Name: Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Leer myeloïde voorlopercellen isoleren uit muizenbeenmerg met MACS en FACS voor hematologie en immunologie. Dit protocol identificeert zes subsets voor RNA- en eiwitanalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van fondsen van de Raad van gouverneurs regeneratieve geneeskunde Instituut in het Cedars-Sinai Medical Center (HSG), een carrière in immunologie fellowship van de Amerikaanse vereniging van immunologen (aan AY en HSG) en een geleerde Award uit de American Society of Hematology (aan AY). Wij danken de Stroom Cytometry kern in het Cedars-Sinai Medical Center voor hulp bij FACS sorteren.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolatie van muis beenmerg en voorbereiding van een schorsing van één cel
<ol><li>De muis overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele euthanaseren.</li>
	<li>Plaats de euthanized muis op zijn rug en spuiten met 70% ethanol (EtOH). Het maken van een kleine (3-5 mm) incisie in elke hind-limb op de enkel niveau met behulp van scherpe, puntige schaar, en trek de huid omhoog naar het lichaam te verwijderen uit de benen en bloot de spieren en botten.</li>
	<li>Verwijder de spieren (quadriceps, hamstrings, enz.) uit de botten door ze te knippen met een schaar, na de richting van het bot. Wees voorzichtig niet te beschadigen de botten.</li>
	<li>Ontreddering van het dijbeen van de heupgewrichten en knip weg, het bindweefsel en de spieren aan het losmaken van de benen, voorzichtig niet te snijden in de botten.</li>
	<li>Verwijderen van de voeten door het dislocating van de enkels van de zijn verbeend, de botten in een buis of steriele PBS media plaatsen en vervoer ze op het ijs naar de kamer weefselkweek. Opmerking: Voor sommige andere toepassingen (bijvoorbeeld voortvloeiende macrofagen van totale beenmergcellen) is het mogelijk om de botten op ijs te verlaten voor een tijdje, maar voor voorlopercellen isolatie is het belangrijk om door te gaan zo snel mogelijk om te voorkomen dat Downregulatie van belangrijke oppervlakte markeringen (vooral CD115).</li>
	<li>In een kabinet bioveiligheid, Verwijder eventuele resterende weke delen uit de botten door wrijven ze met papieren zakdoekje. Opmerking: Het protocol moet worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid als een steriele steekproef vereist voor cel cultuur of in vivo tests na FACS sortering is. Als steriele cellen niet vereist zijn, kan het gehele proces worden uitgevoerd op de lab-Bank.</li>
	<li>Kort het onderdompelen van de botten in 70% EtOH desinfecteren van hen, en vervolgens in steriele PBS om ze te wassen.</li>
	<li>Scheiden van het dijbeen van de zijn verbeend en fibulas door te snijden door de knie en negeren de fibulas.</li>
	<li>Snijd de uiteinden van de botten met een scherpe schaar.</li>
	<li>Oogst beenmerg met koude steriel PBS als volgt totdat de botten worden wit weergegeven:<ol>
<li>Elk been greep met pincet en voeg een 26G naald verbonden met een 10 mL spuit met koude steriel PBS in de schacht van de bot aan het ene uiteinde.</li>
		<li>Houd het bot boven een tube van 50 mL centrifuge en spoelen van 2-5 mL PBS door het been om de oogst van het beenmerg.</li>
		<li>Oogst het merg uit alle 4 beenderen per muis (2 dijbeen en 2 zijn verbeend).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetteer zachtjes op en neer met een pipet 1 mL tot gedesag van het beenmerg tot een celsuspensie.</li>
	<li>Het beenmerg schorsing door een stuk van 30 μm nylon gaas te heffen van been stukken en aggregaten, waardoor het genereren van een enkel celsuspensie cel filteren.</li>
	<li>Centrifugeer de eencellige schorsing bij 280 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cel pellet in steriele kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA), met behulp van 5 mL buffer per muis (bijvoorbeeld 10 mL voor cellen gebundeld van de dijbeen en zijn verbeend van 2 muizen) kleuring.</li>
	<li>Neem een 10 μL hoeveelheid van het monster, meng dit met 10 μL Trypan blauw en belasting 10 μL van de resulterende Trypan Blue-geëtiketteerden monster op een hemocytometer. De cellen met behulp van een lichte Microscoop te tellen. Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd voor het tellen van betrouwbare, Verdun het monster vóór Trypan blauw toe te voegen.</li>
</ol>2. progenitor verrijking door magnetische-geactiveerde cel sorteren (MACS)
<ol><li>Centrifugeer het hele één celsuspensie (of net zoveel cellen als nodig zijn om te verkrijgen van de gewenste opbrengst) bij 280 x g gedurende 5 min bij 4° C en resuspendeer de pellet cel in 40 μL kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 cellen. Opmerking: Het is ook mogelijk gebruik van MACS buffer van de bloedlijn uitputting kit fabrikant (Zie Tabel van materialen) als alternatief voor de kleuring buffer.</li>
	<li>De uitputting van de bloedlijn volgens de aanwijzingen die bij de bloedlijn uitputting kit uitvoeren De volgende instructies gelden voor de kit gezien in de Tabel van materialen. Als een verschillende kit wordt gebruikt, volg de instructies van de fabrikant en gaat u verder met stap 2.3.<ol>
<li>10 μL Biotine-antilichaam cocktail per 107 cellen toevoegen, Meng door pipetteren en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Voeg 30 l kleuring buffer/MACS buffer per 107 cellen en meng.</li>
		<li>Voeg toe 20 μL anti-Biotine microbeads per 107 cellen. Meng goed en incubeer gedurende een extra 15 min bij 4 ° C. Opmerking: Vortex de microbeads voordat u deze toevoegt aan de cellen om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn verspreid.</li>
		<li>Voeg 1 mL buffer/MACS buffer per 107 cellen kleuring, centrifugeren van de cellen bij 280 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet cel in 500 μL kleuring buffer/MACS buffer voor maximaal 108 cellen. Voor meer dan 108 cellen, schaal omhoog de omvang van de buffer/MACS buffer dienovereenkomstig kleuring.</li>
		<li>Bereid het geautomatiseerde magnetische scheidingsteken volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Plaats de buis met de gelabelde cellen in het scheidingsteken en de negatieve selectie programma kiezen.</li>
		<li>Het verzamelen van de negatieve breuk, waarin de voorlopercellen verrijkte lineage-negatief (Lin-) cellen. Gooi het positieve gedeelte, waarin de magnetisch-Label lineage-positieve cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer de Lin- cellen bij 280 x g gedurende 5 min, en resuspendeer de pellet cel in 2 mL buffer/MACS buffer per muis (bijvoorbeeld 4 mL als beenmerg werd gebundeld van 2 muizen) kleuring. Opmerking: De pellet moet nu zijn wit in plaats van rood omdat de erythrocyten zijn uitgeput.</li>
	<li>Neem een 10 μL aliquoot van de Lin- -cellen, meng dit met 10 μL Trypan blauw en belasting 10 μL van de resulterende Trypan Blue-geëtiketteerden monster op een hemocytometer. De cellen met behulp van een lichte Microscoop te tellen. Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd voor het tellen van betrouwbare, Verdun het monster vóór Trypan blauw toe te voegen.</li>
</ol>3. myeloïde voorlopercellen identificatie en isolatie door fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS)
<ol><li>Label 9 microcentrifuge (1,5 of 2 mL) buizen voor: 1) onbevlekt cellen, 2-8) cellen één gekleurd met fluorophore-geconjugeerde antilichamen tegen FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C en CD115 voor selectie en compensatie van de spanning, en 9) monster cellen die moeten worden gekleurd met alle 7 antilichamen voor voorlopercellen identificatie en sorteren.</li>
	<li>100.000 cellen aan elk van de controle-buizen (buizen 1-8), en alle overige cellen (of minder indien gewenst) te distribueren aan het monsterbuisje (buis 9). Opmerking: Als het monstervolume groter dan 1,5-2 mL is, het kan noodzakelijk zijn de steekproef cellen verdelen over een tube van 15 mL, centrifugeer ze en resuspendeer de pellet (stap 3.3 hieronder) en de cellen vervolgens overbrengen in een microcentrifuge buis voor de opeenvolgende kleuring stappen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de controle buis pellets in 100 μl kleuring buffer (PBS + 0.5% FBS + 2 mM EDTA) en de Monster buis pellet in 100 μl kleuring buffer per 5 x 106 cellen (bijvoorbeeld 200 μl voor 1 x 107 cellen).</li>
	<li>2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 aan de FcγR één vlek buis en het monsterbuisje toevoegen. Vortex voorzichtig te mengen, en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Opmerking: Het is belangrijk om de cellen van het monster met het antilichaam FcγR (CD16/32) voorafgaand aan het toevoegen van de andere antistoffen om te voorkomen dat de wedstrijd als gevolg van niet-specifieke Fc-gemedieerde antilichaam-bindende vlek. Niet Incubeer de cellen met een FcγR blokkeren reagens.</li>
	<li>De andere antistoffen toevoegen aan de bijbehorende één vlek buizen (van elk 1 antilichaam) en het monsterbuisje (alle 6 antilichamen): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 en 4 μg/mL CD115-PE. Vortex zachtjes, en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>900 μL kleuring buffer de buizen van de controle en de kleuring buffer 1 mL per 107 cellen aan het monsterbuisje toevoegen. Centrifugeer de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet van de cel in de buffer kleuring: 200 μL per besturingselement buis, en 500 μL per 25 x 106 cellen in het monsterbuisje. De geresuspendeerde cellen omzetten in 5 mL FACS buizen. Opmerking: Als het monstervolume groter dan 1,5-2 mL is, het kan noodzakelijk zijn om de cellen naar een tube van 15 mL voor centrifugeren.</li>
	<li>Bereiden de stroom cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) volgens instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Onbevlekt en uitvoeren interne controle cellen via de cytometer van de stroom te richten aan de spanningen en de kleur compensaties gekleurd.</li>
	<li>Uitvoeren van de steekproef cellen, poort van de voorvader subsets als hieronder zijn geschetst, alsmede samengevatte in Figuur 2en indien gewenst, uitvoeren FACS sorteren om te isoleren van de relevante voorlopercellen subsets. Opmerking: Het is meestal nodig te verwerven van ongeveer 200.000 cellen te verkrijgen van ten minste 1.000 evenementen in elke voorlopercellen poort.<ol>
<li>Maak een stip plot van alle cellen, weergave van FSC-A (x-as) en SSC-A (y-as) en gate om vuil en dode cellen te sluiten = > "levende" cellen.</li>
		<li>Maak een stip plot van "levende" cellen, weergave van FSC-H (x-as) en FSC-W (y-as), en poort als u wilt uitsluiten van de paren = > live/singlet (FSC) poort.</li>
		<li>Maak een stip plot van leven/singlet (FSC) cellen, SSC-H (x-as) en SSC-W (y-as), weergeven en poort als u wilt uitsluiten van de paren = > live/singlet (FSC) / singlet (SSC) poort.</li>
		<li>Maak een stip plot van leven/singlet (FSC) / singlet (SSC) cellen, Sca-1 (x-as) en c-Kit (y-as), weergeven en poort naar Selecteer c-Kit+ Sca-1- cellen = > LKS- cellen.</li>
		<li>Maak een stip plot van LKS- cellen, worden CD34 getoond (x-as) en FcγR (y-as) en poort selecteren CD34+ FcγRlo cellen = > "CMPs", en CD34+ FcγRHallo cellen = > "GGP's". Opmerking: Het is belangrijk dat de poort van de "CMPs" en "GGP's" zo nauwkeurig mogelijk. Het is nuttig een kleurcorrectie dichtheid perceel of een contour plot voor nauwkeurige gating te gebruiken.</li>
		<li>Maak een stip plot van "CMPs", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren: Flt3+ CD115lo cellen = > CMP-Flt3+ CD115lo cellen, Flt3- CD115lo cellen = > CMP-Flt3- cellen, Flt3+ CD115Hallo cellen = > MDP's.
</li>
		<li>Maak een stip plot van "GGP's", worden Ly6C getoond (x-as) en FcγR (y-as) en poort selecteren Ly6C-cellen = > "GMP-Ly6C- cellen", en Ly6C+ cellen = > "GMP-Ly6C+ cellen".</li>
		<li>Maak een stip plot van "GMP-Ly6C- cellen", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren: Flt3- CD115lo cellen = > GGP.
</li>
		<li>Maak een stip plot van "GMP-Ly6C+ cellen", worden CD115 getoond (x-as) en Flt3 (y-as), en Tor om te selecteren: Flt3- CD115lo cellen = > GPs, Flt3- CD115Hallo cellen = > MPs + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gating strategie voor muis myeloïde voorlopercellen identificatie1 Weissman is de gouden standaard voor immunologen en Haematogen voor bijna 20 jaar, maar het is nu duidelijk dat de "CMP" en "GMP" poorten zeer heterogene en nauwkeuriger gating strategieën nodig. Het protocol dat wij hier hebben beschreven maakt de identificatie van oligopotent en geslacht-begaan deelverzamelingen in C57BL/6J muizen voor meer precieze kwantificering van specifieke myeloïde voorlopercellen en myelopoiesis traject...

Monocyten, neutrofielen en dendritische cellen (DC's) zijn myeloïde cellen die uit hematopoietische progenitorcellen, voornamelijk in het beenmerg, door een proces genaamd myelopoiesis voortvloeien. Gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) hebben het potentieel om te produceren myeloïde cellen, evenals megakaryocytes en erytrocyten, maar niet lymfoïde cellen. Granulocyt-monocyt progenitoren (GGP's), die zijn afgeleid van CMPs, produceren granulocyten en monocyten, maar Megakaryocyt en erytrocyt potentiële hebben verloren. Monocyten en klassieke en plasmacytoid DCs (cDCs/PDC's) wordt ook gedacht dat ze voortvloeien uit gemeenschappelijk progenitoren bekend als monocyt-DC progenitoren (MDP's), die worden geproduceerd door CMPs. geleidelijke beperking van de bloedlijn potentieel uiteindelijk in de bloedlijn-gepleegd resulteert progenitoren: granulocyt progenitorcellen, monocyt progenitoren en dendritische cel progenitoren (Figuur 1).
Weissman en collega's gemeld dat CMPs zijn gevonden in de Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo Fractie van muis beenmerg, terwijl GGP's zijn opgenomen in de LKS- -CD34+ FcγR Hallo breuk1. Deze "CMP" en "GMP" breuken zijn echter zeer heterogeen. Bijvoorbeeld, bevat de "GMP" breuk ook lineage-begaan granulocyt progenitoren en monocyt progenitoren1,2. MDP's gemeld afzonderlijk te worden CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitoren die ook uitdrukking geven aan CD34 en FcγR3,4. MDP's aanleiding geven tot cDC/pDC-producerende gemeenschappelijk DC progenitoren (CDP's), die zijn gemeld bij het uiten van lagere niveaus van c-Kit (CD117) en zijn niet opgenomen in de LKS- deel5.
Eerder werd aangenomen dat de monocyten ontstaan via een enkel traject (CMP-GMP-MDP-monocyt). Overeenstemming is met dit model, monocyt-begaan progenitoren geproduceerd door GGP's (genaamd monocyt progenitorcellen, MPs)2 en MDP's (genoemd gemeenschappelijk monocyt progenitorcellen, cMoPs)6 lijken te zijn dezelfde cellen op basis van gedeelde oppervlakte marker expressie . Echter we onlangs aangetoond dat monocyten onafhankelijk worden geproduceerd door GGP's en MDP's, en waren in staat om onderscheid te maken tussen MPs en cMoPs door eencellige RNA sequencing7.
We hebben onlangs gewijzigd de Weissman "CMP" en de "GMP" gating strategie ter identificatie van de 6 subfractions van C57BL/6J muis beenmerg met verschillende oligopotent en geslacht-begaan myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen. We eerst gemeld dat kleuring voor Ly6C en CD115 het isolement van oligopotent GGP's, evenals granulocyt progenitoren (GPs) en monocyt progenitoren (zowel MPs als cMoPs, die wij op dit moment niet te scheiden) vergunningen van de "GMP" breuk2 (LKS - CD34+ FcγRHallo poort; Figuur 1). Wij vervolgens aangetoond dat MDP's voornamelijk te in de "CMP" breuk vinden zijn (LKS- CD34+ FcγRlo gate), waarin ook Flt3+ CD115lo en Flt3- deelverzamelingen7 (Figuur 1 ). De CMP-Flt3+ CD115lo breuk levert zowel GGP's en MDP's bij adoptief overdracht. De CMP-Flt3- -subset bevat progenitoren die lijken te zijn van tussenproducten tussen CMP-Flt3+ CD115lo cellen en GGP's. In tegenstelling tot MDP's, zowel de CMP-Flt3+ CD115lo en CMP-Flt3- fracties ook beschikken over Megakaryocyt en erytrocyt potentiële.
Het is belangrijk op te merken echter dat er op dit moment onduidelijk of de fracties "CMP" progenitoren die echt zijn oligopotent (bijvoorbeeld individuele cellen binnen de CMP-Flt3+ CD115lo breuk die neutrofiele bezitten, bevatten monocyt, DC, Megakaryocyt en erytrocyt potentiële), of als alternatief, bestaan uit een mengsel van progenitoren met beperktere lineage potentieel. Kolonievormende assays (methylcellulose culturen) geopenbaard cellen met granulocyt (neutrofiele), erytrocyt, monocyt en Megakaryocyt potentiële (GEMM cellen) in de "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo en breuken van de CMP-Flt3- 1 ,7, maar niet mogelijk is de evaluatie van DC kansen. In tegenstelling, kolonievormende testen aangetoond dat het bestaan van oligopotent GGP's (progenitoren met neutrofiele én monocyt potentiële) in de "GMP" breuk1,2, en dit wordt ondersteund door recente eencellige Transcriptomic analyse8. Het is niet momenteel bekend, echter of deze oligopotent GGP's ook andere granulocyten (eosinofielen, basofielen en mast cellen produceren).
Op basis van deze studies, we laten nu zien kunnen hoe 7 oppervlakte markeringen (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C en CD115) worden gebruikt om te identificeren en deze 6 deelverzamelingen van oligopotent en myeloïde voorlopercellen lineage-begaan te isoleren. Het protocol hier beschreven kan worden toegepast voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten in muizen en moleculaire analyse (bulk en eencellige RNA sequencing, westelijke bevlekken, etc.).
Het protocol bestaat uit 3 fasen: 1) voorbereiding van een enkele celsuspensie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen (magnetische-geactiveerde cel Sorteren), en 3) identificatie en isolatie, indien gewenst, van voorlopercellen deelverzamelingen door stroom Cytometry (met een analyzer of een sorteerder, voorkomend). De eerste stap is het isolement van beenmergcellen van het dijbeen en zijn verbeend euthanized muizen en is vergelijkbaar met andere eerder beschreven protocollen9. Vervolgens wordt het monster verrijkt voor stuurpen en voorlopercellen cellen met behulp van een cocktail van antilichamen tegen cel oppervlakte markers van erytrocyten, neutrofiele granulocyten, monocyten, lymfocyten, enz., tot het afbreken van de gedifferentieerde cellen. Dit is niet verplicht, maar sterk aanbevolen voor het optimaliseren van de detectie van de deelverzamelingen van voorlopercellen, en aan het verminderen van de hoeveelheid antilichamen nodig voor identificatie van voorlopercellen en de tijd die nodig is voor de stroom cytometry. Het geslacht uitputting protocol hieronder beschrijft Magnetic-Activated cel sorteren (MACS) met behulp van een muis Lineage cel uitputting Kit (waarin biotinyleerd antilichamen tegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, en Ter-119, plus anti-Biotine microbeads) en een geautomatiseerde magnetische scheidingsteken. De laatste stap is de identificatie (en sorteren, indien gewenst) van de voorvader deelverzamelingen door stroom cytometry. Het antilichaam paneel hieronder beschreven (Zie ook tabel 1) is ontwikkeld om te worden gebruikt in een flow cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) met 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figuur 1: neutrofiele, monocyt en DC progenitoren en differentiatie trajecten. De onlangs herziene model van myelopoiesis7 is geïllustreerd, met de Weissman-poorten voor "CMPs" (blauw) en "GGP's" (groen)1 bedekt. Dit cijfer is gewijzigd van Yáñez et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&gamma;R; clone 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#101327</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#108114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>Cat#105820</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Cat#128012</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Cat#135506</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Gebruik het "deplete" programma</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 lasers, 15 kleuren</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 lasers, 13 kleuren</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>Voor verdere analyse van de.fcs-bestanden</td></tr></tbody></table>

identificatie en isolatie van de oligopotent en lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloïde voorlopercellen dat de opbrengst van neutrofiele granulocyten, monocyten en dendritische cellen (DC's) kunnen worden geïdentificeerd in en geïsoleerd uit het beenmerg van muizen voor hematologische en immunologische analyses. Bijvoorbeeld, kunnen studies naar de cellulaire en moleculaire eigenschappen van myeloïde voorlopercellen populaties onthullen mechanismen ten grondslag liggen aan de leukemische transformatie, of aantonen hoe het immuunsysteem reageert pathogen blootstelling. Eerder beschreven stroom cytometry strategieën voor identificatie van myeloïde voorlopercellen vooruitgang op vele terreinen hebt ingeschakeld, maar de breuken die zij identificeren zijn zeer heterogeen. De meest gebruikte gating strategieën definiëren beenmerg breuken die voor de gewenste populaties zijn verrijkt, maar ook grote aantallen van voorlopercellen "besmetten" bevatten. Onze recente studies hebben veel van deze heterogeniteit, opgelost en het protocol die wij hier presenteren toelaat het isolement van 6 subpopulaties van oligopotent en lineage-begaan myeloïde voorlopercellen van 2 eerder beschreven beenmerg breuken. Het protocol beschrijft 3 fasen: 1) isolatie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen door magnetische-geactiveerde cel sorteren (lineage uitputting door MACS) en 3) de identificatie van myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen door stroom cytometry (met inbegrip van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren, FACS, indien gewenst). Deze aanpak toelaat voorlopercellen kwantificering en isolatie voor allerlei toepassingen in vitro en in vivo , en al nieuwe inzicht in trajecten en mechanismen van neutrofiele monocyt en DC differentiatie heeft opgeleverd.

Met het protocol zoals hierboven beschreven, is het mogelijk te krijgen van ~ 100 miljoen cellen (met inbegrip van de rode bloedcellen of ~ 50 miljoen genucleëerde cellen) van zowel dijbeen en zijn verbeend (2 benen) van een C57BL/6J muis (6-8 weken oud, man of vrouw). 1-2 miljoen Lin- cellen kunnen worden geïsoleerd per muis door MACS uitputting van Lin+ cellen.
- Cellen vormt elk van de 6 myelo...

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Deze methode zou nuttig kunnen zijn voor hematologen en immunologen die de productie en functie van myeloïde cellen bestuderen, inclusief neutrofielen, monocyten en dendritische cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeuriger identificatie van myeloïde voorloperzets mogelijk maakt dan eerdere strategieën. Om beenmergcellen te verrijken voor voorlopers door middel van magnetisch-geactiveerde celsortering, of MACS, pellet de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 40 microliter MACS-kleuringsbuffer per een maal 10 tot de zevende beenmergcellen.Om gedifferentieerde lijn-positieve cellen te verminderen, voeg 10 microliter biotin antilichaamcocktail toe per een maal 10 tot de zevende cellen en meng door pipetteren gedurende een incubatie van 10 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voeg 30 microliter kleuringsbuffer toe per een maal 10 tot de zevende cellen met menging, gevolgd door 20 microliter anti-biotine microbeads per een maal 10 tot de zevende cellen. Na 15 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen met een milliliter kleuringsbuffer per een maal 10 tot de zevende cellen en resuspendeer het pellet in 500 micr

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een flow-cytometrische methode voor de identificatie en moleculaire analyse van differentiatie-fase-specifieke muriene erytroïde voorlopers en precursoren, direct in vers geoogste muis beenmerg, milt of foetale lever. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en de celgrootte.

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om Mesodermale Voorlopercellen (MPCs) te isoleren uit menselijk beenmerg (hBM). MPCs werden gekenmerkt door middel van flowcytometrie en nestine-expressie. Ze toonden het vermogen om aanleiding te geven tot exponentieel groeiende MSC-achtige celculturen terwijl ze hun angiogenesepotentieel behielden.

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Leer myeloïde voorlopercellen isoleren uit muizenbeenmerg met MACS en FACS voor hematologie en immunologie. Dit protocol identificeert zes subsets voor RNA- en eiwitanalyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Meer video's verkennen