Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Deze methode zou nuttig kunnen zijn voor hematologen en immunologen die de productie en functie van myeloïde cellen bestuderen, inclusief neutrofielen, monocyten en dendritische cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeuriger identificatie van myeloïde voorloperzets mogelijk maakt dan eerdere strategieën. Om beenmergcellen te verrijken voor voorlopers door middel van magnetisch-geactiveerde celsortering, of MACS, pellet de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 40 microliter MACS-kleuringsbuffer per een maal 10 tot de zevende beenmergcellen.

Om gedifferentieerde lijn-positieve cellen te verminderen, voeg 10 microliter biotin antilichaamcocktail toe per een maal 10 tot de zevende cellen en meng door pipetteren gedurende een incubatie van 10 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voeg 30 microliter kleuringsbuffer toe per een maal 10 tot de zevende cellen met menging, gevolgd door 20 microliter anti-biotine microbeads per een maal 10 tot de zevende cellen. Na 15 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen met een milliliter kleuringsbuffer per een maal 10 tot de zevende cellen en resuspendeer het pellet in 500 microliter verse kleuringsbuffer voor maximaal een maal 10 tot de achtste cellen.

Stel vervolgens de geautomatiseerde magnetische separator in volgens de instructies van de fabrikant en plaats de buis met gelabelde cellen in de separator. Begin het negatieve selectieprogramma om de negatieve fractie te verzamelen die de voorloperzets bevat die negatief zijn voor de lijn. Pellet de lijn-negatieve cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet, dat nu wit is, in twee milliliter kleuringsbuffer per muis voor het tellen.

Om de myeloïde voorloperzets te isoleren door FACS, voeg een maal 10 tot de vijfde lijn-negatieve cellen toe aan elk van de acht controle microcentrifugebuisjes voor spanningsselectie en kleurcompensatie en voeg de rest van het cellenmonster toe aan een negende microcentrifugebuisje voor kleuring met alle zeven van de oppervlaktemarker antilichamen van belang voor voorloperzets identificatie en sorteer. Pellet de cellen door centrifugatie en resuspendeer de controle pellets in 100 microliter FACS kleuringsbuffer en het experimentele monsterpellet in 100 microliter kleuringsbuffer per vijf maal 10 tot de zesde cellen. Voeg vervolgens anti-CD16/CD32 antilichaam toe aan de Fc gamma receptor enkelkleuringbuis en het monsterbuisje.

Vortex voorzichtig en incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voeg de andere antilichamen toe aan de overeenkomstige enkelkleuringbuisjes en het monsterbuisje en na voorzichtig vortexen, incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voeg 900 microliter kleuringsbuffer toe aan de controlebuizen en een milliliter kleuringsbuffer per een maal 10 tot de zevende cellen aan het monsterbuisje voor centrifugatie.

Resuspendeer de controle pellets in 200 microliter verse kleuringsbuffer per buis en het experimentele pellet in 500 microliter per 2,5 maal 10 tot de zevende cellen en breng de gelabelde cellen over naar individuele overeenkomstige vijf milliliter FACS buisjes. Stel vervolgens de flowcytometer in volgens standaard protocollen en gebruik de ongeverfde en enkel geverfde controles om de spanningen en de kleurcompensaties in te stellen. Om de myeloïde voorloperzets te identificeren en isoleren, laad het experimentele cellenmonster op de cytometer en creëer een voorwaartse spreidingsgebied versus zijwaartse spreidingsgebied plot, gating om de puinhopen en dode cellen uit te sluiten.

Creëer een voorwaartse spreidingshoogte versus voorwaartse spreidingsbreedte plot van de levende cellen en gate om de dubbels uit te sluiten. Herhaal dit proces met een zijwaartse spreidingshoogte versus zijwaartse spreidingsbreedte plot van de voorwaartse spreiding enkele cellen en gate om de dubbels uit te sluiten. Creëer een Sca-1 versus c-Kit plot en gate om de c-Kit positieve Sca-1 negatieve voorloperzets te selecteren.

Creëer vervolgens een CD-34 versus FC gamma receptor plot en gate om de gemengde gemeenschappelijke myeloïde voorloperzets en gemengde granulocyt monocyte voorloperzets populaties te selecteren. Het is belangrijk om de gemengde gemeenschappelijke myeloïde voorloperzets en gemengde granulocyt monocyte voorloperzets populaties zo nauwkeurig mogelijk te gaten. Het kan nuttig zijn om een pseudo-kleur dichtheidsplot of een contour plot te gebruiken voor een nauwkeuriger gating.

Gebruik de cellen in de gemengde gemeenschappelijke myeloïde voorloperzets gate om een CD115 versus Flt3 plot te creëren en gate om de gemeenschappelijke myeloïde voorloperzets Flt3 positieve CD115 lage cellen, de gemeenschappelijke myeloïde voorloperzets Flt3 negatieve CD115 lage cellen, en de Flt3 positieve CD115 hoge monocyt dendritische cel voorloperzets te selecteren. Gebruik de cellen in de gemengde granulocyt monocyte voorloperzets gate om een Ly6C versus FC Gamma receptor plot te creëren en gate om de Ly6C negatieve cellen en de Ly6C positieve cellen te selecteren. Creëer vervolgens een CD115 versus Flt3 plot voor elke gated gemengde granulocyt monocyte voorloperzets cel subpopulatie en gate de Ly6C negatieve Flt3 negatieve CD115 lage granulocyt monocyte voorloperzets, de Ly6C positieve Flt3 negatieve CD115 lage granulocyt voorloperzets, en de Ly6C positieve Flt3 negatieve CD115 hoge monocyt voorloperzets.

Maximale lijn-uitputting is efficiënt bij het verminderen van gedifferentieerde cellen en voor het verrijken van de c-Kit positieve voorloperzets. De lijn-negatieve fractie bevat nog steeds enkele c-Kit negatieve cellen, maar deze cellen zullen worden geëlimineerd in volgende flowcytometrie gating stappen. Voorloperzets opbrengsten na FACS sorteer kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte sorter instellingen, maar het zou mogelijk moeten zijn om tussen een tot vier maal 10 tot de vierde cellen per fractie van elke muis te verkrijgen met een post-sortering zuiverheid van meer dan 95% voor elke fractie.

Goede kleuring