Name: Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer een minimaal invasieve laparoscopische embryo-overdracht en cryopreservatie bij konijnen. Deze techniek biedt betrouwbare resultaten voor reproductief onderzoek en klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door fondsen van het ministerie van economie en concurrentievermogen van Spanje (AGL2017-85162-c2-1-R) en Generalitat Valencia Research Programme (PrometeoII 2014/036). Engelse tekstversie herzien door N. Macowan English language service

Alle in deze studie gebruikte experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EU-EEG voor dierproeven en werden door het ethische Comité voor experimenten met dieren van de Universitat Politècnica de València beoordeeld en goedgekeurd. Spanje (onderzoek code: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC en JSV heeft een autorisatie certificaat afgegeven door de regering van Valencia om te experimenteren op dieren. XGD is gemachtigd om in situ toezicht te houden op het welzijn en de verzorging van de dieren tijdens het experiment.
1. embryo transfer
<ol><li>Bereiding van vrouwelijke ontvangers
	<ol>
<li>Gebruik alleen seksueel rijpe vrouwen (> 4,5 maanden oud).</li>
		<li>Een week voor ET, passen vrouwtjes aan een 16 h licht/8 h donker regime te initiëren folliculaire groei en verbeterde vrouwelijke ontvankelijkheid.</li>
		<li>Selecteer de ontvanger vrouwtjes, het observeren van de turgescentie en de kleur van de vulva. Als de vulva is turgescent en roodachtig, het vrouwtje is ontvankelijk.</li>
		<li>Induceren pseudopregnancy (ovulatie) door een enkele intramusculaire injectie van 1 µ g van busereline acetaat (synthetisch analoog van gonadotrofine-releasing hormoon), ongeacht het lichaamsgewicht. Nota: normaal, 0,8 µ g is een geschikte dosis voor ovulatie inductie in middelgrote konijnen (4-5 kg), zodat 1 µ g over het algemeen de ovulatie waarborgt.</li>
		<li>De ovulatie zo veel dagen vooraf te induceren als de leeftijd van de embryo's worden overgedragen (bijvoorbeeld 70-72 h voor verse morula ET).</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthesie en analgesie
	<ol>
<li>Weeg het konijn en laad de volgende verdovingsmiddelen en pijnstillers.<ol>
<li>In een spuit van 1 mL met een 30G naald: belasting xylazine (5mg/kg) en buprenorfine hydrochloride (0,03 mg/kg). In een andere 1 mL spuit met een 23G pericranial naald, belasting ketamine hydrochloride (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Houd het konijn en injecteren van de xylazine-buprenorfine mengsel intramusculair.</li>
		<li>Steek de pericranial naald met ketamine in de marginale oor ader, langzaam de invoering van alle injectiespuit inhoud intraveneus.</li>
		<li>Bevestig de naald en laat het geplaatst in de resterende stappen om meer anesthesie te beheren indien nodig.</li>
		<li>Laat het konijn in de kooi (schoon en zonder andere dieren) op een warme podium.</li>
		<li>Eenmaal bewusteloos, van toepassing Eye zalf om droogte van het oog te voorkomen en te controleren op de afwezigheid van de palpebrale freflex. Opmerking: dit protocol biedt een chirurgische anesthesie vliegtuig voor een minimum van 30 minuten. Als een langere tijd nodig is, injecteren extra doseringen met de helft van het bedrag van ketamine hydrochloride beschreven in 1.2.1 na 30 min.</li>
		<li>Controleer de diepte van de anesthesie door het controleren van de pedaal reflex en ademhaling beweging. De veranderingen in het ademhalingspatroon aan een onregelmatig en sneller tarief wijzen op verlies van het juiste vlak van anesthesie.</li>
		<li>Controleer de kleur van de slijmvliezen (ogen, lippen, enz.), ademhalingstarief (30-60 ademhalingen per minuut), harttarief (120-325 slagen per minuut) en rectale temperatuur (38-39.6 °c).</li>
		<li>Acht uur voor de overdracht, weigeren voedsel van dieren om de grotere darm grootte en de activiteit te voorkomen totdat het ET proces is voltooid. Laat vrije toegang tot water.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryo-voorbereiding
	<ol>
<li>Verwarm de media van de embryo manipulatie aan 25 °C: basis middel (BM), bestaand uit Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) aangevuld met 0,2% (w/v) van het serum albumine van het rund.</li>
		<li>Werken onder een stereomicroscoop, spoel verse of ontdooide (stap 2) embryo's met BM.</li>
		<li>Bevestig met steriele handschoenen een op de juiste wijze geconfigureerde 17G epidurale katheter met een 1 mL spuit.</li>
		<li>Aspireren 1 cm van BM in de katheter, gevolgd door een kleine lucht zeepbel.</li>
		<li>Aspireren 5-7embryos in een volume van 10 µ L van BM, gevolgd door een andere kleine lucht zeepbel.</li>
		<li>Finish het laden van de katheter door opzuigen 1 cm van BM.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryo transfer
	<ol>
<li>Overweeg het gebruik van steriele handschoenen, toga en masker om een aseptische omgeving te garanderen.</li>
		<li>Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar een operatie zal worden uitgevoerd, en veeg ze met 70% ethanol.</li>
		<li>Voer anesthesie als eerder gedetailleerde (stap 1,2), controle op het verlies van reflexen.</li>
		<li>Scheer de vacht van de buik met een elektrisch scheermes.</li>
		<li>Bereid de buik aseptisch.<ol>
<li>Reinig de chirurgische ruimte en verwijder eventuele resterende haar. Was het chirurgische gebied met een chloorhexidinegluconaat zeep. Sanitize het gebied met chloorhexidine oplossing en ethanol 96 º (3 keer).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plaats het dier op een warme chirurgische tafel, in de positie van Trendelenburg (hoofd naar beneden om 45 °) om ervoor te zorgen dat de maag en darmen zijn craniale gelegen. Overweeg de evacuatie van de blaas als het turgescent is. Als een ingewanden beschadigd zijn in het proces, kan het dier sterven. Het is daarom belangrijk dat ze goed zijn gelegen (Figuur 1).</li>
		<li>Bedek het gebied met behulp van een steriele handdoek, met een gat (fenestratie) bloot het geschoren gebied, om de chirurgische site te scheiden van alle mogelijke vervuilende gebieden.</li>
		<li>Plaats een Endoscopische trocar 5 cm in de buikholte, 2 cm caudale aan de xiphoid proces, en insufflate door het de buikholte met een druk-regulerende mechanische insufflator. Opmerking: de intra-abdominale druk moet 8-12 mmHg met CO2 (Figuur 1a).</li>
		<li>Plaats de endoscoop camera via de Endoscopische trocar (Figuur 1b). Opmerking: Identificeer het voortplantingskanaal, het bepalen van de status en de positie van de infundibulum en ampulla vóór ET om de volgende stappen te vergemakkelijken.</li>
		<li>Plaats de 17-G epidurale naald in de liesstreek tussen 2-3 cm van de infundibulum (Figuur 1b).</li>
		<li>Identificeer de ingang van de infundibulum (Figuur 2a, 2b).</li>
		<li>Plaats de geladen katheter (stap 1,3) door de epidurale naald in de buik (figuur 1c).</li>
		<li>Zoek de eileider en steek 1-2 cm van de epidurale katheter door de infundibulum in de ampulla (Figuur 2a-2c). Niet ver vooruit in de eileider om schade en bloeding te voorkomen.</li>
		<li>Laat de embryo's in de eileider door voorzichtig te drukken op de zuiger van de spuit gekoppeld aan de katheter (figuur 2D-2F). Beide luchtbellen moeten de katheter verlaten.</li>
		<li>Verwijder de katheter net nadat de embryo's zijn vrijgegeven.</li>
		<li>Spoel de katheter, opzuigen en loslaten van het manipuleren van het medium om de afwezigheid van de embryo's te controleren en hun succesvolle overdracht te bevestigen.</li>
		<li>Herhaal de stappen 1.4.11 naar 1.4.16 in de andere kant van de baarmoeder, indien gewenst.</li>
		<li>Verwijder de epidurale naald en endoscoop camera.</li>
		<li>Release CO2 via de Endoscopische trocar. Als overtollig gas blijft in de buik van het dier, zal het pijn en ongemak.</li>
		<li>Verwijder de Endoscopische trocar uit de buikholte. Verwijder de chirurgische handdoek.</li>
		<li>Stop de anesthesie.</li>
		<li>Reinig de incisie gemaakt door de trocar met chloorhexidine oplossing. Sluit de incisie gemaakt door de trocar met een micron aluminium en een plastic dressing.</li>
	</ol></li>
	<li>Postoperatieve zorg
	<ol>
<li>Behandel de dieren met antibiotica: 10 mg/kg enrofloxacin, onderhuids, elke 24-h voor 5 dagen.</li>
		<li>Toediening van pijnstillers: buprenorfine hydrochloride (0,03 mg/kg), intramusculair, elk 12 uur voor 3 dagen; Meloxicam (0,2 mg/kg), onderhuids, elke 24-h voor 3 dagen.</li>
		<li>Monitor de dieren gedurende ten minste 30 min na de operatie (afhankelijk van het dier en de dosis van de anesthesie gebruikt) ervoor te zorgen dat ze terug te vorderen van hun fysiologische omstandigheden.</li>
		<li>Identificeer de ontvanger (bijv., oor tatoeage) en huisdieren individueel in een schone kooi met de juiste omgevingsconditie.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> Figuur 1: laparoscopische embryotransfer bijgestaan door laparoscopie (External view). A) inbrengen van de Endoscopische trocar (één poort). B) inbrengen van de Endoscopische camera en de epidurale naald (zwarte pijl). C) het inbrengen van de embryo-overbrengings katheter (witte pijl) door de epidurale naald. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> Figuur 2: laparoscopische embryotransfer bijgestaan door laparoscopie (Internal View). A: Inbrengen van de katheter door de epidurale naald in de buik zone. Asterisk geeft de infundibulum. B, C, D: De katheter geladen met de embryo's wordt ingevoegd in ampulla gebied over de infundibulum. E, F: Release van de embryo's, bevestigd door de visualisatie van een gezwollen eileider. Dit cijfer is aangepast van Marco-Jiménez et al. 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
2. embryo-verglazing en-opwarming
<ol><li>Voer alle manipulaties bij kamertemperatuur (rond 22 °C) uit om de toxiciteit van de verglazing-oplossing bij warmere temperaturen te verminderen. Opmerking: embryo's kunnen worden verplaatst met behulp van 0.1-2 µ L automatische pipet in dit protocol, maar ook andere soortgelijke apparaten te verplaatsen van de embryo's slepen het minimum volume kan geschikt zijn.</li>
	<li>Vitrify de embryo's in een procedure in twee stappen aanvullen:<ol>
<li>Plaats de embryo's gedurende 2 minuten in equilibrating oplossing bestaande uit 10% (v/v) ethyleenglycol en 10% (v/v) dimethyl sulfoxide opgelost in BM.</li>
		<li>Verplaats de embryo's (vanaf stap 2.2.1) gedurende 1 minuut in verglazing oplossing bestaande uit 20% (v/v) ethyleenglycol en 20% (v/v) dimethyl sulfoxide opgelost in BM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laad de embryo's in een 125 µ L plastic ministraw (die een gesloten uiteinde met een katoenen stekker en een open Extreme bevat). Het proces is schematized in Figuur 3.<ol>
<li>Koppel het gesloten uiteinde van 0,125 l ministraw met de juiste microdispenser (bijv. Captroll III®).</li>
		<li>Aspireren BM tot 1/3 van het stro lengte, na door een kleine lucht zeepbel.</li>
		<li>Aspireren de embryo's in een volume van 40 µ L van verglazing oplossing, gevolgd door een andere kleine lucht zeepbel.</li>
		<li>Aspireren BM tot de eerste vloeibare fractie (stap 2.3.2) bereikt het katoen.</li>
		<li>Sluit het open uiteinde met een stro stekker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer stap 2.2.2, terwijl stap 2,3 wordt gedaan om ervoor te zorgen dat niet meer dan een minuut verstrijkt, die giftig zou zijn voor embryo's.</li>
	<li>Dompel de ministraw direct in vloeibare stikstof om verglazing te bereiken.</li>
	<li>Bewaar de ministraw in een dewar's voor stikstof voor de gewenste tijd.</li>
	<li>De embryo's in één stap ontdooien.<ol>
<li>Plaats de ministraw horizontaal 10 cm van vloeibare stikstof damp voor 20-30 s.</li>
		<li>Wanneer de kristallisatie proces begint in de ministraw, dompel de ministraw in een waterbad bij 25 ° c voor 10-15 s.</li>
		<li>Verwijder de ministraw stekker en snijd de katoenen stekker.</li>
		<li>Met een gekoppelde microdispenser, verdrijven alle ministraw inhoud in een plaat met 0,33 M sacharoseoplossing bij 25 ° c in BM gedurende 5 minuten. Opmerking: deze stap moet snel gedaan worden om de embryo-blootstelling aan de verglazing oplossing te verminderen.</li>
		<li>Verplaats de embryo's naar een nieuwe plaat met BM-oplossing voor nog eens 5 minuten.</li>
		<li>Overweeg alleen niet-beschadigde embryo's (met intacte mucine jas en zona pellucida) om verder te gaan met de ET. Opmerking: Houd er rekening mee dat in ontdooide embryo's, asynchrone overdrachten (bijv. 60-62 h in morula overdrachten) de resultaten kunnen verbeteren door een hersynchronisatie tussen het embryo en het moeder endometrium mogelijk te maken.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> Figuur 3: Schematization van correct geladen stro. A) BM verwijst naar de embryo-manipulatie media in dienst tijdens verglazing. Embryo's moeten in verglazing oplossing worden geladen. B) macroscopische verschijning van het geladen stro met een vergrote detail van de embryo positie. Deze grote-volume-apparaat stelt ons in staat om vitrify groot aantal embryo's, in tegenstelling tot minimale volume-apparaten. Voorts is de behandeling van dit apparaat gemakkelijker vergeleken met minimum volume apparaten, terwijl de resultaten in konijnen41gelijkaardig zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sinds het eerste gedocumenteerde levende geboorte geval van overgebrachte embryo's9, zijn deze techniek en de konijn soorten essentieel in reproductieve studies geworden. Daarnaast vereisen embryo-onderzoek met manipulatie, productie, cryopreservatie, enz. , als laatste stap de evaluatie van de embryo capaciteit voor het opwekken van gezonde nakomelingen op volle termijn. Daarom is embryotransfer techniek onmisbaar13,28. In de loo...

Met de doelstellingen van het omzeilen van menselijke onvruchtbaarheid of de verbetering van de verspreiding van vee van hoge genetische waarde en het behoud van dierlijke genetische hulpbronnen, een reeks technieken gezamenlijk genoemd ondersteunde reproductie technologieën, zoals superovulatie, in vitro fertilisatie, embryocultuur, of cryopreservatie, werden ontwikkeld1,2. Momenteel worden hormonale behandelingen gegeven aan de eierstokken te stimuleren en produceren een groot aantal antral ovariële follikels1. Oöcyten verzameld uit deze follikels kunnen worden gerijpt, bevrucht, en ontwikkeld in vitro totdat ze ofwel gecryopreserveerde of overgedragen aan surrogaat moeders3. Echter, tijdens deze behandelingen, gameten en zygoten worden blootgesteld aan een reeks van niet-fysiologische processen die kunnen vereisen embryo aanpassing om te overleven in deze omstandigheden4,5. Deze aanpassing is mogelijk door de vroege embryo-plasticiteit, waardoor embryo veranderingen in genexpressie en ontwikkelings programmering6. Echter, deze wijzigingen kunnen invloed hebben op de daaropvolgende stadia van de ontwikkeling van embryo's tot volwassenheid, en het is nu algemeen aanvaard dat methoden, timing, cryopreservatie procedure of cultuur voorwaarden tonen verschillende resultaten op embryo Fate7 , 8. Daarom is het gebruik van goed gekenmerkte diermodellen onvermijdelijk om de specifieke geïnduceerde effecten van kunst te verhelderen.
De eerste gedocumenteerde levende geboorte als gevolg van de overdracht van zoogdier embryo's vond plaats in 18909. Vandaag, embryotransfer (ET) naar een surrogaat vrouwtje is een cruciale stap in het bestuderen van de kunst-geïnduceerde effecten tijdens de pre-implantatie op de daaropvolgende embryo ontwikkeling stadia10. ET de technieken hangen van de grootte en de anatomische structuur van elk dier af. In het geval van grote dierlijke modellen, is het mogelijk geweest om ET door transcervicale niet-chirurgische ET technieken uit te voeren, maar in kleiner-grootte soorten katheterisatie van de cervix is complexer en de chirurgische technieken worden vaak gebruikt11. Echter, chirurgische ET kan leiden tot bloedingen die implantatie en embryo ontwikkeling kunnen schaden, als het bloed kan binnenvallen de baarmoeder lumen, waardoor embryo Death10. Transcervicale niet-chirurgische et technieken worden nog steeds toegepast bij mensen, bavianen, runderen, varkens en muizen12,13,14,15,16,17, maar chirurgische ETS worden nog steeds gebruikt in soorten zoals geiten, schapen of andere dieren die extra moeilijkheden veroorzaken10,18,19,20,21, zoals konijnen (twee onafhankelijke cervices) of muizen (kleine grootte). Niettemin, chirurgische overdracht methoden hebben de neiging geleidelijk te zijn vervangen door minder invasieve methoden. Endoscopie werd gebruikt voor de overdracht van embryo's, bijvoorbeeld bij konijnen, varkens en kleine herkauwers18,19,20. Deze minimaal invasieve endoscopie methoden kunnen worden gebruikt voor de overdracht van embryo's in de ampulla via de infundibulum, die essentieel is bij konijnen en heeft aangetoond gunstige effecten in sommige soorten20. Dit is gebaseerd op het belang van de juiste dialoog tussen embryo en moeder tijdens vroege embryonale stadia in de eileider. Zoals hierboven vermeld, het embryo remodeling dat plaatsvindt in konijnen tijdens de embryo migratie door de eileider is van essentieel belang voor het bereiken van embryo's kunnen inplanteren22,23.
Grotere dierlijke modellen, zoals runderen, zijn interessant, omdat de biochemische en pre-implantatie functies zijn vergelijkbaar met die in de menselijke soort24. Nochtans, zijn de grote dieren te duur om in inleidende proeven te gebruiken, en de knaagdieren worden beschouwd als een ideaal model (76% modelorganismen zijn knaagdieren) voor laboratoriumonderzoek25. Niettemin, het konijn model biedt een aantal voordelen ten opzichte van knaagdieren in reproductieve studies, zoals sommige reproductieve biologische processen tentoongesteld door de mens zijn meer vergelijkbaar in konijnen dan die in muizen. De mens en de konijnen presenteren een gelijkaardige chronologische embryonale genoom activering, gastrulation en hemochorial placenta structuur. Bovendien is het gebruiken van konijnen het mogelijk om de nauwkeurige timing van bemesting en zwangerschapsstadia te kennen toe te schrijven aan hun veroorzaakte ovulatie25. Konijn levenscycli zijn kort, de voltooiing van de zwangerschap in 31 dagen en het bereiken van de puberteit op ongeveer 4-5 maanden; het dier is gemakkelijk te hanteren vanwege zijn volgzaam en niet-agressief gedrag, en het onderhoud is zeer zuinig in vergelijking met de kosten van grotere dieren. Bovendien is het van cruciaal belang te vermelden dat konijnen hebben een duplex baarmoeder met twee onafhankelijke baarmoederhals11,25. Dit plaatst het konijn in een preferentiële positie, aangezien de embryo's van de verschillende experimentele groepen in het zelfde dier, maar in een verschillende baarmoeder hoorn kunnen worden overgebracht. Dit stelt ons in staat om zowel experimentele effecten te vergelijken, het verminderen van de moeder factor van de resultaten.
Vandaag, niet-chirurgische ET methoden zijn niet in gebruik in konijn. Sommige studies uitgevoerd in de late jaren ' 90 met behulp van een transcervicale et techniek resulteerde in lage leverings percentages variërend van 5,5% tot 20,0%11,26 versus 50-65% door chirurgische methoden, waaronder de laparoscopie procedure beschreven door Besenfelder en brem18. De lage slaagpercentages van deze niet-chirurgische ET methoden in konijnen samenvallen met het ontbreken van de noodzakelijke embryo remodeling in de eileider, die wordt vermeden in transcervicale ET. Hier beschrijven we een effectieve minimaal invasieve laparoscopische ET procedure met behulp van konijnen als een modelorganisme. Deze techniek biedt een model voor verder voortplantings onderzoek bij grote dieren en mensen.
Omdat de konijnen een bijzonder smal tijdvenster voor embryo implantatie hebben, vereist ET in deze soort een hoge graad van synchronie tussen de ontwikkelingsfase van het embryo in ET en de fysiologische status van de ontvanger27. In sommige gevallen, na een reproductieve behandeling die embryo ontwikkeling (zoals in vitro cultuur) vertraagt of het endometrium ontvankelijkheid (zoals superovulatie behandelingen) verandert, is er geen synchronie tussen het embryo en de moeder baarmoeder. Deze situaties kunnen een negatieve invloed hebben op het resultaat. Om te reageren in deze context, beschrijven we een effectief konijn morula verglazing protocol dat ons in staat stelt te pauzeren, organiseren en hervatten van de experimenten. Dit proces is logistiek wenselijk voor reproductieve studies en geeft ons de capaciteit voor lange termijn opslag van embryo's, waardoor hun vervoer. De laparoscopische procedure en cryopreservatie strategieën zorgen voor een betere planning van studies met minder dieren. Onze methodologie biedt dus hygiënische en economische voordelen en voldoet aan het concept van de 3V (vervanging, reductie en verfijning) van dier onderzoek met als doel de menselijke behandeling van proefdieren te verbeteren. Aldus, met deze methodes, vormen de konijnen een ideaal modelorganisme voor in vivo reproductieve analyses.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>Te bestellen door een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Buserelin Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidine digluconaat zeep</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidine digluconaat oplossing</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Fisher scientific</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Zonder calciumchloride.</td></tr><tr><td>Elektrisch scheerapparaat</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Endoscoopcamera</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Endoscooptrocar met siliconenklep</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute;rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Lichtgewicht trocarmodel.</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>Te bestellen door een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Epicraneale naald 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>Kleinere naalden kunnen ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Epidurale katheter</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Epidurale naald</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>Te bestellen door een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Laparoscopie-apparatuur</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute;rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg; laparoscoop, 0&ordm;-mm rechtuitkijk-laparoscoop, 30-cm lengte, 5-mm werkkanaal.</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Air Liquide</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Mechanische CO2-insufflator</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute;rica S.A.</td><td>Endoflator&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>Te bestellen door een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Petrischalen, 35-mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofverband (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof strooibuis 0,25 mL</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Povidonjodide-oplossing</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Elke reguliere chirurgische kwaliteit stalen kleine rechte schaar zal werken.</td></tr><tr><td>Siliconenbuis voor insufflator</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute;rica S.A.</td><td>20400040</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Er zijn goedkopere opties zoals Leica MZ8 of Nikon SMZ-10 of SMZ-2B, om er een paar te noemen.</td></tr><tr><td>Steriele handschoenen</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Steriele kledij</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>12261501</td><td></td></tr><tr><td>Steriele masker</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Strooibuisplug</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Spuit, 1-mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11750425</td><td></td></tr><tr><td>Spuit, 5-mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11773313</td><td></td></tr><tr><td>Urinaire katheter</td><td>IMV - technologies</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>Te bestellen door een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Konijnen</td><td>Universitat Polit&egrave;cnica de Val&egrave;ncia</td><td>Lijn A</td><td>Andere moederlijnen, zoals Lijn V of Lijn HP kunnen worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>

minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Geassisteerde reproductieve technieken (kunst), zoals in vitro embryocultuur of embryo cryopreservatie, beïnvloeden natuurlijke ontwikkelingspatronen met perinatale en postnatale gevolgen. Om de onschadelijkheid van kunst toepassingen te waarborgen, zijn studies in dierlijke modellen noodzakelijk. Bovendien, als een laatste stap, embryo ontwikkeling studies vereisen evaluatie van hun vermogen om op volledige termijn gezonde nakomelingen te ontwikkelen. Hier, embryotransfer naar de baarmoeder is onmisbaar voor het uitvoeren van een ARTs-gerelateerde experiment.
Het konijn is gebruikt als een modelorganisme om de voortplanting van zoogdieren te bestuderen voor meer dan een eeuw. In aanvulling op haar verwantschap nabijheid van de menselijke soort en de geringe omvang en lage onderhoudskosten, het heeft belangrijke reproductieve kenmerken zoals geïnduceerde ovulatie, een chronologie van de vroege embryonale ontwikkeling vergelijkbaar met de mens en een korte dracht die ons toelaten om de gevolgen van de kunst toepassing gemakkelijk te bestuderen. Bovendien worden kunst (zoals intracytoplasmatische spermainjectie, embryocultuur, of cryopreservatie) toegepast met geschikte efficiency in deze soort.
Met behulp van de laparoscopische embryotransfer techniek en de cryopreservatie protocol gepresenteerd in dit artikel, beschrijven we 1) hoe embryo's overdracht door middel van een eenvoudige, minimaal invasieve techniek en 2) een effectief protocol voor de lange termijn opslag van konijn embryo's om tijd-flexibele logistieke capaciteiten te bieden en de mogelijkheid om het monster te vervoeren. De resultaten verkregen na de overdracht van konijn embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia geven aan dat morula is de ideale fase voor konijn embryo herstel en overdracht. Zo is een oviductal embryotransfer vereist, rechtvaardigen de chirurgische procedure. Bovendien, konijn morulae zijn met succes verglaasd en Laparoscopisch overgedragen, waaruit de effectiviteit van de beschreven technieken.

Minimaal invasieve laparoscopische overdracht van verse of verglaasd embryo's plaatst het konijn onder de beste modeldieren voor reproductieve studies. Tabel 1 toont de resultaten van Fresh et in verschillende ontwikkelingsstadia (Figuur 4) van overgebrachte embryo's. De overlevingskans bij de geboorte (percentage van de embryo's die resulteren in een pup) bleek de werkzaamheid van de laparoscopische techniek beschreven in dit document. De ho...

Assisted reproductieve technieken (ARTs) worden voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de daaraan verbonden Risico's te verminderen. Dit manuscript beschrijft een minimaal invasieve embryotransfer procedure met een efficiënt cryopreservatie protocol dat het gebruik van konijnen als een ideaal dierlijk model van menselijke voortplanting toelaat.

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Het belangrijkste doel van dit experiment is om een laparoscopische embryo overdracht procedure bij konijn te beschrijven als een model. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze werkt om embryo's over te brengen met behulp van een eenvoudige, minimaal invasieve techniek. Bovendien werkt het effectieve hier beschreven protocol voor embryo cryopreservatie ook tot de langdurige opslag van de embryo's van het konijn, waardoor tijdflexibele logistieke capaciteiten en de mogelijkheid om het monster te vervoeren.Zoals we weten, zijn ondersteunde reproductieve technologieën voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de bijbehorende risico's te verminderen. Daarom kan konijn met behulp van beide technieken worden gebruikt als een ideaal diermodel van menselijke voortplanting om belangrijke vragen op dit gebied te beantwoorden, zoals de effecten van de in vitro embryomanipulatie op nakomelingen. Visuele demonstratie van deze zaken zijn van cruciaal belang als de embryo-overdracht stappen zijn moeilijk te leren, omdat het moet worden gedaan met grote precisie om het succes van de techniek te waarborgen.Voor embryonale vitrificatie, dompel de embryo's in evenwicht oplossing voor twee minuten, gevolgd door een een minuut incubatie in vitrification oplossing. Laad aan het einde van de incubatie de embryo's in een 125 microliter plastic mini-stro en koppel het gesloten uiteinde van het mini-stro met een geschikte een milliliter microdispenser. Aanzuigen basismedium tot een derde van de strolengte, gevolgd door een kleine luchtbel.Gebruik vervolgens een stereomicroscoop om de embryo's aan te trekken in 40 microliter van vitrificatieoplossing, gevolgd door een andere kleine luchtbel en genoeg basismedium om de eerste vloeibare fractie naar het katoen van het ministro te verplaatsen. Sluit vervolgens het geopende uiteinde van het mini-stro met een stroplug, dompel het mini-stro direct in vloeibare stikstof om vitrificatie te bereiken en bewaar het mini-stro in een vloeibare stikstofdeoorlog. Om de embryo's te ontdooien voor een overdracht, plaats de mini-stro horizontaal 10 centimeter van de vloeibare stikstofdamp voor 20 tot 30 seconden.Wanneer het kristallisatieproces begint in het mini-stro, dompel het mini-stro in het waterbad van 25 graden Celsius gedurende 10 tot 15 seconden onder. Verwijder onmiddellijk de mini-stro- en katoenen pluggen en gebruik een gekoppelde microdispenser om het mini-strogehalte te verdrijven in een plaat met een basismedium van 25 graden Celsius aangevuld met 0,33 molaire sacharoseoplossing, waarin embryo's gedurende vijf minuten moeten blijven. Breng de embryo's vervolgens nog eens vijf minuten over naar een plaat van vers basismedium.Zo vele dagen vóór als de leeftijd van de te overdragen embryo's, waarnemen de turgidity en de kleur van de vulva's van de beschikbare seksueel volwassen 4,5 maanden oude vrouwelijke konijnen, en induceren ovulatie in de ontvankelijke dieren met een enkele intramusculaire injectie van een microgram buserelin acetaat, ongeacht het lichaamsgewicht. Spoel op de dag van de overdracht de verse of ontdooide embryo's in 37 graden Celsius basismedium onder een stereomicroscoop en bevestig een op de juiste wijze geconfigureerde 17-meter epidurale katheter aan een spuit van één milliliter. Spoel een centimeter basismedium in de katheter aan, gevolgd door een kleine luchtbel.Dan aspirate vijf tot zeven embryo's en 10 microliter van basismedium, gevolgd door een andere kleine luchtbel, en een laatste centimeter van de basis medium. Zodra de embryo's zijn geladen, plaats de verdoofde ontvanger konijn in een kooi op een warm podium, en van toepassing zalf op de ogen van het dier. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex scheert u de vacht uit de buik van de ventrale buik, reinigt u het chirurgische gebied met chloorhexidine gluconaatzeep en verwijdert u het resterende haar.Bedek het gebied met een steriele gordijn met een gat voor het chirurgische gebied, en steek een endoscopische trocar vijf centimeter in de buikholte, twee centimeter caudal aan het zyphoid proces, en gebruik een druk regulerende mechanische insufflator om de buikholte op te blazen. Steek de endoscoopcamera door de endoscopische trocar en steek de 17-meter epidurale naald in het inguinale gebied, twee tot drie centimeter van het infundibulum. Steek de geladen katheter door de epidurale naald in de buik en steek een tot twee centimeter van de epidurale katheter door het infundibulum in de ampulla.Druk de katheterzuiger voorzichtig in om de embryo's in het eivlies vrij te geven. Beide luchtbellen moeten uit de katheter komen. Verwijder de katheter net nadat de embryo's zijn vrijgegeven, en aspiraat en laat het resterende medium om de afwezigheid van de embryo's te bevestigen.Na bevestiging van een succesvolle overdracht van de embryo's, verwijder de epidurale naald en de endoscoopcamera en laat u de buikkoolstofdioxide vrij via de endoscopische trocar. Reinig de trocar-incisie met chlorhexidine-oplossing en sluit de wond met een gemicroniseerd aluminium en een plastic dressing. Behandel het dier vervolgens met de juiste antibiotica en pijnstillers en controleer het dier tot volledig herstel.Minimaal invasieve laparoscopische embryotransfer plaatst het konijn tot de beste diermodellen voor reproductieve studies, met een hoog percentage overgedragen verse embryo's resulterend in een pup. Met name worden hogere waarden bereikt wanneer de overdracht van verse embryo's wordt uitgevoerd met embryo's in het vroege of compacte morulaestadium. Vergelijkbare resultaten worden waargenomen na vroege en verdichte verglaasde konijnmorula-overdracht, met name met compacte morulae, wat de werkzaamheid en betrouwbaarheid van deze techniek voor het overbrengen van verse in-vitrified embryo's bij konijnen bevestigt.Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals voorwaardelijke ondersteunende reproductieve technologieën, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de toevoeging van dichtheden later in het leven een pijnstillend effect kan hebben. Na recente ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor wetenschappers op het gebied van voortplanting om dit effect bij de mens te onderzoeken op basis van de nauwe fylogenetische afstand tussen konijn en mens. Zo kan deze techniek resultaten leveren die gemakkelijk kunnen worden overgedragen op de menselijke klinische geneeskunde, evenals bij andere zoogdiersoorten.Vergeet niet dat onze methode een aantal hygiënische en economische voordelen biedt die voldoen aan het concept van drie R's van dierenwelzijn, vervanging, vermindering en verfijning, door het doel te bereiken om de menselijke behandeling van proefdieren te verbeteren.

minimally-invasive-embryo-transfer-embryo-vitrification-at-optimal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een ethyleen-glycol-gebaseerde methode voor verglazing muis embryo's wordt beschreven. Is het voordelig om andere methoden in zijn eenvoud en lage embryonale toxiciteit, en kan dus worden breed toepasbaar voor vele stammen van muizen, met inbegrip van inteelt en gen-gemodificeerde muizen.

Invriezen van embryo&#39;s door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

In this video, we describe the procedure for vitrification of harvested rabbit embryos at desired development stage using ethylene glycol and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants and cryogenic straw as the carrier system. The vitrified embryos have high survival rate and can be stored for an extended period until use.

Rabbit Embryo Vitrification Using Cryogenic Straw:  An Ultra-Rapid Cooling Technique to Preserve Rabbit Embryos for Long-term Storage

This video demonstrates the procedure for thawing vitrified rabbit embryos and the precautionary measurement steps for optimal embryo recovery.

Rabbit Embryo Thawing: A Warming Procedure to Recover Cryopreserved Rabbit Embryos for Embryo Transfer

This video describes the technique of transferring embryos into the oviduct of a recipient female rabbit via Laparoscopy. It allows embryo remodeling in rabbits during its migration through the oviduct, eventually helping in successful implantation. This technique can also be used for stored embryos with good efficiency.

Embryo Transfer Into Rabbit: A Procedure for Laparoscopy-Guided Transfer of Embryos Into Oviduct of Ovulating Recipient Female Rabbit Model

Recente ontwikkeling in gentargeting instrumenten maakt de productie van knock-out (KO) konijnen mogelijk. In het onderhavige werk, genereerden we vijf Apolipoprotein (Apo) C-III KO konijnen met behulp van Zinc Finger Nucleasen (ZFN). Dit werk heeft aangetoond dat ZFN is een zeer efficiënte methode om KO konijnen.

Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

MicroSecure Vitrification werd ontwikkeld als een niet-commercieel, aseptisch gesloten vitrificatieapparaatsysteem dat voldoet aan de FDA-normen voor goede fabricage- en weefselverwerkingspraktijken. Vanwege de terugtrekking van hydrofobe embryo-strohalmen met pluggen uit de industrie, werd de vitrificatieprocedure aangepast om een binnenste afdichting op te nemen vóór de standaard interne katoenen plug.

Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.

Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

Dit protocol beschrijft methodologieën om een eenvoudig en efficiënt in-vitromodel voor embryo-implantatie op te zetten voor het evalueren van de relevante moleculen die het embryo-implantatieproces beïnvloeden.

Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Dit protocol beschrijft een zwangerschaps- en voedingsmanagementtechniek voor embryo-overgeplaatste en genetisch gemodificeerde konijnen, gericht op het verminderen van de sterfte van pasgeboren konijnen en het verbeteren van de bereidingsefficiëntie van gen-bewerkte konijnen.

Zwangerschaps- en borstvoedingsmanagement voor embryo-overgeplaatste en genetisch gemodificeerde konijnen

Hier presenteren we het Spatel Montevideo-protocol voor het vitrificeren van pre-implantatie-embryo's bij muizen en schapen, bestaande uit een zelfgemaakte spatel en met behulp van zelfgemaakte oplossingen. Embryo's worden snel in evenwicht gebracht in twee cryoprotectieve oplossingen van toenemende concentratie, op de spatel geladen, ondergedompeld in vloeibare stikstof en ten slotte verzegeld met een rietje van 0,5 ml.

Spatel Montevideo Apparaat voor de verglazing van embryo's van zoogdieren

Leer een minimaal invasieve laparoscopische embryo-overdracht en cryopreservatie bij konijnen. Deze techniek biedt betrouwbare resultaten voor reproductief onderzoek en klinische toepassingen.

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Meer video's verkennen