Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties

Deze methode beschrijft algemene stappen voor het kweken van bladluizen en stappen voor de genetische analyse van bladluizen. Deze methoden kunnen worden toegepast om belangrijke vragen te beantwoorden over de evolutie en ecologie van bladluizen en de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de biologie van bladluizen. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze in het algemeen kan worden toegepast op de meeste bladluissoorten en met relatief lage kosten kan worden uitgevoerd.

Begin met het vullen van een standaard zaailingenbak met kiemingsmix-grond, zorg ervoor dat de grond de bovenkant van de kuiltjes bereikt. Wanneer alle kuiltjes zijn gevuld, maak in de grond van elk kuiltje een kuil van drie centimeter diep en plaats één zaadje in elk gat. Geef de cellen water totdat de grond die de zaden bedekt verzadigd is en plaats de bak in een kas met dagelijks tot elke dag water geven, om een matige bodemvocht te behouden.

Wanneer de zaailingen hun eerste volledige set bladeren hebben laten groeien, vul dan vier centimeter ronde potten met potgrond, tot ongeveer vijf centimeter onder hun randen. Maak een gat in de grond diep genoeg om de bodem van de pot te bereiken en schep de volwassen zaailingen voorzichtig met de hand om ze diep in de gaten in de nieuwe potten te plaatsen. Bedek vervolgens de zaailingen met grond en geef de zaailingen dagelijks tot elke dag water om een matige bodemvocht te behouden.

Wanneer de planten ten minste drie tot vier sets volledige bladeren hebben laten groeien en minstens tien centimeter lang zijn, inspecteer de planten dan handmatig op ongewenste plagen en gebruik een mondpijp om voorzichtig een enkele reproducerende bladluis die in het veld is verzameld over te brengen naar het blad van de eerste plant om een iso-klonale lijn te creëren. Wanneer alle bladluizen zijn overgebracht, bedek de planten stevig met een op maat gemaakte bekerkooi en plaats de met bladluizen besmette planten in een gecontroleerde omgevingskamer. Om de stampopulaties te behouden, gebruik een mondpijp om een ​​tot drie tweede of derde instar nimfen en één volwassen aphid, wekelijks veilig over te brengen naar een nieuwe plant.

En bedek elke plant met een nieuwe bekerkooi voor cultuur zoals gedemonstreerd. Voor DNA-extractie van een enkele volwassen bladluis, plaats de bladluis dicht bij de bodem van een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met vloeibare stikstof en maal de bladluis met een stamper. Voeg vervolgens 100 microliters lysisbuffer toe aan de microcentrifugebuis en maal de geplette bladluis verder tot het monster zichtbaar is ontbonden.

Was de stamper met nog eens 100 microliters lysisbuffer en incubeer de gemalen bladluis gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie 14 microliters aemulor kaliumacetaat toe aan de buis en draai om te mengen. Na 30 minuten op ijs verzamel het cellulaire puin door centrifugatie en breng het supernatant over in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis zonder het pellet te verstoren.

Voeg 200 microliters koude 100 procent moleculair gegradueerde ethanol toe aan het supernatant en draai de buis om te mengen. Na 15 minuten bij kamertemperatuur verzamel het geprecipiteerde DNA door centrifugatie en verwijder de ethanol met een pipet. Resuspendeer het pellet in 200 microliters koude 70 procent moleculaire gegradueerde ethanol met schudden voor een tweede centrifugewasbeurt.

En resuspendeer het pellet in 200 microliters verse, koude 100 procent moleculaire gegradueerde ethanol. Na de derde centrifugatie, plaats de buis horizontaal op een stuk tissuepapier voor het vijf tot tien minuten luchtdrogen. En resuspendeer het DNA-pellet in 80 microliters lage tris edta.

Kwantificeer vervolgens het resuspendeerde DNA in een spectrofotometer en bewaar het resterende monster bij vier graden Celsius. Nadat je tot vijf volwassen bladluizen in vloeibare stikstof hebt verpletterd zoals gedemonstreerd, breng de monster over naar een afzuiging en voeg 800 microliters guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie reagens toe aan de monsterbuis. Homogeniseer het monster met een stamper en incubeer het homogenaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 160 microliters chloroform toe aan het monster, gevolgd door 15 seconden krachtig schudden met de hand. Incubeer vervolgens het monster gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer om het geëxtraheerde RNA te verzamelen. Om het RNA te precipiteren, breng de waterige fase over in een nieuwe RNS-vrije microcentrifugebuis zonder de tussenliggende fase te verstoren en voeg 400 microliters isopropanol toe aan het RNA.

Na een incubatie van tien minuten bij min 20 graden Celsius, verzamel het geprecipiteerde RNA door centrifugatie. Was vervolgens het monster twee keer met één milliliter 75 procent ethanol in di-ethylpyrocarbonaat behandeld water, het monster met langzaam vortexen en centrifugeren om eventuele fenolverontreinigingen te verwijderen. Na de tweede wassing, laat het pellet vijf tot tien minuten op een steriele werkbank drogen en los het RNA-pellet op in 30 microliters ultra zuiver water met voorzichtig pipetten voor een incubatie van tien tot vijftien minuten bij 55 tot 60 graden Celsius.

Zaden duren ongeveer twee tot vier weken, afhankelijk van het seizoen, om groot genoeg te worden om opnieuw te worden gepot. Gepotte zaailingen duren nog eens twee tot vier weken om te groeien tot een optimale grootte voor bladluiscultuur. Volwassen aye-near-ee-eye worden onderscheiden door een verdonkerde cauda en kunnen ongevleugeld of gevleugeld zijn.

Ontwikkelende vleugelkussens worden zichtbaar wanneer nimfen de derde instar bereiken. Een enkele volwassen aye-near-ee-eye zal ongeveer 100 tot 200 nanogram per microliter DNA en 150 tot 300 nanogram per microliter RNA opleveren. De relatieve expressie van een kandidaat-gen onder verschillende behandelingscondities kan vervolgens worden berekend.

Wanneer u deze