Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Deze methode kan vragen beantwoorden over de interactie tussen gastheer en pathogeen en medicijnontdekking, zoals de belangrijkheid van verschillende virulentiefactoren en de mogelijkheid van kleine moleculen om de ontwikkeling te verbeteren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het plaatsvindt in een vloeibare vorm met kleine volumes. Om te beginnen, terwijl u werkt binnen een BSL 2 bioveiligheidskast, strekt P.aeruginosa van een bevroren voorraad uit op een LB Agar-plaat.

Bewaar de plaat gedurende 16 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en sla de plaat vervolgens op bij vier graden Celsius voor maximaal een week. Twee dagen voordat u de testplaten klaar maakt, gebruikt u een enkele kolonie van de plaat om drie tot vijf milliliter steriel LB-bouillon te inoculeren. Bewaar de cultuur gedurende 12 tot 16 uur bij 37 graden Celsius.

Nadat u het slow kill of SK-medium hebt voorbereid volgens het tekstprotocol, met 350 milliliter p. Aeruginosa uit de verse overnachtelijke LB-cultuur, zaait u elke 10 centimeter SK-plaat. Gebruik een steriele bacteriënverspreider om de bacteriën gelijkmatig te verspreiden en laat de platen drogen in de bioveiligheidskast.

Bewaar vervolgens de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Om meerdere RNAi-bacteriestammen tegelijkertijd in een enkele put van een 24-wels diepe puttenplaat te testen, inoculeert u een enkele kolonie van elk klon van eerder bereide RNAi-bevattende bacteriën in vier milliliter carbenicilline aangevuld LB. Plaats de platen in een schuddende incubator geoptimaliseerd voor multi-wels platen bij 37 graden Celsius en 950 tpm gedurende 16 uur en verzamel vervolgens de bacteriën door centrifugatie bij 2.000 g gedurende 5 minuten. Decanteer het supernatant door de plaat om te draaien en krachtig te schudden.

Gebruik 100 microliter S Basal om de RNAi-bacteriën te resuspenderen. Pipetteer de resuspendeerde bacteriën in een geschikt aantal putten van een multi-wels NGM-plaat aangevuld met IPTG en carbenicilline en laat de plaat drogen. Na het bereiden van L1-wormen volgens het tekstprotocol, bereidt u platen voor voor basisexperimenten door ongeveer 5.000 wormen per 10 centimeter plaat te pipetteren, gezaaid met RNAi of OP50 superfood.

Om een RNAi-screen in te stellen, pipetteer ongeveer 300 wormen per put in een 24-wels plaat gezaaid met RNAi. Als de gebruikte stam temperatuursterie is, bewaar de wormen gedurende ongeveer 16 uur bij 15 graden Celsius en breng ze vervolgens over naar 25 graden Celsius gedurende 44 uur om de ontwikkeling te voltooien en embryogenese te voorkomen. Om een vloeibare dodelijkheidstest uit te voeren, gebruikt u een celschraper om de P.aeruginosa van een SK-plaat te verwijderen en de bacteriën te resuspenderen in ongeveer 5 milliliter S.Basal.

Gebruik een spectrofotometer om de OD 600 van de bacteriesuspensie te meten. Bereid 24 milliliter verdunde voorraad van P.Aeruginosa in S.Basal bij een OD 600 gelijk aan 09, voeg vervolgens 21 milliliter vloeibaar SK-medium toe en breng met behulp van een multikanaals pipet 45 microliter bacteriën en medium over naar elke put van een 384-wels plaat. Was de wormen uit hun bron in een 50 milliliter conische buis en laat ze onder invloed van de zwaartekracht bezinken.

Aspireer het supernatant tot 5 milliliter en gebruik vervolgens een totaal van 50 milliliter S.Basal om de wormen te resuspenderen en herhaal de wassing nog twee keer. Gebruik een worm sorteerder om ongeveer 22 wormen in elke put van een 384-wels plaat te sorteren volgens het tekstprotocol en gebruik vervolgens een gasdoorlatende film om de plaat te verzegelen en incubeer deze gedurende 24 tot 48 uur bij 25 graden Celsius. Op het gewenste tijdstip, gebruik een microplate washer en S.Basal om de 384-wels plaat in totaal 5 keer te wassen.

Een van de gemakkelijkste fouten die gemaakt kunnen worden is om de 384-wels plaat te aspireren voordat de wormen volledig zijn bezonken. Het vergt oefening om nauwkeurig te zien of de wormen volledig zijn bezonken. Na de laatste wassing, aspireer het supernatant tot 20 microliter.

Voeg vervolgens 50 microliter van 98 micromolar nucleïnezuurkleuring per put toe, voor een uiteindelijke concentratie van 0,7 micromolar. Bewaar de plaat bij kamertemperatuur gedurende 12 tot 16 uur. Na de gewenste incubatieperiode, gebruik de microplate washer om de platen minimaal drie keer te wassen.

Voor gegevensverwerving, gebruik een spectrofotometer of een geautomatiseerde microscoop om zowel doorgelaten licht als fluorescentie af te beelden. Voeg een milliliter S Basal toe per put van een 24-wels plaat met 300 wormen per put. Schud de wormen voorzichtig door de plaat te schudden en draag de wormen over naar een lege, steriele 24 diepe wels plaat.

Laat de wormen ongeveer vijf minuten zwaar vallen. Aspireer het supernatant en laat ongeveer een milliliter per put achter. Voeg vervolgens 7 milliliter S Basal toe aan elke put. Herhaal de wassing nog twee keer en aspirieer na de laatste wassing alles behalve ongeveer 400 microliter supernatant.

Na het pipetten van de bacteriën in 384-wels platen om honger te voorkomen, gebruikt u de hersamplefunctie van de worm sorteerder om 22 wormen in elke put van een 384-wels plaat te sorteren. Voeg tenslotte na het sorteren kleine moleculen of andere experimentspecifieke materialen toe. Zoals geïllustreerd in deze grafiek, zal er, wanneer de stappen in deze video worden gevolgd, alleen een tijdsafhankelijke dodelijkheid van C.elegans worden waargenomen in de aanwezigheid van P.aeruginosa.

In tegenstelling hiermee, zal er in afwezigheid van essentiële bacteriële voedingssupplementen weinig tot geen dodelijkheid worden waargenomen. Zoals hier getoond, is de tweestaps incubatie van P.aeruginosa bij