoals gedemonstreerd en plaatst u een druppel montagemiddel tussen twee stukjes doorzichtig plakband in het midden van een microscoopglaasje per weefselmonster.Plaats de hersenen in het montagemiddel gedurende één tot twee minuten. Wanneer de weefsels transparant worden, gebruikt u een pipet om het montagemiddel voorzichtig van elke kant te verwijderen. Om de gekleurde weefsels te beeld, brengt u een druppel vers montagemiddel aan op de hersenen en plaatst u de monsters voorzichtig onder een dekglas.Verzegeld de randen van het dekglas met rubbercement en laat de schuifjes 20 minuten drogen bij kamertemperatuur. Bekijk vervolgens het specimen op de microscoop en pas de beelddetectorbesturingen van de fluorescentiemicroscoop aan om de hoogste signaal-ruisverhouding in het hoogste dynamische bereik van het specimen te vangen. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, bekijkt u een specimen van een andere groep om te bevestigen dat de instellingen geschikt zullen zijn voor het hele experiment.Het eerste specimen kan vervolgens worden afgebeeld, waarbij u ervoor zorgt dat het beeld wordt opgeslagen als een bestandstype dat metadata kan bewaren, zoals acquisitieparameters en ruimtelijke kalibratie. Om de beelden te analyseren, opent u een afbeelding in Fiji, selecteert u Bekijk Stack met Hyperstack uit het dialoogvenster Bio-formats Import Opties en stelt u de kleurmodus in op Grijswaarden. Identificeer een gebied op basis van de markerkanalen dat kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde interessegebied voor monsters, door gebruik te maken van de C-scrollbalk om de kanalen te bekijken en de Z-scrollbalk om door de brandpunten te bewegen.Om de beeldanalyse te vereenvoudigen, genereert u een nieuwe afbeelding met de kanalen en brandpunten en selecteert u Afbeelding en Dubbel. Stel de gewenste kanalen en plakken in en wijzig de bestandsnaam om de selectie weer te geven. Selecteer handmatig een gestandaardiseerd interessegebied met behulp van een Selectietool op basis van de eerder bepaalde selectiecriteria.Klik op Analyseren, Gereedschappen, Interessegebied Manager en Voeg toe om het interessegebied toe te voegen aan de Interessegebied Manager. Klik vervolgens op Meer en Sla op en noem het bestand naar het interessegebied. Voor voorverwerking van de beelden, klikt u op Verwerken in Filters en selecteert u een geschikte filter.Selecteer hier filterinstellingen die ruis verminderen terwijl randen worden behouden om de detectie van de interessante structuren tijdens segmentatie te vergemakkelijken. Met het voorverwerkte beeld actief in Fiji, klikt u op SCF, Labelen en Interactieve H_Watershed. Pas vanuit het controlepaneel de Zaaddynamiek, Intensiteitsdrempel en Piekoverstroming aan om de segmentatie te optimaliseren.Wanneer de segmentatieresultaten zijn geoptimaliseerd, selecteert u Exporteer Regio's Masker en Exporteer om een binaire afbeelding van de watershed-resultaten te genereren. Open het opgeslagen gestandaardiseerde interessegebied. Selecteer in de Interessegebied Manager de identifier van het interessegebied om de functie-extractie te beperken tot het gestandaardiseerde interessegebied in het beeld.Met het interessegebied actief op het binaire watershed-masker, selecteert u Analyseren, Deeltjes Analyseren en Voeg toe aan Manager om de functies te extraheren om een deeltjesidentifier toe te voegen voor elke structuur die tijdens de segmentatie is afgebakend in de Interessegebied Manager. Sla vervolgens de toegevoegde deeltjes op, waarbij u ervoor zorgt dat de identifiers niet zijn geselecteerd en dat alle deeltjes in een zip-bestand worden opgeslagen. Open nu de voorverwerkte ruwe afbeelding en scrol naar het kanaal dat wordt gebruikt voor het vastleggen van de interessante structuren.Open de deeltjes die zijn verkregen uit de functie-extractie en selecteer Toon Alles in de Interessegebied Manager om een omtrek van elk deeltje op de afbeelding te leggen. Klik op Analyseren en Stel Metingen in en stel de juiste experimentele metingen in. Selecteer vervolgens in de Interessegebied Manager Meet en kopieer en plak de resultaten in een geschikt spreadsheetprogramma voor compilatie en verdere berekeningen.Kwantificering van het aantal semi-automatisch gesegmenteerde RFP huntingtine-aggregaten van gestandaardiseerde brandpunten door de optische lob van Drosophila onthult een diffuse expressie van de niet-pathogene Huntington Q15-expansie in de accumulatie van eiwitaggregaten door de ziekteveroorzakende Huntington Q138-expansie. Grootte- en intensiteitsprofielen van alle aggregaten van een gestandaardiseerde brandpunt van vijf verschillende optische lobben die Huntington Q138 tot expressie brengen, illustreren de robuustheid en reproduceerbaarheid van deze workflow. Wanneer aggregaten overbelicht zijn tijdens beeldacquisitie, is de kwantificering van de grootte en he

quantitative-cell-biology-neurodegeneration-drosophila-through

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De beperkende factor in het gebruik van de...

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

This video demonstrates imaging and quantification of protein aggregates in genetically modified Drosophila brains. Brains are fixed, washed, and treated with an antifading agent before mounting. Images are captured using a confocal microscope and quantified to observe the transmission of mutant protein aggregates.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em&gt; Drosophila</em

Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Vergaren van bewijs ondersteunt het idee dat de pathogene eiwit-aggregaten neurodegeneratieve ziekten verspreiden tussen cellen met prion-achtige eigenschappen gekoppeld. Hier beschrijven we een methode waarmee visualisatie van cel naar cel verspreiding van prion-achtige aggregaten in de model-organisme, Drosophila melanogaster.

Controle van cel naar cel transmissie van Prion-achtig eiwit-aggregaten in Drosophila Melanogaster

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Het doel van deze procedure is om het dorsale longitudinale spierweefsel (DLM) te ontleden om de structurele integriteit van DLM neuromusculaire knooppunten (NMJs) in neurodegeneratieve ziektemodellen te beoordelen met behulp van Drosophila melanogaster.

Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Leer een semi-geautomatiseerde workflow voor kwantitatieve analyse van fluorescerende eiwitten in Drosophila-modellen van neurodegeneratie. Deze methode minimaliseert selectiebias en maximaliseert reproduceerbaarheid.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Meer video's verkennen