Name: Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer een optische assay voor synaptische vesikelrecycling in gekweekte neuronen met overexpressie van presynaptische eiwitten. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van eiwitlokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Irmgard Weiss voor deskundige technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de DFG via het Cluster of excellence voor microscopie op het nanometer bereik en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB, B1-7, T.D.).

Geen studies met levende dieren werden uitgevoerd. Experimenten met dieren om te verkrijgen van cel culturen werden goedgekeurd door de autoriteiten van de plaatselijke dierenbescherming (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder de goedkeuring euthanized nummer T10/30. De experimenten werden uitgevoerd met de goedgekeurde protocollen.
1. primaire Hippocampal celkweek
<ol><li>Bereiden de gedissocieerde celcultuur van de rat hippocampus van embryonale dag 1916,17. Plaat van de cellen op 12 mm coverslips bekleed met polyethyleneimine (PEI) in 24-well gerechten bij een dichtheid van 50.000-60.000 cellen per putje. Controleer de dichtheid met behulp van een cel tellen kamer en fase contrast optiek.</li>
	<li>Cultuur de neuronen voor 3 dagen (dag in vitro (DIV) 3) in een 24-well plaat in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Beoordelen van de coverslips voor indicatoren van cell gezondheid met doorvallend licht microscopie (bijvoorbeeld fase contrast optiek bij een vergroting van 10-20 X). Controleer of de volgende indicatoren van een goede gezondheid: een duidelijke fase contrast halo, neurites zonder beaded structuren, en geen soma clustering of neurite bundelen.</li>
</ol>2. de Transfectie
Opmerking: Het volgende protocol verwijst naar een dubbele-transfectie voor 3 putten. Het protocol werkt echter best wanneer er voldoende voor 4 putten bedragen worden opgesteld.
<ol><li>Bereiden van 500 mL voor Transfectie buffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM nb2HPO4, 15 mM glucose, 42 mM HEPES) in een erlenmeyer.<ol>
<li>Los 8,0 g NaCl, KCl 0,37 g, 0.095 g nb2HPO4, 1,35 g van glucose, en 5.0 g HEPES in 400 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer.</li>
		<li>Breng de pH op 6,95 met 1 M NaOH met behulp van een pH-meter.</li>
		<li>Regel het volume met gedestilleerd water tot 500 mL en controleer de pH met behulp van een pH-meter.</li>
		<li>20-30 mL aliquots van transfectie buffer met de volgende pH-waarden maken door pipetting 1 M NaOH aan de transfectie buffer: 6,96 6.97 6,98, 6.99, 7,00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7,06, 7,07, 7,08, 7.09, 7.11. Opmerking: De pH van de buffer van de transfectie is cruciaal voor de doeltreffendheid van de transfectie.</li>
		<li>Om te testen welke transfectie buffer leidt tot het hoogste aantal transfected cellen, testen van elke waarde van de pH van 6,96 aan 7.11. Gebruik de methode van de transfectie beschreven in 2.2-2.11 en een gevalideerde plasmide GFP uitdrukken. Bepaal het aantal transfected cellen per dekglaasje aan voor elke transfectie buffer pH waarde om te beoordelen welke buffer het beste werkt.</li>
		<li>Aliquot de buffer met de hoogste efficiëntie van de transfectie in 2 mL microcentrifuge buizen bevriezen en opslaan van de buizen bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vooraf warme de verlaagde serum medium, cel kweekmedium en gedestilleerd water tot 37 ° C in het waterbad.</li>
	<li>De transfectie mix in een tube van 1,5 mL microcentrifuge voor te bereiden. Werken onder de motorkap van de laminaire flow om steriele arbeidsomstandigheden.<ol>
<li>Mix 7.5 µL van 2 M calciumchloride met 4 µg voor elke endotoxine-gratis DNA (Synaptophysin-mOrange en mGFP/GFP-Rogdi). Voeg water tot een totaal volume van 60 mL in de tube van een 1,5 mL microcentrifuge.</li>
		<li>Voeg 60 mL buffer van de Transfectie aan de mix. Voor de beste resultaten, voeg de transfectie buffer ontkleuring terwijl het schudden van de DNA-mix zachtjes op de vortex.</li>
		<li>Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten. Vermijd de incubatie buis schudden tijdens de incubatietijd door het plaatsen van de buis naast de laminaire flow kap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onder de motorkap van laminaire flow, verwijder het kweekmedium cel ("geconditioneerde medium") de putjes met behulp van een pipet 1000 mL en bewaar het in een aparte container in de incubator.</li>
	<li>Voeg 500 mL van verminderde serum medium toe aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot de 20 minuten incubatie periode (stap 2.3.3).</li>
	<li>Voeg 30 mL voor Transfectie mix aan elk putje door pipetteren enkele druppels. Gooi het residu aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Nadat alle de putjes zijn geleverd met transfectie mix, schud zachtjes de 24-well plaat zodat de verdeling van de transfectie mix in het medium.</li>
	<li>Incubeer de putjes gedurende 60 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van de transfectie mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en hen Incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer. Opmerking: De wassen stap is essentieel. Houd de tijd die elk goed geen medium minimaal heeft (dwz., verwijderen en vervangen van goed-door-well) en het medium wassen voorzichtig toe te voegen.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 450 mL van de geconditioneerde middellange goed-door-put.</li>
	<li>Laat de neuronen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 DIV 10 volwassen.</li>
</ol>3. stimulatie en Syt1 opname
Opmerking: Het volgende protocol geldt de opname 3 putjes. Voor de depolarisatie van een ander nummer van putten, de bedragen dienovereenkomstig aanpassen.
<ol><li>Bereiden 10 x depolarisatie buffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glucose, 200 mM HEPES, pH 7.4) in een conische kolf van 50 mL. Opmerking: Depolarisatie buffer kan worden bewaard bij 4 ° C voor enkele weken. Als een niet-depolarizing oplossing ook gebruikt wordt, bereiden een 10 x Tyrode de oplossing bestaande uit 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glucose, 200 mM HEPES pH 7.4 te vergelijken stimulatie-geïnduceerde recycling met spontane recycling. Na verdunning 1 x, voeg 1 µM van tetrodotoxine vóór gebruik te blokkeren actiepotentiaal generatie.<ol>
<li>Los 1.87 g NaCl, KCl, 0,1 g MgCl2-6 H20, 0.15 g CaCl2-2 H2O en 3,0 g glucose-1 H2O en 2,38 g. van HEPES in 50 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer 2.61 g. Breng de pH met NaOH en steriele-filter de oplossing. De buffer 1:10 verdunnen in gedestilleerd water tot een concentratie van 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden op 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS (pH 7.4) fixatie na stimulatie.<ol>
<li>Voor 500 mL 4% PFA in 1 x PBS, los 20 g paraformaldehyde in 450 mL gedestilleerd H2O. Opmerking: Verwarming van de oplossing kan versnellen oplost, maar doen niet Verwarm de oplossing meer dan 70 ° C, zoals de PFA kan desintegreren. Let op: PFA is teratogene, toxische en potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen bij het werken met PFA, werken onder de zuurkast en vermijden van inname.</li>
		<li>Laat de oplossing afkoelen aan RT en voeg 50 mL van de 10 x PBS stamoplossing. Breng de pH op 7.4 met NaOH/HCl met behulp van een pH-meter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vooraf warm 600 mL 1 x depolarisatie buffer en 10 mL cel kweekmedium tot 37 ° C in het waterbad.</li>
	<li>Voeg 1 mL muis anti-Syt1 antistof (kloon 604.2) naar de 1 x depolarisatie buffer en vortex gedurende 10 seconden.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van de cel cultuurmedium van de cellen. Voeg 200 mL van het mengsel van de depolarisatie-antilichaam elk goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 in de incubator.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van de depolarisatie-antilichaam-mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 300 mL 4% PFA in 1 x PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 x PBS. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
</ol>4. immunocytochemie
<ol><li>50 mL blokkeerbuffer voor te bereiden. Opmerking: Blokkeerbuffer kan worden bewaard bij-20 ° C voor enkele maanden.<ol>
<li>Los 2,5 g van sacharose en 1 g bovien serumalbumine (BSA) in 5 mL 10 x PBS stamoplossing. Voeg 1,5 mL 10% wasmiddel stamoplossing. Roer de oplossing totdat alle onderdelen goed hebben opgelost en gedestilleerd H2O toevoegen tot het bereiken van een eindvolume van 50 mL. Aliquot de oplossing en het bevriezen van de aliquots voor opslag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun het antilichaam van het secundaire, fluorophore-combinatie (gericht tegen de primaire Syt1-antilichaam-soorten) in 200 mL blokkeerbuffer in elk putje bij een verdunning van 1:1000.</li>
	<li>Verwijderen en verwijderen van de PBS 1 x van elk putje met een dekglaasje aan.</li>
	<li>Voeg 200 mL van het blokkeren van de buffer-antilichaam mix aan elk putje en incubeer gedurende 60 minuten op RT. Let op: Omdat de secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn, alle stappen vooruit moeten worden uitgevoerd in het donker.</li>
	<li>Na incubatie, door de cellen te wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 mL 1 x PBS.</li>
	<li>De coverslips op Microscoop dia insluiten met het insluiten medium.<ol>
<li>Voeg een 7 mL druppel medium op het microscoopglaasje te embedding. Verwijder het dekglaasje aan uit de 24-well plaat door tillen met een spuit en het grijpen met een tang. Let op: Cellen op het oppervlak van het dekglaasje aan zijn gemakkelijk beschadigd, waardoor deze pincet moeten met zorg worden behandeld.</li>
		<li>Dompel het dekglaasje aan in gedestilleerd water te verwijderen van de PBS en droog het zorgvuldig door het aanraken van een van de randen tot een zacht weefsel.</li>
		<li>Spiegelen het dekglaasje aan op de insluiten middellange druppel, zodat de uitvoering van de cellen van het microscoopglaasje zijde, waardoor de cellen te embedding in het insluiten medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de dia's te drogen onder de motorkap voor 1-2 h (dek ze Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
</ol>5. de microscopische analyse
<ol><li>Nadat de coverslips droog is, plaats ze onder de microscoop met de doelstelling en de camera.</li>
	<li>De belichtingstijd voor elk kanaal zodanig aanpassen dat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden. Opmerking: Hoewel de belichtingstijd tussen de kanalen variëren kan, moet het constant voor één kanaal om vergelijkbaarheid tussen de coverslips.</li>
	<li>Verwerven van meerkanaals beelden voor 10 regio's van belang (ROIs) per dekglaasje aan. Controleer de ROI bevat axonale processen van een transfected neuron door het controleren van GFP-fluorescentie, die moet worden punctate.</li>
</ol>6. statistische analyse
<ol><li>De beelden als .tif-bestanden exporteren. Laden van de beelden in OpenView18 door te klikken op bestand | Load image-bestand.</li>
	<li>Kies de afbeelding van de Synaptophysin-mOrange als kanaal 1, het beeld van de Rogdi-GFP/mGFP zoals 2-kanaals en het beeld van de fluorescentie Alexa647 als kanaal 3.</li>
	<li>Drempel de ROIs.<ol>
<li>Klik op analyse | Plaats gebied over puncta. Kies waarden voor drempel en Delta intensiteit zodat bij visuele inspectie, diffuse fluorescentie is uitgesloten, waardoor alleen punctate signalen naar het beeld van kanaal 1 (vertegenwoordigt Synaptophysin-mOrange fluorescentie). Houd de dezelfde drempel voor alle afbeeldingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deze ROIs naar de bijbehorende zender 2 (GFP-Rogdi/mGFP fluorescentie) en 3 (Syt1-fluorescentie) van elk gebied dekglaasje aan overbrengen door te klikken op nu uitvoeren. Opmerking: De ROIs moeten alleen worden overwogen indien de cel dubbel-transfected. Bij deze methode moet mOrange - en GFP-fluorescentie duidelijk zichtbaar zijn.</li>
	<li>Sla de gegevens in de analyse log-editor door te klikken op logboekgegevens.</li>
	<li>Open de editor log analyse op het tabblad Windows en kopieert u de waarden voor elk kanaal. De waarden voor de afzonderlijke kanalen in een werkblad plakken.</li>
	<li>Het bepalen van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het Syt1-kanaal op de ROI in beide transfectie voorwaarden (GFP-Rogdi en mGFP).</li>
	<li>Toepassing van passende statistische proeven zoals de Student t-test om te bepalen van verschillen.</li>
</ol>

<ol><li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I%2C+a+Ca2%2B+sensor+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Perin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Conservation+of+Synaptotagmin+%28p65%29+in+Drosophila+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).</li>
<li>Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytotic+Recycling+of+Synaptic+Vesicles+in+Developing+Processes+of+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).</li>
<li>Ko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-1+performs+neurexin-dependent+and+neurexin-independent+functions+in+synapse+validation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation.</a> The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).</li>
<li>Shinoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+enhances+spontaneous+and+activity-dependent+neurotransmitter+release+at+excitatory+terminals+but+not+at+inhibitory+terminals+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).</li>
<li>Ivanova, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25652077">Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo.</a> The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).</li>
<li>Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+impairment+of+spontaneous+neurotransmission+modulates+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome+associated+gene+Rogdi+encodes+a+novel+presynaptic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rogdi+Defines+GABAergic+Control+of+a+Wake-promoting+Dopaminergic+Pathway+to+Sustain+Sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila.</a> Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).</li>
<li>Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic+encephalopathy+and+amelogenesis+imperfecta%3A+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Euopean+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome.</a> Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).</li>
<li>Kraszewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Dynamics+in+Living+Cultured+Hippocampal+Neurons+Visualized+with+CY3-Conjugated+Antibodies+Directed+against+the+Lumenal+Domain+of+Synaptotagmin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin.</a> Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/02/08/262246">Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> bioRxiv. , 262246(2018).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Dresbach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regions+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+Bassoon%3A+Significance+for+synaptic+targeting+and+cytomatrix+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+Prenatal+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).</li>
<li>Tsuriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sharing+as+a+predominant+determinant+of+synaptic+matrix+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics.</a> PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).</li>
<li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Synaptic+Vesicle+Recycling+Using+FM+Dyes+During+Evoked%2C+Spontaneous%2C+and+Miniature+Synaptic+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).</li>
<li>Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Synaptic+Vesicle+Endocytosis+in+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24369372">Visualizing presynaptic function.</a> Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).</li>
<li>Opazo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+Intermixing+of+Synaptic+Vesicle+Components+upon+Vesicle+Recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling.</a> Traffic. 11, 800-812 (2010).</li>
<li>Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).</li>
<li>Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21145004">Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix.</a> Neuron. 68, 907-920 (2010).</li>
<li>Wittenmayer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Neuroligin1+regulates+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li>
<li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li>
<li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li>
<li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li>
<li>Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li>
<li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li>
<li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li>
<li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li>
<li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li>
<li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/03/172239">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn drie testen routinematig gebruikt bij het bestuderen van synaptic Vesikel (SV) recycling. De eerste twee omvatten het gebruik van een) fluorescerende styryl kleurstoffen zoals FM1-43 (die nemen in membranen, bij endocytose in organellen omhoog worden genomen en worden uitgebracht na exocytose); en b) fluorescently gelabeld recombinante eiwitten van SV (die op overexpressie, integreren in de eiwithoudende recycling machines). Als de bijgevoegde fluorophores hun fluorescentie afhankelijk van de pH wijzigen, kunnen ...

Bestuderen van synaptic vesikel recycling is belangrijk bij het bepalen hoe presynaptische eigenschappen, tijdens de Synaptische plasticiteit of in reactie op verstoring van synaptische functie wijzigen. Synaptotagmin-1 (Syt1) bestuderen biedt antilichaam opname een methode voor het meten van de hoeveelheid SV recycling. Syt1 is een SV-geassocieerde proteïne dat fungeert als een Ca2 + sensor en is noodzakelijk voor de exocytotic release van de neurotransmitter1,2. Het is een transmembraan eiwit met een C-terminal cytoplasmatische domein buiten de SV en een N-terminal luminal domein binnen de SV-3. Tijdens exocytose, wordt het luminal domein van Syt1 blootgesteld aan het externe medium. We toevoegen naar deze externe medium, antilichamen gericht tegen de cytoplasmatische domein, waardoor het geëigd tijdens endocytose maken wordt. Deze antilichamen kunnen dat hetzij vooraf geconjugeerd met fluorophores of immunostained met secundaire antilichamen4,,5,,6,7. De intensiteit van de fluorescentie van de resulterende immunosignal is evenredig aan het bedrag van SV recycling. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen zowel de constitutieve en de depolarisatie-geïnduceerde SV recycling6,8.
Syt1 opname testen kunnen worden uitgevoerd na virus-gemedieerde genoverdracht op vrijwel alle cellen in de schotel of na sparse transfectie van een klein aantal cellen. Onze methode combineert de bepaling met sparse dubbele transfectie van primaire hippocampal neuronen met calciumfosfaat9. We gebruiken een recombinant marker eiwit bekend te accumuleren op presynapses, fluorescently tagged Synaptophysin, zoek presynaptische terminals en overexpress onze proteïne van belang, Rogdi. Daardoor kunnen we om te testen of Rogdi doelstellingen functionele synapses en treft SV recycling. Het gen Rogdi codering was het oorspronkelijk geïdentificeerd in een scherm voor Drosophila mutanten gekenmerkt door verminderde geheugen10. Mutaties in het Rogdi-gen veroorzaken bij de mens, een zeldzame en verwoestende ziekte heet het syndroom van Kohlschütter-Tönz. Patiënten lijden aan tandheelkundige glazuur misvormingen, pharmacoresistant epilepsie en psychomotorische vertraging; de subcellular localisatie van het gen product bleef echter ongrijpbare11. Aldus, is de bepaling van de opname Syt1 vastgestelde belangrijkste bewijs voor de lokalisatie van GFP-gelabeld Rogdi bij functionele synapsen9.
Deze opname-techniek heeft meerdere voordelen. Eerst, SV recycling waarneembaar zowel in real-time als door het uitvoeren van levende imaging7,12, en na fixatie6,9 door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van het label van de fluorescentie Syt1. Bovendien hebben verschillende varianten van Syt1 antilichamen ontwikkeld. Er zijn niet-gelabelde varianten die kunnen gelabeld zijn met een secundair antilichaam dat een standaard immunokleuring protocol na fixatie, en vooraf geconjugeerd varianten met een reeds bevestigd etiket van fluorescentie. Tenslotte is de fluorescentie antilichamen gebaseerde voordelige als gevolg van de grote selectie van verkrijgbare secundaire of geconjugeerd kleurstoffen die kunnen worden gebruikt.
Wanneer vaststelling en immunokleuring de neuronen, het is ook mogelijk om de vlek voor extra eiwitten en colocalization analyses uit te voeren. Dit kan helpen bepalen waar zij zich bevinden met betrekking tot recycling SVs. De intensiteit van de fluorescentie-label is de directe maat voor de hoeveelheid SV recycling. Bovendien, label de antilichamen selectief Syt1-bevattende structuren, wat resulteert in hoge specificiteit en weinig achtergrond fluorescentie4. Stimulatie van de verschillende protocollen kunnen ook worden gebruikt, zoals de depolarisatie buffers of elektrische stimulatie protocollen9,12,13,14. Basale SV recycling kan echter worden gemeten zonder het stimuleren van de neuronale culturen15.
Onze werkwijze richt zich specifiek Syt1 antilichaam opname in neuronen met secundair antilichaam immunolabeling dubbel-transfected na fixatie. Echter, verwijzen we naar alle routinematig gebruikte varianten van de bepaling in onze discussie kijkers de gelegenheid te geven zich aan te passen van het protocol aan specifieke behoeften.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>donkey anti mouse Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>buis (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Gratis software, zie opmerkingen</td><td></td><td>geschreven door Noam E. Ziv, Technion &ndash; Israel Institute of Technology, Haifa, Israël</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>safety hood</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Serienummer 40649111</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311</td><td>muis monoklonaal; klon 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een optische assay voor synaptic vesikel recycling in gekweekte neuronen overexpressing presynaptische eiwitten

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Bij actieve presynaptische zenuw terminals ondergaan synaptische vesikels cycli van exo- en endocytose. Tijdens de recycling, worden de luminal domeinen van SV transmembraan eiwitten op het celoppervlak blootgesteld. Een van deze proteïnen is Synaptotagmin-1 (Syt1). Een antilichaam gericht tegen het luminal domein van Syt1, eenmaal is toegevoegd aan het kweekmedium, wordt tijdens de exo-endocytotic cyclus in beslag genomen. Deze opname is evenredig aan het bedrag van SV recycling en kan worden gekwantificeerd door immunofluorescentie. Hier combineren we Syt1 antilichaam opname met dubbele transfectie van gekweekte hippocampal neuronen. Hierdoor is ons (1) lokaliseren presynaptische sites die zijn gebaseerd op expressie van recombinante presynaptische markering Synaptophysin, (2) het bepalen van hun functionaliteit met behulp van Syt1 opname en (3) karakteriseren de doelgerichtheid en de gevolgen van een proteïne van belang, GFP-Rogdi.

Een verwacht resultaat van deze aanpak is het lokaliseren van ongeveer 50 double-transfected neuronen per dekglaasje aan bij een dichtheid van 50.000 neuronen per putje. De axon van elk neuron wordt verwacht om te laten zien van meerdere hotspots van fluorescently-tagged Synaptophysin accumulatie, clusters ofSVs aangeeft. Op functionele presynaptische sites colocalizes de recombinante Synaptophysin signaal met punctate Syt1 fluorescentie. Het gebruik van dubbele transfectie, is GFP-Rogdi ...

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Het grootste voordeel van deze techniek is dat het zeer eenvoudig is, alleen standaardapparatuur vereist en profiteert van het primaire voordeel van antilichamen, namelijk hun specificiteit. Het protocol werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Michela Matteoli en collega's en is zeer effectief gebleken. Ik heb het gebruikt om te testen of een bepaald eiwit cordocti gelokaliseerd is in actieve synapsen.Begin deze procedure door primaire hippocampale cellen drie dagen lang op coverslips in een 24-wells plaat te kweken, zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwarm het verminderde serummedium, celkweekmedium en gedistilleerd water voor tot 37 graden Celsius in het waterbad. Werk onder de laminaire flowkap om steriele werkomstandigheden te garanderen, bereid de transfectiemix voor in een 1,5-milliliter microcentrifugebuisje.Meng eerst 7,5 microliter twee-molar calciumchloride met vier microgram van elk endotoxinevrij DNA. Voeg water toe om een totaal volume van 60 microliter te bereiken in een 1,5-milliliter microcentrifugebuisje. Voeg nu 60 microliter transfectiebuffer toe aan de mix.Voor de beste resultaten, voeg de transfectiebuffer druppelsgewijs toe terwijl u het DNA-mengsel voorzichtig schudt op de vortex. Incubeer de resulterende transfectiemix gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vermijd het schudden van de buis tijdens de incubatietijd.Onder de laminaire flowkap, verwijder het celkweekmedium uit de wells met behulp van een 1000-microliter pipette, bewaar het in een aparte container en voeg onmiddellijk 500 microliter verminderd serummedium toe aan elke well. Bewaar het geconditioneerde medium in de incubator. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 totdat de 20-minuten incubatieperiode voor de transfectiemix voorbij is.Voeg vervolgens 30 microliter transfectiemix toe aan elke well door verschillende druppels te pipetteren. Gooi de residu op de bodem van de buis weg. Nadat alle wells zijn voorzien van transfectiemix, schud de 24-wells plaat voorzichtig om de verdeling van de transfectiemix in het medium te garanderen.Incubeer nu de wells gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Verwijder en gooi de transfectiemix weg en was de cellen drie keer met celkweekmedium. De wasstap is cruciaal.Minimaliseer de tijd dat elke well geen medium heeft door deze wel per wel te verwijderen en te vervangen. Zorg er ook voor dat u het medium voorzichtig toevoegt. Om de cellen te wassen, voegt u één milliliter celkweekmedium toe aan elke well en incubeer ze gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens 750 microliter medium en voeg dezelfde hoeveelheid vers medium toe. Na dit proces drie keer te hebben herhaald, verwijder en gooi het celkweekmedium weg en voeg 450 microliter van het geconditioneerde medium wel per wel toe. Laat de neuronen nu rijpen in de incubator bij 37 graden Celsius en 5%CO2 tot DIV 10.Verwarm 600 microliter 1X depolarisatiebuffer en 10 milliliter celkweekmedium voor tot 37 graden Celsius in het waterbad. Voeg één microliter muis Anti-Syt1 antilichaam toe aan de 1X depolarisatiebuffer en schud gedurende 10 seconden. Nadat u het celkweekmedium uit de cellen hebt verwijderd en weggegooid, voegt u 200 microliter van de depolarisatie antilichaammix toe aan elke well.Incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5%CO2 in de incubator. Verwijder en gooi de depolarisatie antilichaammix weg en was de cellen drie keer met celkweekmedium. Voeg één milliliter celkweekmedium toe aan elke well en incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens 750 microliter medium en voeg dezelfde hoeveelheid vers medium toe. Herhaal dit proces drie keer. Verwijder en gooi vervolgens het celkweekmedium weg en voeg 300 microliter 4%PFA in 1X PBS toe.Eindelijk, incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius voordat u drie keer gedurende vijf minuten wast met 1X PBS. Verdun het secundaire fluorofoor-gekoppelde antilichaam in 200 microliter blokkerende buffer voor elke well bij een verdunning van één tot 1000. Verwijder en gooi het 1X PBS uit elke well die coverslips met de gekweekte neuronen bevat.Voeg 200 microliter blokkerende buffer antilichaammix toe aan elke well en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie, was de cellen drie keer gedurende vijf minuten met één milliliter 1X PBS. Voeg vervolgens een zeven-microliter druppel inbeddingsmedium toe op de microscoopslide.Verwijder de coverslip van de 24-wells plaat door deze op te tillen met een canula en deze met een pincet vast te grijpen. Dompel de coverslip in gedistilleerd water om de PBS te verwijderen en droog het voorzichtig door één rand aan een zachte tissue te raken. Draai de coverslip om op de druppel inbeddingsmedium zodat de oppervlakte met de cellen naar de microscoopslide gericht is, waardoor de cellen in het inbeddingsmedium worden ingebed.Laat de slides onder de kap gedurende één tot twee uur drogen, bedek ze om lichtblootstelling te voorkomen. Bewaar de droge slides in een microscoopslidebox bij vier graden Celsius. Na immunolabeling van het Syt1 antilichaam met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam, wordt de mate van Syt1 opname uiteindelijk gekwantificeerd met behulp van het immunosignaal.Punctate immunofluorescentie geeft locaties van Syt1 opname in het gezichtsveld aan. Deze locaties bevatten dus synaptische vesikel die tijdens het experiment werden gerecycled. Synaptophysin-mOrange fluorescentie geeft accumulaties van synaptische vesikel in de axon van een getransfecteerde neuron aan.GFP-Rogdi fluorescentie geeft accumulaties van Rogdi in de axon van de getransfecteerde neuron aan. Dit deel van het experiment onthult een uitgebreide colocaliserende van GFP-Rogdi en Synaptophysin-mOrange, wat suggereert dat GFP-Rogdi zich accumuleert op presynaptische sites binnen de axon. De overlay on

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

This video demonstrates the procedure for preparing cultured neurons for optical analysis of recycled synaptic vesicles. The process involves fluorescence tagging of synaptic vesicle proteins and immunostaining to label and visualize the recycled vesicles within the neurons.

Preparing Cultured Neurons for Optical Analysis of Recycled Synaptic Vesicles

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Presynapse vorming is een dynamisch proces, met inbegrip van accumulatie van synaptische eiwitten in de juiste volgorde. Bij deze methode wordt presynapse vorming geactiveerd door kralen geconjugeerd met een presynapse Organizer eiwit op axonale vellen van "neuron Ball" cultuur, zodat accumulatie van synaptische eiwitten gemakkelijk kan worden geanalyseerd tijdens presynapse vorming.

Presynapse vorming assay met Presynapse Organizer kralen en "neuron Ball" cultuur

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Leer een optische assay voor synaptische vesikelrecycling in gekweekte neuronen met overexpressie van presynaptische eiwitten. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van eiwitlokalisatie mogelijk.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Meer video's verkennen