De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van chemische ecologie, zoals de identificatie van feromonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het nieuwe verbindingen koppelt aan feromonenfunctie. Om deze procedure te beginnen, plaatst u 15-30 seksueel volwassen mannelijke zeelampreien in een tank gevuld met 250 liter belucht Lake Huron water, gehandhaafd op 16-18 graden Celsius.

Om het geconditioneerde water te extraheren door middel van vastefase-extractie, laat het vanuit de tank via het pompsysteem naar de bovenkant van de kolom stromen. Het water passeert door een bed van twee kilogram matig polaire, polymere ionenuitwisselingshars bevat in een reeks van vier glazen kolommen met een inhoud van één liter. Vervolgens verwijdert u het organische oplosmiddel en oogst u het extract door vijf uur lang onder verminderde druk bij 40 graden Celsius door rotatievevaporatie.

Om de fractiepools te isoleren, weekt u de silicagel in de initiële mobiele fase gedurende 30 minuten. Breng de gel met het oplosmiddel over naar een glazen kolom en open de klep om de mobiele fase erdoorheen te laten gaan. Meng vervolgens de extracten grondig met silicagel en laad ze in de vloeistofchromatografiekolom over het silicagelbed.

Elueer ze met een gradiënt van 95% chloroform-tot-methanol tot 100% methanol, resulterend in een totaal van 2,5 liter, en verzamel vervolgens het eluaat in afzonderlijke 10-milliliterflessen. Voer vervolgens het TLC-experiment uit op vooraf gecoate silicagelplaten door de monster aan te brengen op de startlijn en de startlijn van de plaat te onderdompelen in het ontwikkelingsolven in een afgesloten glazen tank. Nadat het ontwikkelingssolven de eindlijn heeft bereikt, haalt u de plaat uit de tank en wacht u 10 minuten tot het solvent is verdampt.

Beeld de vlekken eerst onder UV-licht bij 254 nanometer, en kleurt vervolgens de plaat door deze te besproeien met een zure methanoloplossing van 5% anisaldehyde met behulp van een chromatografiespuiter en het gedurende drie minuten op 85 graden Celsius te verwarmen. Concentreer vervolgens de fractie tot een residu door rotatievevaporatie onder verminderde druk bij 40 graden Celsius gedurende ongeveer 30 minuten. Om EOG-opname uit te voeren, vult u de gepolde capillaire elektroden en de elektrodendragers in vaste toestand, vooraf vervaardigd met zilver-zilverchloride pellets, met drie-molare kaliumchloride met behulp van een micropipet.

Voer vervolgens de gepolde elektroden in de elektrodendragers in. Bereid vervolgens 100 milliliter van 10 tot de min vijf-molar L-arginine in houtskoolgefilterd water voor uit een 10 tot de min twee-molar L-arginine stockoplossing in gedeïoniseerd water in een volumetrische kolf. Bereid voor de concentratieresponscurve 10 milliliter van 10-voudige verdunning van de fractiepools.

Richt nu een verdoofde lamprei in een V-vormige stand en wikkel deze met een natte papieren handdoek om uitdroging te voorkomen. Plaats een buis met gerecirculeerd, belucht water dat 50 milligram per liter MS222 bevat in de buccale holte. Pas de stroomsnelheid aan en zorg ervoor dat het water via de kieuwhoogten uittreedt om de kieuwen continu te irrigeren.

Spoel de geurleveringsbuis met gefilterd water en sluit deze aan op de klep gemonteerd op een micromanipulator. Plaats vervolgens de geurleveringskapillare buis in de holte van het reukepithelium om gefilterd water naar het reukepithelium te leveren om uitdroging te voorkomen wanneer geen geuren worden toegediend. Monteer vervolgens de opname- en referentie-elektroden op de micromanipulatoren.

Laat de referentie-elektrode zakken op de externe huid nabij de neusgaten. Laat met behulp van de stereoscopische microscoop de opname-elektrode de oppervlakte van het reukepithelium lichtjes aanraken. Vervolgens brengt u de opname van de geurleveringsbuis over van het achtergrondgefilterde water naar de 10 tot de min vijf-molar L-arginine oplossing.

Schakel de computer, versterker, filter en digitalisator in. Gebruik de software voor klepbesturing om de procedure te programmeren om een enkele vier seconden durende puls van een geur te bezorgen door het vakje van T1 aan te vinken, T in te stellen op vier seconden en het vakje van T2 aan te vinken. Stel in de software voor gegevensverwerving de verwervingsmodus in op een hogesnelheidsoscilloscoop. Klik op het pictogram Afspelen en klik vervolgens op Start in de klepbesturing om de geurpuls te activeren.

Begin met het opnemen van de blanco controle, L-arginine en vervolgens de geuren van lage naar hoge concentraties met een spoeling van twee minuten met gefilterd water tussen toepassingen. Om gedragsactieve fracties te identificeren, acclimatiseert u de seksueel volwassen vrouwelijke zeelamprei in de loslaten kooi in het doolhof gedurende vijf minuten. Laat de zeelamprei los en registreer de cumulatieve hoeveelheid tijd die de lamprei doorbrengt in het experimentele en controlekanaal, elk met rivierwater, gedurende 10 minuten.

Breng vervolgens de teststimuli toe op het willekeurig toegewezen experimentele kanaal in het voertuig naar het controlekanaal met behulp van peristaltiekpompen met constante snelheden van 200 milliliter per minuut gedurende vijf minuten, breng vervolgens de teststimuli toe in het voertuig gedurende nog eens 10 minuten en registreer de cumulatieve hoeveelheid tijd die de lamprei doorbrengt in de experimentele en controlekanalen. In deze procedure zuivert u de actieve fracties verder tot verbindingen met grootte-exclusiechromatografie met behulp van een sephadex LH-20 kolom. Bereid het monster voor in 0,5 milliliter van de initiële mobiele fase, laad het in de chloroform-tot-methanol kolom en vervolgens de methanolkolom, en elueer de actieve fracties om de verbinding op te leveren.

Los en verdun de gezuiverde verbinding in de initiële mobiele fase van HPLC op om een 10-microliteroplossing van ongeveer één microgram per milliliter te vormen. Breng vervolgens de monstersoplossing over naar de HPLC-buisjes en