Name: Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer een high-throughput, high-content screeningmethode voor gastheer-pathogeen interacties met C. elegans. Deze vloeistofgebaseerde techniek ondersteunt efficiënt geneesmiddelonderzoek en identificatie van therapeutische agentia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de preventie van kanker en de Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Stichting Onderzoek Grant C-1930, en door de nationale instituten van gezondheid K22 AI110552 toegekend aan NVK. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Let op: P. aeruginosa en E. faecalis zijn Biosafety Level 2 ziekteverwekkers, en juiste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om toevallige besmetting te voorkomen en om te minimaliseren van verontreiniging van oppervlakken. Alle media en materialen die in contact met ziekteverwekkers worden geleverd moeten worden gesteriliseerd en/of verwijderd. Verdere richtsnoeren zijn verkrijgbaar bij de CDC publicatie bioveiligheid in microbiologische en biomedische laboratoria (BMBL), 5e editie.
1. voorbereiding en onderhoud van P. aeruginosa
<ol><li>Streak P. aeruginosa uit een bevroren voorraad op een bord van de agar LB (lysogenie Bouillon). Incubeer 16 tot 24 h bij 37 ° C Opmerking: Voer P. aeruginosa experimenten binnenkant van een BSL-2 biologische veiligheidskast zodat steriliteit. Gebruiken passende veiligheidsmaatregelen om te minimaliseren van de kans van pathogene besmetting of verontreiniging.</li>
	<li>Overdracht van deze plaat tot 4 ° C. Deze plaat worden bewaard bij 4 ° C en gebruikt om te enten culturen voor maximaal een week. Na een week, ontsmetten en negeren de plaat en maken een nieuwe plaat van LB streak. Opmerking: P. aeruginosa virulentie vermindert na langdurige opslag.</li>
	<li>Twee dagen voor het opzetten van assay platen, beënten 3-5 mL steriele de pond-Bouillon met een één kolonie van P. aeruginosa van de plaat gemaakt in punt 1.1. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 tot 16 uur. Opmerking: Niet meer dan 16 h incuberen. In rijke vloeibare culturen begint P. aeruginosa PA14 lyse.</li>
	<li>Bereiden van steriele 10 cm platen met langzaam doden media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfaatbuffer (bedrag per liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) en KH2PO4 (1 M) 868 mL) en 18 g agar/L). Opmerking: Bereiden platen tevoren. Ze kunnen voor maximaal 3 weken worden opgeslagen in een luchtdichte verpakking bij 4 ° C.</li>
	<li>Elke 10 cm langzaam doden plaat (SK plaat) met 350 μL van P. aeruginosa uit verse overnachting LB cultuur zaad. Met behulp van een steriele bacteriële strooier, bacteriën gelijkmatig over de oppervlakte van media verspreid en laten drogen in een BSL-2 biologische veiligheidskast.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
</ol>2. voorbereiding van RNAi bacteriën
<ol><li>Streak uit of de gewenste stammen pin-overdracht van RNAi-bevattende bacteriën op LB agar platen met de juiste antibiotica (carbenicillin bij 100 µg/mL) en tetracycline bij 15 µg/mL voor Ahringer en Vidal bibliotheken uit een bevroren voorraad. Opmerking: Wanneer u werkt met nonpathogenic bacteriën, gebruik een BSL-2 A / B biologische veiligheidskast of een BSL-1 laminar flow hood om de steriliteit van de culturen en om te minimaliseren van de kans op kruisbesmetting van de bibliotheek.</li>
	<li>Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Bewaar de platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken.<ol>
<li>Na twee weken, het negeren van de platen en vervang ze met vers bereide platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test meerdere RNAi stammen parallel door het individueel het enten van een één kolonie van elke kloon in 4 mL voor carbenicillin-aangevuld LB in enig goed van een 24-well diep-well-plaat of in een steriele reageerbuis. Opmerking: Tetracycline heeft gemeld om de efficiëntie van RNAi. Gebruik het niet in deze media.</li>
	<li>Plaats 24-well diep goed platen in een schudden incubator geoptimaliseerd voor multiwell platen en Incubeer bij 37 ° C voor 16 h terwijl het schudden bij 950 rpm. Opmerking: Het is moeilijk te verkrijgen van uniforme bacteriegroei in multiwell platen met behulp van een conventionele schudden incubator. De schudden incubator moet kunnen schudden op minimaal 750 rpm in orde voor de culturen groeien goed. Bij gebrek aan een gespecialiseerde shaker is het mogelijk om te groeien van elke cultuur in een individuele buis. Culturen kunnen worden overgezet in de 24-well plaat voor centrifugeren daarna, indien gewenst.</li>
	<li>Het verzamelen van bacteriën door gedurende 5 minuten bij 2.000 x g centrifugeren.</li>
	<li>Decanteren supernatans dat door de plaat omkeren en schudden. Resuspendeer RNAi bacteriën in 100 µL van basale S (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 opgelost in 1 L ultrazuiver water en gesteriliseerd met autoclaaf).</li>
	<li>Pipetteer geresuspendeerde bacteriën in een passend aantal putjes van een multiwell plaat NGM (Nematode groei Media, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfaatbuffer (bedrag per liter: 132 milliliters K2HPO4 (1 M) en 868 mL KH2PO4 (1 M)), en de agar 18 g per liter water) aangevuld met IPTG (1 mM eindconcentratie) en carbenicillin (eindconcentratie is 100 μg/mL).<ol>
<li>Gebruik van NGM media 3,5 mL per putje van 6-well plaat, 1 mL per putje van de plaat van een 24-well of 150 µL per putje van 96-wells-plaat.</li>
		<li>Gebruik 100 μl per putje van bacteriën voor 6-well plaat; 50 μl per putje voor 24-well; of 20 μL per putje van 96-wells-plaat. Laten drogen. Opmerking: Drogen normaal wordt uitgevoerd in een steriele stroom kap ter bevordering van snelle, uniforme drogen. Uniforme drogen is heel belangrijk. Vermijd te veel drogen, als scheuren in de agar bevorderen gravende van wormen. Dit leidt tot het verliezen en de potentiële verstoppingen van vloeistof-handlingsystemen worm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De bereide platen onmiddellijk of bewaar ze bij 4 ° C voor maximaal twee weken voor later gebruik. Opmerking: Als u wilt voorkomen dat platen worden tegen het uitdrogen, zij kunnen worden verzegeld met kunststof paraffine film of geplaatst in een strak verzegelde container met vochtig keukenpapier.</li>
</ol>3. onderhoud en voorbereiding van C. elegans
Opmerking: Voordat de experimenten, genereren een gesynchroniseerde bevolking van gravid, volwassen hermafrodiete wormen als volgt.
<ol><li>Wassen gravid volwassenen (dat wil zeggen, met meerdere embryo's zichtbaar binnen de gonaden) van 4-6 10-cm NGM platen in een conische tube van 15 mL door toevoeging van 4 mL S basale plaat, wervelende zachtjes en vervolgens gieten in een conische tube van 15 mL.</li>
	<li>Pellet wormen via centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 30 seconden.</li>
	<li>Gecombineerd supernatant, het verzorgen niet te verstoren de worm-pellet.</li>
	<li>Voeg 3,5 mL worm bleekwater oplossing (eindconcentratie 0,5 M NaOH, 1% natriumhypochloriet, in steriel water) naar de worm pellet, en meng door het omkeren van 1 minuut.</li>
	<li>Kort vortex en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 30 seconden.</li>
	<li>Gecombineerd of decanteren van de bovendrijvende substantie, niet te verstoren de worm pellet verzorgen.</li>
	<li>Voeg 3,5 mL verse worm bleekwater oplossing naar de worm pellet.</li>
	<li>Krachtig mengen wormen in bleekwater oplossing. Periodiek (ongeveer elke tien seconden) visueel inspecteren wormen onder een Microscoop ontleden. Kijk voor worm nagelriemen te breken, het vrijgeven van eieren. Zodra de meeste van de volwassen wormen zijn opgeloste (~ 95%), verdund bleekmiddel tot 15 mL met basale S om te stoppen met spijsvertering. Opmerking: Eierschalen meer resistent zijn tegen dan volwassen weefsel bleekmiddel, maar ze kunnen worden ontbonden tijdens langdurige blootstelling. Ei ontbinding, niet bloot eieren om worm bleekwater oplossing voor langer dan 7 minuten. Als eierschalen overdreven zijn beschadigd, worden de embryo's zullen sterven.</li>
	<li>Pellet embryo's bij 1.000 x g gedurende 30 seconden en gecombineerd of decanteren in de bovendrijvende vloeistof zonder het verwijderen van de pellet van embryo's.</li>
	<li>Resuspendeer wormen in S basale tot een eindvolume van 15 mL tot Verdun resterende bleekwater oplossing.</li>
	<li>De stappen wassen (3.9-3.10) drie keer voor een totaal van 4 opeenvolgende wast.</li>
	<li>Na de vierde wash, gecombineerd supernatant en optellen tot 5 of 6 mL steriele S basale in de conische tube van 15 mL. Het doel is om embryo's tot een concentratie van ~ 50 wormen per µL resuspendeer. Opmerking: Het bedrag van de basale S hangt af van de grootte van de ei-pellet; Hoe groter de pellet, de meer basale S is noodzakelijk.</li>
	<li>Incubeer de conische buis 's nachts op een tafelblad rotator bij kamertemperatuur of 48 h bij 15 ° C. Larven zal uitkomen, maar larvale ontwikkeling zal in de L1-stadium (L1 diapauze) toe te schrijven aan de voedende ontbering arresteren.</li>
	<li>Onderzoeken van de embryo's onder een ontleden Microscoop om te verifiëren dat de meeste van hen hebben uitgekomen en gearresteerd in de L1-stadium van ontwikkeling.</li>
	<li>Bepaal de worm telling door 20 µL van worm prep en verdunnen het met 80 µL van basale S. Pipetteer 10 µL van verdunde worm oplossing direct op een lege NGM plaat. Herhaal 2 vaker.<ol>
<li>Tellen van de larven in elke vlek en bepalen van het gemiddelde aantal. Verdeel dit gemiddelde door 2 te verkrijgen van een geschatte aantal wormen per µL in de worm prep. Worm preps kunnen vervolgens worden gebruikt voor voortplanting platen of voor experimenten. Opmerking: Na 4-5 dagen, uitgehongerd larven zal beginnen te sterven; Gooi de prep op dit punt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor teeltmateriaal van de stam, Pipetteer een passend aantal L1 wormen (5.000-6.000) op 3-4 10-cm NGM platen met gespot geconcentreerd OP50 E. coli – "superfood" (E. coli OP50 gespot op 25 X concentratie (dat wil zeggen, 1 L van nachtelijke OP50 cultuur geteeld in LB opbrengsten 40 mL 25 X OP50 superfood); 2 mL deze geconcentreerde bacteriële suspensie zijn bevlekt op elke 10 cm NGM plaat).</li>
	<li>Platen om voor te bereiden experimenten, voert u een van de volgende handelingen (voor "Basisprotocol" gebruik 3.17.1 setup, voor de "RNAi scherm instellen" gebruik stappen 3.17.2 - 3.17.4 voorkomend):<ol>
<li>Pipetteer ~ 5.000 wormen/10 cm plaat met RNAi of OP50 superfood agarvoedingsbodem.</li>
		<li>Pipetteer ~ 500 wormen/putje in een 6-well plaat met RNAi agarvoedingsbodem.</li>
		<li>Pipetteer ~ 300 wormen/putje in een 24-well-plate bezaaid met RNAi.</li>
		<li>Pipetteer ~ 100 wormen/putje in een 96-wells-plaat met RNAi agarvoedingsbodem. Opmerking: Voor instructies over hoe RNAi was uitgezaaid Raadpleeg stappen 2,7-2,9 in voorbereiding van RNAi bacteriën.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als een vruchtbare stam van wormen wordt gebruikt, incubeer wormen bij 25 ° C gedurende ~ 44-48 h. Gebruik deze wormen zo spoedig mogelijk nadat de bevolking de juiste leeftijd heeft bereikt. Dit minimaliseert het effect van ei broedeieren binnen de wormen tijdens de test.</li>
	<li>Als de spanning wordt gebruikt is temperatuur-steriele (b.v., fer-15(b26); FEM-1(hc17) of glp-4(bn2)), incubeer wormen bij 15 ° C gedurende ~ 16 h en vervolgens overbrengen naar de 25 ° C voor 44 h ontwikkeling en embryogenese voorkomen.</li>
</ol>4. de vloeistof doden Assay Setup (basisprotocol)
Opmerking: Dit is een protocol voor een bacteriële stam en een bron van wormen.
<ol><li>Met behulp van een cel schraper, verwijder de P. aeruginosa uit een plaat van SK en resuspendeer ~ 5 mL S basale. Opschalen indien nodig. Meet de extinctie van de bacteriële suspensie met een spectrofotometer (OD600)</li>
	<li>Bereiden 24 mL verdunde voorraad van P. aeruginosa in basale S bij OD600 ≈ 0.09 (eindconcentratie is 3 X). 4.6.2 voor de uiteindelijke inhoud per putje zien, en schaal volume van bacteriële verdunning dienovereenkomstig.</li>
	<li>Voeg 21 mL vloeibare langzaam doden media (3 g NaCl, 3.5 g pepton/l aangevuld met CaCl2 en MgSO4 tot en met een eindconcentratie van 1 mM). Met behulp van een meerkanaalspipet, breng 45 µL van bacteriën en media aan elk putje van de plaat van een 384-well.</li>
	<li>Wassen van wormen uit hun bron (dat wil zeggen, stap 3.17.1) in een conische buis van 50 mL en toestaan van wormen te regelen onder zwaartekracht. Gecombineerd supernatant tot 5 mL. Resuspendeer in een totaal van 50 mL S basale.</li>
	<li>Herhaal stap 4.4 tweemaal.</li>
	<li>Met behulp van een worm sorter, sorteren ongeveer 22 wormen in elk putje van de plaat 384-well. Opmerking: De setup drops elke worm van ~1.1 µL van vloeistof. 22 wormen zal oplopen tot 25 µL, totale assay volume om 70 µL per putje.<ol>
<li>De uiteindelijke samenstelling van elk putje bestaat uit 70 µL. 45 µL van dit volume wordt toegevoegd als bacteriële medium (0.03 OD600 bacteriën in 24 µL S basale en 21 µL SK aangevuld met CaCl2 en MgSO4). De andere 25 µL is toegevoegd met de 22 wormen.</li>
		<li>Als de sorter gebruikt hier (Zie Tabel of Materials) is niet beschikbaar, wormen kunnen worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van 1 worm/µL in basale S en afgepipetteerde 25 µL per putje met behulp van een meerkanaalspipet. Resultaten kunnen echter toegenomen variabiliteit vertonen. Anderzijds is het mogelijk gebruik een peristaltische vloeistof dispenser, zoals beschreven door Leung en collega's19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de wormen zijn gesorteerd in de 384-well plaat, afdichting van de plaat met een gas-permeabele film en Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 24-48 uur.</li>
	<li>Gebruik op het gewenste tijdstip, een microplate wasmachine te wassen de 384-well plaat met S basale totaal 5 keer.<ol>
<li>Na de tweede wash, gecombineerd allermeest naar de media, platen met behulp van een microplate vortexer gedurende ten minste 30 seconden los van eventuele puin vanaf de onderkant van de putten te verlaten ~ 20 µL. krachtig schudden).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de laatste wash, aspirate supernatant tot 20 µL. toevoegen 50 µL van 0.98 µM nucleïnezuur vlek (Zie Tabel van materialen) / goed van de plaat 384-well voor een eindconcentratie van 0,7 µM.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur voor 12-16 h. Deze kleurstof zal alleen dode wormen vlekken. Na de gewenste incubatieperiode vlek wassen platen met de microplate-wasmachine te verwijderen van de eventuele overschrijding (minimaal 3 wasbeurten).</li>
	<li>Voor data-acquisitie, kunt een spectrofotometer of een geautomatiseerde microscope beeld doorvallend licht zowel fluorescentie (531 nm excitatie en 593 emissie).<ol>
<li>Gebruik een lage vergroting doelstelling om een afbeelding van de hele put worden vastgelegd.</li>
		<li>Anderzijds gebruiken stroom vermimetry. Deze techniek maakt gebruik van een groot object stroom cytometer als een worm fluorimeter, de grootte en de fluorescentie van hele organisme (dat wil zeggen, C. elegans) op een wijze die sterk gelijkt op cytometry van de stroom te meten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik van de software van de analyse van de geautomatiseerde beeld (zoals CellProfiler, een gratis image analyse studio op basis van MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>) voor het berekenen van de TL en totale worm gebieden per putje op onpartijdige wijze. Opmerking: Het quotiënt van deze getallen geeft de Fractie dood voor elk putje. Als men goed had 7 gekleurd wormen uit van 20 totaal, dan de dood van de Fractie bestaat uit 0.35 of 35%.<ol>
<li>Voorafgaand aan het eerste gebruik, moet de geautomatiseerde beeldverwerking pijpleiding worden gevalideerd door handmatige scoren. Dit wordt gedaan door het vergelijken van de resultaten van de geautomatiseerde pijpleiding aan scores verkregen door visueel inspecteren van beelden en breuken van dode wormen opnemen voor elk van hen. Het validatieproces zorgt ervoor dat de parameters voor de voorbewerking met imaging kloppen en de gegevens correct vertegenwoordigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. aanpassing voor meerdere Screening C. elegans stammen of Knockdowns (RNAi scherm Setup)
Opmerking: Dit is een scherm van de RNAi beschreven voor de installatie van een 24-well plaat.
<ol><li>Voeg 1 mL S basale per putje van de plaat van een 24-well (zie stap 3.17.3). Zachtjes doorroeren wormen door schudden van de plaat, dan wormen naar een leeg, steriel 24 diep-well-plate. Het toestaan van wormen te regelen zwaartekracht (~ 5 minuten).</li>
	<li>Gecombineerd supernatant, verlaten ongeveer 1 mL. Voeg 7 mL S basale aan elk putje.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1-5.2 een minimum van 2 vaker. Na de laatste wasbeurt, gecombineerd supernatant, ongeveer 400 µL verlaten.</li>
	<li>Met behulp van de functie van de Resampler van de worm sorter, sorteren 22 wormen uit de 24-well plaat worm suspensie in elk putje van de plaat van een 384-well (elk putje van een 24-well plaat opbrengsten 8-12 putjes van de plaat van een 384-well).<ol>
<li>Om te voorkomen dat de hongerdood, Pipetteer bacteriën in 384-Wells-platen (een spanning die dient uitsluitend als voedsel, zoals OP50, of een pathogene stam) vóór sortering. Opmerking: Pathogenen kunnen worden toegevoegd door volgende stappen 2.3-2.5 of 6.4-6.5 en voedselbron bacteriën kunnen worden verdund en toegevoegd door dezelfde regeling als voor P. aeruginosate volgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de wormen zijn gesorteerd in de 384-well plaat, kleine moleculen of andere experiment-specifieke materialen toevoegen.</li>
</ol>6. aanpassing voor E. faecalis
Opmerking: Alleen de verschillen ten opzichte van P. aeruginosa assay worden beschreven.
<ol><li>Voorbereiden van een nieuwe bron van E. faecalis door bacteriën uit een bevroren voorraad op een bord van de agar BHI (hersenen hart infusie) strepen en incubatie gedurende 16 tot 24 uur bij 37 ° C. Opmerking: Voer E. faecalis experimenten binnenkant van een BSL-2 biologische veiligheidskast zodat steriliteit. Gebruiken passende veiligheidsmaatregelen om te minimaliseren van de kans van pathogene besmetting of verontreiniging.</li>
	<li>Platen kunnen bij 4 ° C gedurende maximaal één week worden opgeslagen. Na deze periode wordt vervangen door een nieuwe plaat.</li>
	<li>De nacht voordat u sorteert wormen, beënten 3-5 mL steriele BHI met een één kolonie van E. faecalis. Incubeer 12-16 uur bij 37 ° C met agitatie.</li>
	<li>Breng bacteriën in de putjes wat P. aeruginosa (3 x bacteriën in basale S, OD600≈0.09). Opmerking: Voor E. faecalis, de uiteindelijke goed samenstelling is: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, met het resterende volume bestaat uit S basale. Vergeet niet dat 25 µL van S basale zal worden geleverd met wormen. Opmerking: E. faecalis produceert dikke biofilms die absorberen de fluorescerende vlek veroorzaakt onscherpe beelden. Uitgebreide wassen kan onvoldoende zijn om deze biofilm te verwijderen. In dit geval kunnen de wormen worden overgedragen aan een lege plaat met behulp van een meerkanaalspipet. Om te vergemakkelijken de overdracht, kan tween-20 worden toegevoegd aan basale S bij een eindconcentratie van 0,1% (v/v) Tween-20 in basale S. Dit helpt bij het verwijderen van de wormen uit de biofilm.</li>
</ol>

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij hebben geen conflicten van interesse bekend te maken.

Deze bepaling (of soortgelijke testen waar andere ziekteverwekkers worden vervangen door P. aeruginosa of E. faecalis) is handig voor allerlei doeleinden, met inbegrip van Geneesmiddelenontwikkeling. Het is ook nuttig voor het aanpakken van fundamentele biologische kwesties, zoals de identificatie van virulentiefactoren, het ontrafelen van host defense trajecten, en het bepalen van de regelgevende machine die betrokken zijn bij de host-pathogen interactions.
Hoewel de bepalin...

De identificatie en ontwikkeling van een effectief, breedspectrum antibiotica, inmiddels bijna een eeuw geleden, geleid tot een moment van de waterscheiding in de volksgezondheid waar er een wijdverbreide geloof dat besmettelijke ziekte zou een gesel van het verleden. Binnen een paar korte decennia begon dit optimisme te afnemen, als pathogeen nadat pathogen resistentie mechanismen die deze keer miraculeuze behandelingen beperkt ontwikkeld. Voor enige tijd leek de wapenwedloop tussen drug discovery inspanningen en de ziekteverwekkers evenwichtig. Echter, het misbruik van antimicrobiële middelen onlangs heeft geresulteerd in het ontstaan van pan-resistente stammen van Klebsiella pneumoniae, immunodeficientie baumanii, Serratia marcescensen P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa is een opportunistische, gram negatieve, meerdere host pathogenen die een ernstige bedreiging vormt voor patiënten met ernstige brandwonden, degenen die zijn immuungecompromitteerde, of cystic fibrosis. Het wordt ook in toenemende mate aangeduid als een ziekteverwekker in ernstige ziekenhuisinfecties, met name als gevolg van de voortdurende overname van antimicrobiële resistentie. Om te beginnen met het inspelen op deze dreiging, hebben we de goed gedocumenteerde C. elegans-P. aeruginosa infectie systeem5gebruikt. Onze lab heeft dit systeem voor de ontwikkeling van een vloeistof gebaseerde, high-throughput, hoge-content screening platform ter identificatie van nieuwe verbindingen die de mogelijkheid van het pathogene agens te doden de host6beperken leveraged. Deze verbindingen lijken intrigerend, tot ten minste drie algemene categorieën, met inbegrip van antimicrobiële stoffen7 en virulentie remmers8te behoren. Andere hoge-inhoud drug discovery testen in C. elegans voor Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, zijn gerapporteerd en Enterococcus faecalis, o.a.9,10,11,12,13,14,15,16. Deze types van tests hebben verschillende goed erkende voordelen, zoals het beperken van vals positieve hits die mogelijk toxisch voor zowel de host en de pathogenen, verhoogde kans op biologische beschikbaarheid ten opzichte van een chemische scherm, en het vermogen om te identificeren hits voorbij microbiële groei, zoals anti-virulents, immuun stimulerend moleculen of verbindingen die anders het kantelen van het saldo van de host-pathogen interactions ten gunste van de voormalige gewoon te beperken. Bovendien zijn de verbindingen ontdekt in deze schermen vaak effectief in zoogdieren hosts.
Het is vermeldenswaard dat ten minste twee andere testen17,18 zijn beschikbaar voor het verrichten van high-throughput schermen in C. elegans in vloeistof. Elk van deze tests is echter een wijziging waarmee de prototypische intestinale-kolonisatie assay, bekend als traag-doden, moet worden uitgevoerd in vloeibare, verhoging van de doorvoer en waardoor verbindingen gemakkelijker worden vertoond. Zorgvuldige karakterisering overtuigend heeft aangetoond dat de mechanismen van bacteriële virulentie tussen deze testen en onze vloeistof gebaseerde scherm7 verschillen. Aangezien beide soorten virulentie bij zoogdieren systemen worden waargenomen, is het belangrijk om na te gaan welke virulentie determinant meest relevant voor de de experimentator belangen vóór assay selectie.
Hier tonen we een geoptimaliseerde versie van de vloeistof gebaseerde C. elegans-P. aeruginosa assay. Ook melden wij de aanpassing van onze assay vloeistof gebaseerde methode om de gram-positieve bacteriële pathogenen Enterococcus faecalis. E. faecalis wordt met een toenemende bewapening van antimicrobiële resistentie trajecten1steeds meer als een bedreiging van ernstige nosocomiale geïdentificeerd zoals P. aeruginosa. Hoewel een vorige methode voor high-throughput screening van E. faecalis 14 bestaat, vereist het preinfection met het pathogene agens oplevert, die compliceert de procedure en verhoogt de kans op besmetting van apparatuur zoals de COPAS-FlowSort. Ons protocol elimineert de noodzaak voor pre-infectie, verbetering van de veiligheidsprofiel. Tot slot melden wij een middel waarmee ofwel van deze tests kunnen worden gecombineerd met het voeden van RNAi, waardoor de gebruiker kan zoeken voor gastheer factoren die een rol in de oprichting van spelen, of weerstand tegen infectie.

```html
<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Grote object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per liter: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 2,5 gram Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Fosfaatbuffer, en 973 mL milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per liter: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 3,5 gram Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Fosfaatbuffer, en 973 mL milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per liter:&nbsp; 3 gram NaCl, 3,5 gram Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Fosfaatbuffer, en 973 mL milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per 100 mL: 10 mL van 5 M NaOH-oplossing, 20 mL van 5% Natriumhypochlorietoplossing, en 70 mL sterieel water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per liter: 5,85 gram NaCl, 6 gram KH2PO4, 1 gram K2HPO4, en 1 Liter milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer</td><td></td><td></td><td>Hoeveelheid per liter: 132 mL van K2HPO4 (1M) en 868 mL van KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Natriumhypochlorietoplossing</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH-oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriestammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi-expresserende bacteriën (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wormstammen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>```

een high-throughput, high-inhoud, vloeistof gebaseerde c. elegans pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Het aantal nieuwe drugs geïdentificeerd door traditionele, in vitro schermen is afgenomen, vermindering van het succes van deze aanpak in de zoektocht naar nieuwe wapens ter bestrijding van meerdere resistentie. Dit heeft geleid tot de conclusie dat onderzoekers niet alleen maar hoeft te vinden van nieuwe geneesmiddelen, maar ook ontwikkelen van nieuwe manieren moeten van het vinden van hen. Onder de meest veelbelovende kandidaat methoden zijn geheel-organisme, in vivo onderzoek dat gebruik high-throughput, fenotypische uitlezingen en gastheren variërend van Caenorhabditis elegans tot Danio rerio. Deze hosts hebben verschillende krachtige voordelen, met inbegrip van dramatische vermindering valse positieve hits, zoals verbindingen die giftig voor de host en/of de biounavailable zijn vallen meestal in het eerste scherm, voorafgaand aan dure follow up.
Hier laten we zien hoe onze test is gebruikt om het ondervragen van host variatie in de goed gedocumenteerde C. elegans—Pseudomonas aeruginosa vloeibare doden pathosystem. We tonen ook diverse uitbreidingen van deze techniek goed uitgewerkt. Wij zijn bijvoorbeeld kunnen uitvoeren van high-throughput genetische schermen met behulp van RNAi in 24 - of 96-wells plaat formaten naar query gastheer factoren in deze host-pathogen interactions. Met behulp van deze test, kunnen hele genoom schermen worden uitgevoerd in slechts een paar maanden, die de taak van de identificatie van de doelstellingen van de drug, mogelijk zonder de noodzaak voor een aanpak van de moeizame biochemische zuivering dramatisch kunnen vereenvoudigen.
Ook rapporteren we hier een variatie op onze methode die de gram-positieve bacterie Enterococcus faecalis voor de gram-negatieve pathogen P. aeruginosa vervangt. Veel zoals het geval voor P. aeruginosa, is doden door E. faecalis afhankelijk van de tijd. In tegenstelling tot eerdere C. elegans—E. faecalis testen, onze assay voor E. faecalis geen preinfection vereist, verbetering van haar veiligheidsprofiel en vermindering van de kans op besmetting van de vloeistof-behandelingsapparatuur. De bepaling is zeer robuust, ~ 95% sterftecijfers 96 h post infectie tonen.

Belangrijke parameters voor assay prestaties
Een goed begrip van de biologie die ten grondslag liggen aan deze bepaling is noodzakelijk voor het oplossen van problemen en het optimaliseren van de bepaling. Te dien einde verwijzen we eerst naar verscheidene belangrijke papers ophelderen van de mechanismen van de pathogenese van P. aeruginosa-gemedieerde doden in vloeibare7,<sup...

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Deze methode kan vragen beantwoorden over de interactie tussen gastheer en pathogeen en medicijnontdekking, zoals de belangrijkheid van verschillende virulentiefactoren en de mogelijkheid van kleine moleculen om de ontwikkeling te verbeteren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het plaatsvindt in een vloeibare vorm met kleine volumes. Om te beginnen, terwijl u werkt binnen een BSL 2 bioveiligheidskast, strekt P.aeruginosa van een bevroren voorraad uit op een LB Agar-plaat.Bewaar de plaat gedurende 16 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en sla de plaat vervolgens op bij vier graden Celsius voor maximaal een week. Twee dagen voordat u de testplaten klaar maakt, gebruikt u een enkele kolonie van de plaat om drie tot vijf milliliter steriel LB-bouillon te inoculeren. Bewaar de cultuur gedurende 12 tot 16 uur bij 37 graden Celsius.Nadat u het slow kill of SK-medium hebt voorbereid volgens het tekstprotocol, met 350 milliliter p. Aeruginosa uit de verse overnachtelijke LB-cultuur, zaait u elke 10 centimeter SK-plaat. Gebruik een steriele bacteriënverspreider om de bacteriën gelijkmatig te verspreiden en laat de platen drogen in de bioveiligheidskast.Bewaar vervolgens de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Om meerdere RNAi-bacteriestammen tegelijkertijd in een enkele put van een 24-wels diepe puttenplaat te testen, inoculeert u een enkele kolonie van elk klon van eerder bereide RNAi-bevattende bacteriën in vier milliliter carbenicilline aangevuld LB. Plaats de platen in een schuddende incubator geoptimaliseerd voor multi-wels platen bij 37 graden Celsius en 950 tpm gedurende 16 uur en verzamel vervolgens de bacteriën door centrifugatie bij 2.000 g gedurende 5 minuten. Decanteer het supernatant door de plaat om te draaien en krachtig te schudden.Gebruik 100 microliter S Basal om de RNAi-bacteriën te resuspenderen. Pipetteer de resuspendeerde bacteriën in een geschikt aantal putten van een multi-wels NGM-plaat aangevuld met IPTG en carbenicilline en laat de plaat drogen. Na het bereiden van L1-wormen volgens het tekstprotocol, bereidt u platen voor voor basisexperimenten door ongeveer 5.000 wormen per 10 centimeter plaat te pipetteren, gezaaid met RNAi of OP50 superfood.Om een RNAi-screen in te stellen, pipetteer ongeveer 300 wormen per put in een 24-wels plaat gezaaid met RNAi. Als de gebruikte stam temperatuursterie is, bewaar de wormen gedurende ongeveer 16 uur bij 15 graden Celsius en breng ze vervolgens over naar 25 graden Celsius gedurende 44 uur om de ontwikkeling te voltooien en embryogenese te voorkomen. Om een vloeibare dodelijkheidstest uit te voeren, gebruikt u een celschraper om de P.aeruginosa van een SK-plaat te verwijderen en de bacteriën te resuspenderen in ongeveer 5 milliliter S.Basal.Gebruik een spectrofotometer om de OD 600 van de bacteriesuspensie te meten. Bereid 24 milliliter verdunde voorraad van P.Aeruginosa in S.Basal bij een OD 600 gelijk aan 09, voeg vervolgens 21 milliliter vloeibaar SK-medium toe en breng met behulp van een multikanaals pipet 45 microliter bacteriën en medium over naar elke put van een 384-wels plaat. Was de wormen uit hun bron in een 50 milliliter conische buis en laat ze onder invloed van de zwaartekracht bezinken.Aspireer het supernatant tot 5 milliliter en gebruik vervolgens een totaal van 50 milliliter S.Basal om de wormen te resuspenderen en herhaal de wassing nog twee keer. Gebruik een worm sorteerder om ongeveer 22 wormen in elke put van een 384-wels plaat te sorteren volgens het tekstprotocol en gebruik vervolgens een gasdoorlatende film om de plaat te verzegelen en incubeer deze gedurende 24 tot 48 uur bij 25 graden Celsius. Op het gewenste tijdstip, gebruik een microplate washer en S.Basal om de 384-wels plaat in totaal 5 keer te wassen.Een van de gemakkelijkste fouten die gemaakt kunnen worden is om de 384-wels plaat te aspireren voordat de wormen volledig zijn bezonken. Het vergt oefening om nauwkeurig te zien of de wormen volledig zijn bezonken. Na de laatste wassing, aspireer het supernatant tot 20 microliter.Voeg vervolgens 50 microliter van 98 micromolar nucleïnezuurkleuring per put toe, voor een uiteindelijke concentratie van 0,7 micromolar. Bewaar de plaat bij kamertemperatuur gedurende 12 tot 16 uur. Na de gewenste incubatieperiode, gebruik de microplate washer om de platen minimaal drie keer te wassen.Voor gegevensverwerving, gebruik een spectrofotometer of een geautomatiseerde microscoop om zowel doorgelaten licht als fluorescentie af te beelden. Voeg een milliliter S Basal toe per put van een 24-wels plaat met 300 wormen per put. Schud de wormen voorzichtig door de plaat te schudden en draag de wormen over naar een lege, steriele 24 diepe wels plaat.Laat de wormen ongeveer vijf minuten zwaar vallen. Aspireer het supernatant en laat ongeveer een milliliter per put achter. Voeg vervolgens 7 milliliter S Basal toe aan elke put. Herhaal de wassing nog twee keer en aspirieer na de laatste wassing alles behalve ongeveer 400 microliter supernatant.Na het pipetten van de bacteriën in 384-wels platen om honger te voorkomen, gebruikt u de hersamplefunctie van de worm sorteerder om 22 wormen in elke put van een 384-wels plaat te sorteren. Voeg tenslotte na het sorteren kleine moleculen of andere experimentspecifieke materialen toe. Zoals geïllustreerd in deze grafiek, zal er, wanneer de stappen in deze video worden gevolgd, alleen een tijdsafhankelijke dodelijkheid van C.elegans worden waargenomen in de aanwezigheid van P.aeruginosa.In tegenstelling hiermee, zal er in afwezigheid van essentiële bacteriële voedingssupplementen weinig tot geen dodelijkheid worden waargenomen. Zoals hier getoond, is de tweestaps incubatie van P.aeruginosa bij

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

Onderzoekers kunnen on-demand beweging in C. elegans activeren door een elektrisch veld toe te passen dat wormen voelen en erop reageren.  Deze video introduceert elektrotactisch gedrag en toont een voorbeeldprotocol dat wordt uitgevoerd in een microfluïdisch apparaat.

Electrotaxis Assay: een methode om voortbeweging te observeren in C. elegans

Source: Anderson, Q. L. et al. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a high-throughput screening method using Caenorhabditis elegans to study gene knockdowns during host-pathogen interactions. It outlines the procedure for preparing knockdown worms and transferring them to assay plates to evaluate the effects of pathogen-induced worm killing.

A Multiwell Liquid-Based Assay for Screening C. elegans Knockdowns

Source: Anderson, Q. L., et al. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a liquid-based assay where genetically modified C. elegans larvae are exposed to pathogenic bacteria in a microplate. Bacterial toxins secreted into the medium induce host stress and death. A fluorescent dye stains dead worms, allowing imaging-based quantification of mortality to assess genetic susceptibility or resistance.

Assessing Pathogenic Bacteria–Induced Mortality in C. elegans Larvae

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Dit protocol beschrijft op microfluïdische wijze gebaseerde C. elegans time-lapse-beeldvorming gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling.

Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Leer een high-throughput, high-content screeningmethode voor gastheer-pathogeen interacties met C. elegans. Deze vloeistofgebaseerde techniek ondersteunt efficiënt geneesmiddelonderzoek en identificatie van therapeutische agentia.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Meer video's verkennen