Name: Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer de drop-off ddPCR-methode voor detectie van meerdere mutaties in ctDNA uit vloeibare biopsie. Deze techniek bespaart waardevol patiëntmateriaal en biedt absolute kwantificering van tumor-DNA voor kankerdiagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). De auteurs bedank ook Caroline Hego voor haar bijdrage aan de video.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Verschillende auteurs zijn uitvinders van twee octrooiaanvragen (EP17305920.5, EP18305277.8) aan ctDNA detectie gerelateerde genoemd.

Voor het ontwerpen van een efficiënte drop-off ddPCR assay, optimalisatie is cruciaal, en het protocol moet zorgvuldig worden gevolgd. Elke combinatie van primers en sondes heeft een unieke PCR reactie efficiëntie. Een afzonderlijke bepaling moet dus zorgvuldig worden gevalideerd op controlemonsters alvorens te worden gebruikt op waardevolle proefmonsters. Optimalisatie en validatie zijn belangrijk voor het certificeren van piek signaal detectie en beoordelen van de gevoeligheid en specificiteit. Zoals beschreven in het ...

Duizenden van somatische mutaties die betrekking hebben op kankerontwikkeling zijn gerapporteerde1. Daaronder een paar zijn voorspellende markers van de werkzaamheid van gerichte therapie 2,3 en genetische screening van deze mutaties is nu gangbare klinische praktijk. Droplet-technologie voor digitale PCR (ddPCR) kan worden gebruikt om te controleren op de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties met weetje speurder nauwkeurigheid en is zeer compatibel met niet-invasieve vloeibare biopsieën4,5. Huidige ddPCR testen zijn echter voornamelijk ontworpen om mutaties bekend een prioridetecteren. Dit beperkt ernstig het gebruik van ddPCR als een ontdekkingshulpmiddel wanneer de mutatie onbekend is. Inderdaad, in het ontwerp van de conventionele ddPCR, een sonde van de hydrolyse herkennen van het wild-type allel (WT sonde) concurreert met een specifieke sonde herkennen de mutant allel (MUT sonde) (figuur 1A). De sonde met hogere affiniteit aan de sjabloon hybridizes en haar fluorophore, met vermelding van de aard van de overeenkomstige allel releases. De gegevens van de fluorescentie verkregen voor elke druppel kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot vertegenwoordigen de fluorescentie die wordt uitgestoten door de WT en MUT sondes in verschillende dimensies. In figuur 1Ais een schematische weergave van een typisch resultaat voor een conventionele ddPCR assay gepresenteerd. In dit voorbeeld, de blauwe wolk komt overeen met de druppels met WT allelen geïdentificeerd door de WT sonde, overwegende dat de rode wolk correspondeert met druppels waarin de MUT-allel is versterkt en geïdentificeerd door de MUT-sonde. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie, dubbele positieve druppels met zowel WT en MUT waarbij kunnen worden weergegeven (groene wolk). De licht grijze wolk komt overeen met lege druppels.
Aangezien de meeste platformen toestaan voor de detectie van een beperkt aantal fluorophores (meestal 2, maar maximaal 5), is doorvoer van conventionele ddPCR beperkt. Targeting van regio's met meerdere aangrenzende mutaties vereist daarom ontwerp van technisch uitdagende multiplex ddPCR testen of het gebruik van meerdere reacties gericht op elke mutatie in parallel. De drop-off ddPCR strategie, overwint deze beperking zoals het potentieel kan detecteren elke genetische wijziging binnen de regio van een doel met behulp van een uniek paar WT hydrolyse sondes. De eerste sonde (sonde 1) omvat die een reeks van de niet-variabele, grenzend aan de target-regio en de tweede sonde (sonde 2) is een aanvulling op de WT-volgorde van de doel-regio waar de mutaties zijn verwacht (figuur 1B). Terwijl de eerste sonde de totale hoeveelheid amplifiable moleculen in de reactie kwantificeert, discrimineert de tweede sonde WT en MUT allelen door suboptimale hybridisatie aan mutant sequenties. Sonde 2 herkent meerdere soorten mutaties in de regio (enkelvoudige of meervoudige nucleotide vervangingen, verwijdering, enz.) van doelstelling6. Zoals in conventionele ddPCR correspondeert de licht grijze wolk druppels met geen DNA-moleculen. Het is belangrijk eraan te herinneren dat in dit type van test, optimale scheiding van WT en MUT wolken afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie is, omdat druppels met zowel WT en MUT doel allelen niet kunnen worden onderscheiden van druppels met alleen de WT formulier. Deze test vereist daarom bevatten de meeste druppels niet meer dan één exemplaar van de gerichte gen.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA tube (color code : lavendel)</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA-buisjes worden gebruikt om een hele bloed- of EDTA-plasma-monster te verkrijgen</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manuele protocol)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Voor het isoleren van vrij circulerend DNA uit menselijk plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (geautomatiseerd protocol)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Voor het isoleren van vrij circulerend DNA uit menselijk plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP systeem</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>volledig geïntegreerd en geautomatiseerd systeem voor cfDNA-, DNA- of RNA-zuivering</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Voor zuivering van maximaal 24 cfDNA's tegelijkertijd</td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>De Qubit-fluorometer is een tafelmodel-fluorometer voor de kwantificering van DNA</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 lezer</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 of 186-4003, respectievelijk</td><td>De lezer meet de fluorescentie-intensiteit van elke druppel en detecteert de grootte en vorm terwijl de druppels de detector passeren</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 druppelgenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 of 186-4002, respectievelijk</td><td>Apparaat gebruikt voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>C1000 thermische cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Modulaire thermische cycler-platform, inclusief C1000 Touch thermische cycler-chassis, 96-well fast reactiemodule</td></tr><tr><td>Plate sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; PCR plate sealer</td></tr><tr><td>DG8 cartridge holder</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Positioneert en houdt de DG8 cartridge in het instrument voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>Druppelgenerator cartridges en gaskets</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Microfluïdische DG8 cartridge gebruikt om monster en olie te mengen om druppels te genereren; DG8 gaskets sluiten de cartridge af om verdamping te voorkomen en brengen de vereiste druk toe voor druppelvorming</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix voor sondes (geen dUTP)</td></tr><tr><td>96-well PCR platen</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96-well semi-skirted platen</td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Doornaaibare folie hittesluiting</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Olie</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>olie gebruikt in de lees</td></tr><tr><td>Druppelgeneratie Olie voor Sondes</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>olie voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Tubes maximaliseren de monsterrecuperatie door de monster-oppervlakte binding aanzienlijk te verminderen</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Referentie Standaard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>De Multiplex I cfDNA Referentie Standaards zijn hoog gekarakteriseerd, biologisch-relevante referentiematerialen die worden gebruikt om de prestaties van cfDNA-assays te beoordelen die somatische mutaties detecteren</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>De HS assay is zeer selectief voor dubbelstrengs DNA (dsDNA) boven RNA en is ontworpen om nauwkeurig te zijn voor initiële monsterconcentraties van 10 pg/µL tot 100 ng/µL</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes zijn 500 µL dunne-wandige polypropyleen tubes voor gebruik met de Qubit Fluorometer</td></tr></tbody></table>

Één druppel digitale polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in hotspot regio 's

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Druppel digitale polymerase-kettingreactie (ddPCR) is een zeer gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) methode gebaseerd op monster fractionering in duizenden nano-sized water-in-olie individuele reacties. Onlangs, ddPCR is uitgegroeid tot een van de meest nauwkeurige en gevoelige instrumenten voor circulerende tumor (ctDNA) DNA detectie. Een van de belangrijkste beperkingen van de standaard ddPCR-techniek is het beperkte aantal mutaties die kan worden gescreend per reactie, zoals specifieke hydrolyse sondes herkennen van elke mogelijke allèlique versie nodig zijn. Een alternatieve methode, de drop-off ddPCR, verhoogt de doorvoer, omdat het vereist slechts een paar van sondes voor het detecteren en kwantificeren van potentieel alle genetische veranderingen in het gerichte gebied. Drop-off ddPCR toont vergelijkbare gevoeligheid aan conventionele ddPCR testen met het voordeel van het opsporen van een groter aantal mutaties in een enkele reactie. Het is rendabel, conserveert kostbare monstermateriaal, en kan ook worden gebruikt als een ontdekkingshulpmiddel mutaties zijn niet bekend een priori.

KRAS exon 2 mutaties (codonen 12 en 13) en EGFR exon 19 verwijderingen in een bewijs-van-concept studie, werden in FFPE weefsels en plasma monsters van kankerpatiënten met behulp van de drop-off ddPCR strategie6onderzocht.
De KRAS drop-off sonde ondervraagd een 16 bp regio omvat meerdere mutaties in exon 2 van de KRAS -gen, die meer dan 95% van de bekende KRAS ...

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Deze methode kan worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor kanker om de circulerende tumor DNA te analyseren. Deze techniek ondervraagt meerdere genetische veranderingen in gebieden van clustermutaties in een enkele reactie. Dit helpt om kostbare patiëntmonsters te besparen.Deze methode kan inzicht geven in de tumorbelasting op het mutatieprofiel. Het kan nu ook worden toegepast op een moleculaire analyse als alternatief voor qPCR om een absolute kwantificering van nucleïnezuur doelsequenties te verkrijgen. Verzamel bloedmonsters in zeven-milliliter EDTA buizen.Twee buizen worden aanbevolen om ongeveer vier milliliter plasma te verzamelen. Centrifuge de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 820 keer zwaartekracht binnen drie uur na de bloedafname om rode bloedcellen, witte bloedcellen en plasma te scheiden. De tijd tussen de bemonstering en de centrifugatie is van cruciaal belang om hoogwaardig, T-celvrij DNA te verkrijgen dat niet besmet is met DNA dat vrijkomt uit witte bloedcellen.Gebruik na centrifugatie een serologische pipet om de supernatant te verzamelen zonder de witte bloedcellaag aan te raken. Ongeveer twee milliliter plasma worden meestal teruggewonnen per EDTA buis. Na het overbrengen van de plasmen naar twee milliliter buizen, centrifugeren de aliquots op 16.000 keer de zwaartekracht gedurende 10 minuten op 15 graden Celsius om celpuin te verwijderen.Verzamel het plasma zorgvuldig zonder de pellet te verstoren en breng over op twee milliliter cryogene buizen. Bewaar op negatieve 80 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het toevoegen van 400 microliter proteinase K aan een buis van 50 milliliter.Voeg vervolgens vier milliliter plasma en 3,2 milliliter ACL lyse buffer met een microgram drager RNA uit de extractiekit. Sluit de buis en meng door vortexing voor 30 seconden om een homogene oplossing te verkrijgen. Dan, incubeer op 60 graden Celsius gedurende 30 minuten.Voeg na de incubatie 7,2 milliliter buffer ACB toe aan het lysaat om de binding van de circulerende nucleïnezuren aan het silicamembraan te optimaliseren. Meng door vortexing voor 15 tot 30 seconden. Dan, incubeer de buis op ijs gedurende vijf minuten.Bevestig de kolom en de 20 milliliter extender op de vacuümpomp. Sluit de ongebruikte porties om vacuüm aspiratie mogelijk te maken. Na het kort centrifugeren van de buis, voorzichtig het mengsel in de buis extender.Schakel vervolgens de vacuümpomp in en laat het lysaat volledig door de kolommen worden getrokken. Verwijder en gooi de buis extender. Breng vervolgens 600 microliter buffer ACW1 aan op de kolom.Wanneer buffer ACW1 door de kolom heeft getrokken, voeg 750 microliter acw2-buffer toe en ten slotte 750 microliter van 96 tot 100% ethanol. Plaats de kolom vervolgens in een schone opvangbuis van twee milliliter en vercentrifuge drie minuten op volle snelheid om ethanol te elimineren. Na het plaatsen van de kolom in een nieuwe twee milliliter opvangbuis, open het deksel en vervolgens incubeer op 56 graden Celsius gedurende 10 minuten om het membraan volledig te drogen.Plaats de kolom na de incubatie in een schone 1,5 milliliter laagbindende buis. Breng voorzichtig 36 microliter RNase-vrij water aan met 0,04% natriumajaide. Sluit vervolgens het deksel en broed drie minuten op kamertemperatuur.Centrifuge weer op volle snelheid voor een minuut om de nucleïnezuren te ontwijken. Dan, op te slaan op negatieve 20 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het ontdooien en equilibreren van de reactiecomponenten op kamertemperatuur in een schone PCR-kap.Bereid vervolgens een 20 keer mix van primers en sondes in RNase en Dnase-vrij gedestilleerd water met elke primer op 18 micromolar concentratie en elke sonde op vijf micromolar concentratie. Voor alle individuele PCR reacties, bereid een monster mix door het combineren van 10 microliter van twee keer ddPCR Supermix, een microliter van 20 keer primers en sondes mix, en tot 10 nanogram van het DNA-monster in 20 microliter van gedestilleerd water. Vortex het reactiemengsel grondig om homogeniteit te garanderen.En even centrifugeren om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de buis voor het verstrekken. Steek de ddPCR-cartridge in de houder en laad 20 microliter monsterreactiemix in de middelste putten van de cartridge voor druppelgeneratie. Voeg 70 microliter druppelgeneratorolie toe aan de onderste putten.Steek de cartridge met een pakking in de druppelgenerator. Druppels worden geproduceerd in de bovenste putten van de cartridge. Langzaam en voorzichtig 40 microliter van de druppels uit de cartridges aanzuigen en in een PCR-plaat met 96 putten af te geven.Verzegel de uiteindelijke PCR-plaat met aluminiumfolie met behulp van een plaatafdichter onmiddellijk na het overbrengen van druppels om verdamping te voorkomen. Vercentrifugeert de plaat kort om de inhoud aan de onderkant van de putten te verzamelen. Voer een conventionele PCR-versterking uit op een thermische cycler.Wanneer de run is voltooid, kort centrifugeren de plaat om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de putten. Gebruik na PCR-versterking de druppellezer om pcr-positieve en PCR-negatieve druppels te tellen volgens de instructies van de fabrikant. De volgende zijn representatieve resultaten verkregen tijdens optimalisatiestappen van de drop-off ddPCR test.Deze afbeelding toont detectie van mutant DNA en wild-type DNA in een reactie die 100% mutant DNA, 5% mutant DNA, en 100% wild-type DNA. Deze afbeelding toont voorbeelden van plasmamonsters geanalyseerd met de KRAS en EGFR drop-off ddPCR testen waaruit blijkt dat de detectie van enkele nucleotide en meerdere substituties in exon twee van KRAS en een schrapping in EGFR exon 19. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om zorgvuldig te werk te gaan bij elke stap met een speciale aandacht op de druppelgeneratie, dat is een kritieke stap van deze methode.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoeker en clinicus op het gebied van kankeronderzoek om de tumormutatieanalyse te optimaliseren met behulp van vloeibare biopsie.

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

In this video, we demonstrate the duplex digital PCR (ddPCR) technique — a modification of the traditional PCR technique that is useful in detecting two different genetic markers simultaneously. A single PCR reaction is partitioned into nanoliter-sized emulsified droplets that are independently amplified, and the detection of differently colored fluorescence amplification signals from the fraction of droplets is used to compute the initial concentration of the target sequences.

Duplex Digital PCR for Simultaneous Quantification of Dual Genetic Markers

This video demonstrates the multiplex droplet polymerase chain reaction technique for the simultaneous quantification of methylated DNA regions in different white blood cell populations as an early biomarker for clinical diagnosis and prognosis.

Multiplex Droplet Polymerase Chain Reaction to Detect DNA Methylation in Leukocytes

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Digitale polymerase-kettingreactie (PCR) is een nuttig hulpmiddel voor het opsporen van hoog-gevoeligheid van één nucleotide varianten en DNA kopie nummer varianten. Hier tonen we belangrijke overwegingen voor het meten van zeldzame varianten in het menselijk genoom digitale PCR met de chip-in-a-tube-indeling.

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Leer de drop-off ddPCR-methode voor detectie van meerdere mutaties in ctDNA uit vloeibare biopsie. Deze techniek bespaart waardevol patiëntmateriaal en biedt absolute kwantificering van tumor-DNA voor kankerdiagnostiek.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Meer video's verkennen