Name: Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer de drop-off ddPCR-methode voor detectie van meerdere mutaties in ctDNA uit vloeibare biopsie. Deze techniek bespaart waardevol patiëntmateriaal en biedt absolute kwantificering van tumor-DNA voor kankerdiagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). De auteurs bedank ook Caroline Hego voor haar bijdrage aan de video.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Verschillende auteurs zijn uitvinders van twee octrooiaanvragen (EP17305920.5, EP18305277.8) aan ctDNA detectie gerelateerde genoemd.

Voor het ontwerpen van een efficiënte drop-off ddPCR assay, optimalisatie is cruciaal, en het protocol moet zorgvuldig worden gevolgd. Elke combinatie van primers en sondes heeft een unieke PCR reactie efficiëntie. Een afzonderlijke bepaling moet dus zorgvuldig worden gevalideerd op controlemonsters alvorens te worden gebruikt op waardevolle proefmonsters. Optimalisatie en validatie zijn belangrijk voor het certificeren van piek signaal detectie en beoordelen van de gevoeligheid en specificiteit. Zoals beschreven in het ...

Duizenden van somatische mutaties die betrekking hebben op kankerontwikkeling zijn gerapporteerde1. Daaronder een paar zijn voorspellende markers van de werkzaamheid van gerichte therapie 2,3 en genetische screening van deze mutaties is nu gangbare klinische praktijk. Droplet-technologie voor digitale PCR (ddPCR) kan worden gebruikt om te controleren op de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties met weetje speurder nauwkeurigheid en is zeer compatibel met niet-invasieve vloeibare biopsieën4,5. Huidige ddPCR testen zijn echter voornamelijk ontworpen om mutaties bekend een prioridetecteren. Dit beperkt ernstig het gebruik van ddPCR als een ontdekkingshulpmiddel wanneer de mutatie onbekend is. Inderdaad, in het ontwerp van de conventionele ddPCR, een sonde van de hydrolyse herkennen van het wild-type allel (WT sonde) concurreert met een specifieke sonde herkennen de mutant allel (MUT sonde) (figuur 1A). De sonde met hogere affiniteit aan de sjabloon hybridizes en haar fluorophore, met vermelding van de aard van de overeenkomstige allel releases. De gegevens van de fluorescentie verkregen voor elke druppel kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot vertegenwoordigen de fluorescentie die wordt uitgestoten door de WT en MUT sondes in verschillende dimensies. In figuur 1Ais een schematische weergave van een typisch resultaat voor een conventionele ddPCR assay gepresenteerd. In dit voorbeeld, de blauwe wolk komt overeen met de druppels met WT allelen geïdentificeerd door de WT sonde, overwegende dat de rode wolk correspondeert met druppels waarin de MUT-allel is versterkt en geïdentificeerd door de MUT-sonde. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie, dubbele positieve druppels met zowel WT en MUT waarbij kunnen worden weergegeven (groene wolk). De licht grijze wolk komt overeen met lege druppels.
Aangezien de meeste platformen toestaan voor de detectie van een beperkt aantal fluorophores (meestal 2, maar maximaal 5), is doorvoer van conventionele ddPCR beperkt. Targeting van regio's met meerdere aangrenzende mutaties vereist daarom ontwerp van technisch uitdagende multiplex ddPCR testen of het gebruik van meerdere reacties gericht op elke mutatie in parallel. De drop-off ddPCR strategie, overwint deze beperking zoals het potentieel kan detecteren elke genetische wijziging binnen de regio van een doel met behulp van een uniek paar WT hydrolyse sondes. De eerste sonde (sonde 1) omvat die een reeks van de niet-variabele, grenzend aan de target-regio en de tweede sonde (sonde 2) is een aanvulling op de WT-volgorde van de doel-regio waar de mutaties zijn verwacht (figuur 1B). Terwijl de eerste sonde de totale hoeveelheid amplifiable moleculen in de reactie kwantificeert, discrimineert de tweede sonde WT en MUT allelen door suboptimale hybridisatie aan mutant sequenties. Sonde 2 herkent meerdere soorten mutaties in de regio (enkelvoudige of meervoudige nucleotide vervangingen, verwijdering, enz.) van doelstelling6. Zoals in conventionele ddPCR correspondeert de licht grijze wolk druppels met geen DNA-moleculen. Het is belangrijk eraan te herinneren dat in dit type van test, optimale scheiding van WT en MUT wolken afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie is, omdat druppels met zowel WT en MUT doel allelen niet kunnen worden onderscheiden van druppels met alleen de WT formulier. Deze test vereist daarom bevatten de meeste druppels niet meer dan één exemplaar van de gerichte gen.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA tube (color code : lavendel)</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA-buisjes worden gebruikt om een hele bloed- of EDTA-plasma-monster te verkrijgen</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manuele protocol)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Voor het isoleren van vrij circulerend DNA uit menselijk plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (geautomatiseerd protocol)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Voor het isoleren van vrij circulerend DNA uit menselijk plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP systeem</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>volledig geïntegreerd en geautomatiseerd systeem voor cfDNA-, DNA- of RNA-zuivering</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Voor zuivering van maximaal 24 cfDNA's tegelijkertijd</td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>De Qubit-fluorometer is een tafelmodel-fluorometer voor de kwantificering van DNA</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 lezer</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 of 186-4003, respectievelijk</td><td>De lezer meet de fluorescentie-intensiteit van elke druppel en detecteert de grootte en vorm terwijl de druppels de detector passeren</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 druppelgenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 of 186-4002, respectievelijk</td><td>Apparaat gebruikt voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>C1000 thermische cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Modulaire thermische cycler-platform, inclusief C1000 Touch thermische cycler-chassis, 96-well fast reactiemodule</td></tr><tr><td>Plate sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; PCR plate sealer</td></tr><tr><td>DG8 cartridge holder</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Positioneert en houdt de DG8 cartridge in het instrument voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>Druppelgenerator cartridges en gaskets</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Microfluïdische DG8 cartridge gebruikt om monster en olie te mengen om druppels te genereren; DG8 gaskets sluiten de cartridge af om verdamping te voorkomen en brengen de vereiste druk toe voor druppelvorming</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix voor sondes (geen dUTP)</td></tr><tr><td>96-well PCR platen</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96-well semi-skirted platen</td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Doornaaibare folie hittesluiting</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Olie</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>olie gebruikt in de lees</td></tr><tr><td>Druppelgeneratie Olie voor Sondes</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>olie voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Tubes maximaliseren de monsterrecuperatie door de monster-oppervlakte binding aanzienlijk te verminderen</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Referentie Standaard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>De Multiplex I cfDNA Referentie Standaards zijn hoog gekarakteriseerd, biologisch-relevante referentiematerialen die worden gebruikt om de prestaties van cfDNA-assays te beoordelen die somatische mutaties detecteren</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>De HS assay is zeer selectief voor dubbelstrengs DNA (dsDNA) boven RNA en is ontworpen om nauwkeurig te zijn voor initiële monsterconcentraties van 10 pg/µL tot 100 ng/µL</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes zijn 500 µL dunne-wandige polypropyleen tubes voor gebruik met de Qubit Fluorometer</td></tr></tbody></table>

Één druppel digitale polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in hotspot regio 's

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Druppel digitale polymerase-kettingreactie (ddPCR) is een zeer gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) methode gebaseerd op monster fractionering in duizenden nano-sized water-in-olie individuele reacties. Onlangs, ddPCR is uitgegroeid tot een van de meest nauwkeurige en gevoelige instrumenten voor circulerende tumor (ctDNA) DNA detectie. Een van de belangrijkste beperkingen van de standaard ddPCR-techniek is het beperkte aantal mutaties die kan worden gescreend per reactie, zoals specifieke hydrolyse sondes herkennen van elke mogelijke allèlique versie nodig zijn. Een alternatieve methode, de drop-off ddPCR, verhoogt de doorvoer, omdat het vereist slechts een paar van sondes voor het detecteren en kwantificeren van potentieel alle genetische veranderingen in het gerichte gebied. Drop-off ddPCR toont vergelijkbare gevoeligheid aan conventionele ddPCR testen met het voordeel van het opsporen van een groter aantal mutaties in een enkele reactie. Het is rendabel, conserveert kostbare monstermateriaal, en kan ook worden gebruikt als een ontdekkingshulpmiddel mutaties zijn niet bekend een priori.

KRAS exon 2 mutaties (codonen 12 en 13) en EGFR exon 19 verwijderingen in een bewijs-van-concept studie, werden in FFPE weefsels en plasma monsters van kankerpatiënten met behulp van de drop-off ddPCR strategie6onderzocht.
De KRAS drop-off sonde ondervraagd een 16 bp regio omvat meerdere mutaties in exon 2 van de KRAS -gen, die meer dan 95% van de bekende KRAS ...

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Deze methode kan worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor kanker om de circulerende tumor DNA te analyseren. Deze techniek ondervraagt meerdere genetische veranderingen in gebieden van clustermutaties in een enkele reactie. Dit helpt om kostbare patiëntmonsters te besparen.Deze methode kan inzicht geven in de tumorbelasting op het mutatieprofiel. Het kan nu ook worden toegepast op een moleculaire analyse als alternatief voor qPCR om een absolute kwantificering van nucleïnezuur doelsequenties te verkrijgen. Verzamel bloedmonsters in zeven-milliliter EDTA buizen.Twee buizen worden aanbevolen om ongeveer vier milliliter plasma te verzamelen. Centrifuge de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 820 keer zwaartekracht binnen drie uur na de bloedafname om rode bloedcellen, witte bloedcellen en plasma te scheiden. De tijd tussen de bemonstering en de centrifugatie is van cruciaal belang om hoogwaardig, T-celvrij DNA te verkrijgen dat niet besmet is met DNA dat vrijkomt uit witte bloedcellen.Gebruik na centrifugatie een serologische pipet om de supernatant te verzamelen zonder de witte bloedcellaag aan te raken. Ongeveer twee milliliter plasma worden meestal teruggewonnen per E

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

In this video, we demonstrate the duplex digital PCR (ddPCR) technique — a modification of the traditional PCR technique that is useful in detecting two different genetic markers simultaneously. A single PCR reaction is partitioned into nanoliter-sized emulsified droplets that are independently amplified, and the detection of differently colored fluorescence amplification signals from the fraction of droplets is used to compute the initial concentration of the target sequences.

Duplex Digital PCR for Simultaneous Quantification of Dual Genetic Markers

In this video, we describe a high-resolution melting PCR technique to determine the length polymorphism of DNA fragments of varying sequence lengths, based on melting temperature analysis.

High-Resolution Melting PCR to Determine Sequence Variations in Mutant DNA Sequences

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Hier presenteren we een protocol om de isolatie van zeldzame kankercellen uit een geconstrueerd monster met volbloed en spiked in longkankercellen te illustreren. Het protocol maakt gebruik van een semi-geautomatiseerd, labelvrij celisolatieplatform. Verrijkte cellen worden vervolgens geanalyseerd op mutaties in de epidermale groeifactorreceptor met behulp van druppeldigitale PCR.

Profilering van epidermale groeifactor-DNA-mutaties in circulerende zeldzame cellen met behulp van een celisolatiesysteem en druppeldigitale PCR

Leer de drop-off ddPCR-methode voor detectie van meerdere mutaties in ctDNA uit vloeibare biopsie. Deze techniek bespaart waardevol patiëntmateriaal en biedt absolute kwantificering van tumor-DNA voor kankerdiagnostiek.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Meer video's verkennen