Name: Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer een spectrofotometrische methode om fykobilineiwitten in het modelcyanobacterium Synechocystis te kwantificeren. Dit protocol biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoek naar lichtopvang-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het protocol goedgekeurd van een eerdere publicatie11. T. Z., D. Ch. en J. Č. werden ondersteund door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport van de Tsjechische Republiek binnen het nationale programma voor duurzaamheid ik (Binengrenzen ik), nummer LO1415 te verlenen. J. Č. werd ook ondersteund door GA CR, Grant nummer 18-24397S. Toegang tot instrumenten en andere faciliteiten werd gesteund door de Tsjechische onderzoeksinfrastructuur voor systeembiologie C4SYS (project geen LM2015055). M. A. S. werd gesteund door een subsidie van de Russische Science Foundation [nr. 14-14-00904].

1. cyanobacteriën teelt

<ol><li>Cultiveren van Synechocystis cellen in conische kolven of in photobioreactors10,19 in gebufferde BG11 middellange20 te handhaven een pH van < 10 (bijvoorbeeldmet behulp van 17 mM HEPES10). Opmerking: Standaard teelt omstandigheden vereisen een gecontroleerde temperatuur (meestal 30 ° C, de optimale temperatuur is 35 ° C)21, verlichting (meestal een witte licht met een intensiteit tot 800 µmol [fotonen] / [m2·s])21, en een CO levering van de 2 (in de flat-panel photobioreactor van 400 mL, is de groei verzadigen van CO2 -concentratie 1.700 ppm)21.</li>
	<li>Om te bepalen van de dichtheid van de cultuur, het meten van de extinctie van de cultuur spectrophotometrically op 730 nm (OD730) met behulp van een cuvet met een lichtpad van 1 cm. u kunt ook de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel tellen teller.</li>
</ol>2. monsters voorbereiding
<ol><li>Werken onder lage bestralingssterkte om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein.</li>
	<li>Oogst 3 x 1 mL cultuur schorsing safe-lock buizen. Gebruik triplicates voor de schatting van technische fouten in de meting. Voor het uitvoeren van de bemonstering van de cultuur onder steriele omstandigheden, oogsten van de cellen in een laminaire kap en volgen van de goede praktijken van de arbeids- en veiligheid.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 minuten aandacht besteden aan de evenwichtige centrifugerotor. Na het centrifugeren, gooi het supernatant. Zorg dat u niet te verstoren de pellet.</li>
	<li>Zet de monsters in een vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C. Dit is noodzakelijk om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein. -20 ° C is op korte termijn opslag, voldoende.</li>
	<li>Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor freeze-dryer onder-60 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.</li>
	<li>Na het beëindigen van de freeze-drying cyclus, sluit u de buis zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de reabsorptie van water uit de lucht.</li>
</ol>3. cel homogenisering en pigmenten extractie
<ol><li>Vier stuks glaskralen (met een diameter van 2 mm) toevoegen aan elke Monster buis en sluit de buizen. Opmerking: Wanneer het deksel van de buis van de safe-lock gebruikt voor homogenisering te dun is, het kan breken tijdens de homogenisering; Daarom worden alleen safe-lock buizen met sterke deksels aanbevolen voor dit protocol.</li>
	<li>Meng de monsters met de glasparels voor 15 s op een homogenizer bij laboratorium temperatuur. Opmerking: Een goed gehomogeniseerde monster is verspreid over de gehele binnenzijde van de safe-lock buizen.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS buffer (pH 7.4), precooled tot 4 ° C, om de monsters te uittreksel van phycobiliproteïnen. Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de monsters op het ijs om te voorkomen dat de afbraak van de uitgepakte eiwitten. Dit is van cruciaal belang.</li>
	<li>Meng de monsters met PBS gedurende 5 s op de homogenizer bij laboratorium temperatuur. Opmerking: Na het mengen, de monsters zijn groenachtig.</li>
	<li>Na het mengen, houd de monsters op ijs voor 60 min. Cover het ijsbad met een deksel om te voorkomen dat de aantasting van de pigmenten.</li>
	<li>Centrifugeer na 60 min van phycobiliprotein extractie, de monsters bij 15.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten aandacht besteden aan goed het evenwicht van de centrifugerotor. Opmerking: Na het centrifugeren, het supernatant heeft een cyaan-blauwe kleur.</li>
</ol>4. Phycobiliprotein kwantificering
<ol><li>Kalibreren voor de spectrofotometrische meting, de spectrofotometer aan de basislijn met behulp van de PBS-buffer als een leeg.</li>
	<li>Zodra de spectrofotometer is gekalibreerd, negeren de PBS van een spectrofotometer cuvette en Pipetteer het supernatant met uitgepakte phycobiliproteïnen in plaats van met de afgedankte buffer.</li>
	<li>Kwantificeren van de concentratie van phycobiliprotein spectrophotometrically, met een breedte van de gleuf van 0,5 nm.<ol>
<li>Meet de extinctie van de phycocyanobilins in phycocyanin en allophycocyanin tegen de PBS buffer leeg op 615 nm (een615) en 652 nm (een652), respectievelijk, en meet de extinctie van de cellulaire puin op 720 nm (een720).</li>
		<li>Bereken de concentratie Bennett en Bogorad12van phycocyanin en allophycocyanin volgens de vergelijkingen (1) en (2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq2.jpg"> Opmerking: Een615, een652en een720 moeten aanpassen aan het bereik van de lineaire absorptie van de spectrofotometer valt. Eventueel verdunnen het monster met PBS buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berekenen van de concentratie van pigment in de originele exemplaren. De concentratie pigment in de steekproef komt overeen met de resultaten van vergelijkingen (1) en (2) wanneer cultuur 1 mL en 1 mL van de extractie-buffer worden gebruikt voor de analyse. In het geval van het gebruik van verschillende volumes van cyanobacteriën monsters en/of PBS buffer, moet de definitieve pigment-concentratie worden berekend volgens vergelijking (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq3.jpg">(3) Opmerking: In geval van een normalisatie phycobiliprotein inhoud per cel drooggewicht, de definitieve pigment-concentratie moet worden berekend volgens vergelijking (4)<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq4.jpg"> </img> (4)</li>
</ol>5. de bepaling van de cel droge gewicht (optioneel)
<ol><li>Weeg drie lege safe-lock buizen op analytische saldi. Let op: Het is essentieel dat de safe-lock buizen droog zijn. In het geval van het opslaan van drogen de buizen in een vochtige omgeving, de buizen voor enkele uren in een bevriezing van de droger alvorens met een gewicht van hen. Manipuleren van de buizen voorzichtig en alleen met poedervrije gehandschoende handen om te voorkomen dat ieder contact tussen het materiaal en het researcher's vingers. Houd alle houders en centrifugeer schoon om te voorkomen dat de overdracht van enig materiaal aan de buizen.</li>
	<li>Monster 1 x 15 mL van de cultuur schorsing aan 15 mL conische buis.</li>
	<li>Centrifugeren van de suspensie van de cultuur in de 15 mL conische buisjes bij 4000 x g bij laboratorium temperatuur voor 10 min. saldo de centrifugerotor met drie extra 15 mL conische buizen, elk met 15 mL water. Werp 12 mL van het supernatans dat na het centrifugeren.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in het resterende supernatant en breng 3 x 1 mL van het mengsel drie 1.5-mL safe-lock buizen met een pipet. In het geval dat wat restjes van de pellet blijven in de conische buis 15 mL, voeg 1,5 mL gedeïoniseerd water aan de conische buis, vortex of schud de buis te resuspendeer de resterende pellet en 3 x 0,5 mL van het mengsel aan de drie 1.5-mL safe-lock buizen (al containi ng 3 x 1 mL van de pellet) met een pipet. Nota: De pellet te verdelen over drie 1.5-mL safe-lock buizen zal toestaan de schatting van een technische fout van het droge gewicht meten.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen in 1.5-mL safe-lock buizen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur voor 5 min. saldo de centrifugerotor met een extra 1.5-mL safe-lock buis waarin 1 mL water. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.</li>
	<li>Zet de monsters in de vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C; voor de korte termijn opslag is-20 ° C voldoende.</li>
	<li>Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor bevriezen droger lager dan-90 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.</li>
	<li>Na het vriesdrogen, sluit de buizen en wegen van de monsters op analytische saldi. Opmerking: De waarde van het droge gewicht kan worden gebruikt voor de normalisatie van de inhoud van de phycobiliprotein per cel drooggewicht.</li>
</ol>

<ol><li>Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMimuro%2C+M+%22Light-Harvesting+Antennas+in+Photosynthesis%22">Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis</a>. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).</li>
<li>Spear-bernstein, L., Miller, K. R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1529-8817.1989.tb00245.x">Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae.</a> Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).</li>
<li>Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+photosynthetic+efficiency+and+culture+productivity+in+cyanobacteria+upon+minimizing+the+phycobilisome+light-harvesting+antenna+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).</li>
<li>Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+photoautotrophic+productivity+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803+by+phycobilisome+antenna+truncation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).</li>
<li>Sonani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+production%2C+purification+and+applications+of+phycobiliproteins%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100(2016).</li>
<li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBryant%2C+DA+%22The+Molecular+Biology+of+Cyanobacteria%22">The Molecular Biology of Cyanobacteria</a>. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+the+genome+of+the+unicellular+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803.+I.+Sequence+features+in+the+1+Mb+region+from+map+positions+64%25+to+92%25+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome.</a> DNA Research. 2, 191-198 (1995).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+the+genome+of+the+unicellular+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803.+II.+Sequence+determination+of+the+entire+genome+and+assignment+of+potential+protein-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions.</a> DNA Research. 3, 109-136 (1996).</li>
<li>Grigorieva, G., Shestakov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).</li>
<li>Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elsc.201300165">Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor.</a> Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).</li>
<li>Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+substrains+reveals+differences+in+sensitivity+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress.</a> PLoS One. 12 (12), e0189130(2017).</li>
<li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4199659">Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga.</a> The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).</li>
<li>Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s003000100260">Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens.</a> Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).</li>
<li>Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+LV+%22Experimental+Phycology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Experimental Phycology: A Laboratory Manual</a>. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).</li>
<li>Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+estimating+R-phycoerythrin+and+R-phycocyanin+contents+from+crude+aqueous+extracts+of+Porphyra+%28Bangiales%2C+Rhodophyta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta).</a> Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).</li>
<li>Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Photokinesis-of-Cyanobacterium-Synechocystis-sp-.-Chung-Park/b66f59879db22c4e15684819fb355a59668aee11">Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).</li>
<li>Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSun%2C+L+%22Handbook+on+Cyanobacteria%3A+Biochemistry%2C+Biotechnology+and+Applications%22">Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications</a>. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).</li>
<li>Six, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+phycobilisomes+in+marine+Synechococcus+spp.%3A+A+comparative+genomics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study.</a> Genome Biology. 8 (12), (2007).</li>
<li>Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+dynamics+and+constraints+of+batch+culture+growth+of+the+cyanobacterium+Cyanothece+sp.+ATCC+51142%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142.</a> Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).</li>
<li>Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+unicellular+blue-green+algae+%28order+Chroococcales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales).</a> Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).</li>
<li>Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elsc.201300165">Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor.</a> Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).</li>
<li>Hemlata, G., Fareha, B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287176545_Studies_on_Anabaena_sp_NCCU-9_with_special_reference_to_phycocyanin">Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin.</a> Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).</li>
<li>Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jctb.507">Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima.</a> Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-Containing+Allophycocyanin+Purified+from+Selenium-Enriched+Spirulina+platensis+Attenuates+AAPH-Induced+Oxidative+Stress+in+Human+Erythrocytes+through+Inhibition+of+ROS+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).</li>
<li>Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photobioreactor+system+for+precision+cultivation+of+photoautotrophic+microorganisms+and+for+high-content+analysis+of+suspension+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).</li>
<li>Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+evaluation+of+ethylene+production+in+the+recombinant+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+harboring+the+ethylene-forming+enzyme+by+membrane+inlet+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry.</a> Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3843705">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-010-9600-0">Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts.</a> Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24760817">Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity.</a> Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).</li>
<li>Seo, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isolation+of+phycocyanin+from+Spirulina+platensis+associated+with+high-pressure+extraction+process%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).</li>
<li>Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioenergetic+assessment+of+photosynthetic+growth+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+in+continuous+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures.</a> Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133(2015).</li>
<li>Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high+pH+on+growth+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+cultures+and+their+contamination+by+golden+algae+%28Poterioochromonas+sp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).</li>
<li>Ishii, A., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AbrB-Like+Transcriptional+Regulator%2C+Sll0822%2C+Is+Essential+for+the+Activation+of+Nitrogen-Regulated+Genes+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en reproduceerbare methode voor de kwantificering van phycobiliprotein inhoud in de model cyanobacterium Synechocystis. Verschillende methoden van cel homogenisering, eiwit extractie en phycocyanin en allophycocyanin kwantificering worden vergeleken, en het laatste protocol is een combinatie van de optimale stappen van elke één procedure. Als representatieve gegevens, was de inhoud van phycobiliproteïnen gekwantificeerd in Synechocystis cellen onder toeneme...

fPhycobiliproteins zijn wateroplosbaar pigment-eiwitcomplexen die belangrijke componenten van de antennes licht-oogst in prokaryotische cyanobacteriën (Cyanophyceen) en diverse eukaryotic taxa (Glaucophyta, Rhodophyta vertegenwoordigen , en Cryptophyta)1. Ze ontstaan voornamelijk supramoleculaire complexen genaamd phycobilisomes en ze zijn meestal gekoppeld aan het oppervlak van de fotosynthetische membranen op de stromale kant, met uitzondering van Cryptophyta, waar de phycobiliproteïnen zijn gelokaliseerd in de thylakoïde lumen2. Vier soorten phycobiliproteïnen up-to-date zijn geïdentificeerd: de kern-allophycocyanin, en de perifere phycocyanin, phycoerythrin en phycoerythrocyanin1. Als de belangrijkste licht-oogst complexen vormen phycobilisomes een van de cruciale factoren van algen en cyanobacteriën massa culturen productiviteit. Het is aangetoond dat phycobilisomes afkappen biomassa accumulatie onder sterke licht3kunt verbeteren. Aan de andere kant onder bescheiden of lage bestralingssterkte resulteerde de antenne truncatie in groeicijfers en biomassa accumulatie vermindering3,4. Phycobiliproteïnen worden commercieel gebruikt als voedsel kleurstoffen, geneesmiddelen en additieven in de cosmetische industrie, en als fluorescentie sondes met toepassingen in stroom cytometry, fluorescerende immunoassay en fluorescentie microscopie5.
Dit protocol is gericht op de kwantitatieve bepaling van phycobiliproteïnen in het model cyanobacterium Synechocystis. Blauwalgen zijn de vroegste Oxygene fotosynthetische autotrophs; ze hebben de vorming van de aardse biosfeer voor meer dan 2,4 miljard jaar6. Ze spelen een cruciale rol in wereldwijde biogeochemische cycli van koolstof, stikstof, zuurstof en andere elementen. Onder cyanobacteriën, een eencellige stam Synechocystis een unieke positie verworven omdat het was de eerste cyanobacterium met het hele genoom sequenced7,8, het is natuurlijk gassamenstelling door exogene DNA9, en voert het stabiele en relatief snelle groei10,11. In Synechocystis, het kernonderdeel van antenne, allophycocyanin, is gekoppeld aan de integraal membraaneiwitten en de bijgevoegde phycocyanin bevindt zich in de periferie van de membraan thylakoïde.
Verschillende methoden voor de winning van de phycobiliprotein en kwantificering worden vergeleken in dit protocol. De definitieve extractiemethode werd succesvol toegepast voor Synechocystis, alsmede voor andere cyanobacteriën stammen, met inbegrip van Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., en Nostoc sp., en het was ook succesvol toegepast op rode algen Porphyridium cruentum. Daarom is de methode ontwikkeld in dit protocol kan worden beschouwd als een universele methode voor de extractie van de phycobiliprotein. Hoewel sommige van de geteste extractiemethoden in hogere totale proteïne opbrengsten resulteerde, de hier beschreven extractiemethode mits de hoogste phycobiliprotein levert samen met de laagste hoeveelheid chlorofyl een residu in de phycobiliprotein extract. Vermindering van de hoeveelheid chlorofyl een was essentieel voor de juiste phycocyanin en allophycocyanin spectrofotometrische kwantificering.
De phycobiliprotein absorptiespectra kan aanzienlijk verschillen tussen verschillende algen en cyanobacteriën soorten12,13,14,15,16,17 en zelfs onder de verschillende stammen van een enkele cyanobacteriën geslacht18. Dus, de specifieke golflengten en absorptie coëfficiënten zoals gebruikt voor de bepaling van phycocyanin en allophycocyanin in Synechocystis gelden niet in het algemeen aan andere stammen. Bovendien bevat geen Synechocystis phycoerythrin en phycoerythrocyanin die worden in sommige andere algen en cyanobacteriën gevonden kan. Met het oog op de bepaling van phycobiliproteïnen in stammen dan Synechocystis, is het aanbevolen om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk evalueren.
Hoewel het protocol bevat twee langere stappen ('s nachts vriesdrogen van de cellulaire pellets en 1 uur eiwit extractie), is de tijd van de totale arbeid voor de kwantificering van phycobiliproteïnen niet dan 2 uur.

<table><tbody><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>Institut Pasteur, Paris, Frankrijk</td><td>6803</td><td>Cyanobacteriumstam</td></tr><tr><td>Roti-CELL PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>9143.1</td><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>30120086</td><td>Safe-lock buisjes 1,5 ml</td></tr><tr><td>VWR 80-Place Storage System</td><td>VWR International, Radnor, Pennsylvania, VS</td><td>30128-282</td><td>Houders voor safe-lock buisjes&nbsp;</td></tr><tr><td>RAININ 100 &micro;l -1000 &micro;l&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, VS</td><td>17014382</td><td>Pipet</td></tr><tr><td>GP-LTS-A-1000&micro;L-/F-768/8</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, VS</td><td>30389272</td><td>Pipet tips</td></tr><tr><td>Rotina 420R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Duitsland</td><td>4701</td><td>Gekoelde centrifuge voor 1,5 ml safe-lock buisjes en 15 ml kegelvormige centrifuge buisjes</td></tr><tr><td>LCexv 4010</td><td>Liebherr, Bulle, Zwitserland</td><td>9005382197172</td><td>Koel- en vrieskast -20&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>Revco ExF -86&deg;C Upright Ultra-Low Temperature Freezer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, VS</td><td>EXF24086V&nbsp;</td><td>Vrieskast -80&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>CoolSafe</td><td>LaboGene, Lillerød, Denemarken</td><td>7.001.000.615</td><td>Vriesdroger&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-2600</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td><td>UV-2600</td><td>Spectrofotometer&nbsp;</td></tr><tr><td>Hellma absorptie cuvettes, semi Micro</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>Z600288&nbsp;</td><td>VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0,75-1,5 ml, spectraal bereik 200-2500 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Silamat S6</td><td>Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein</td><td>602286WU</td><td>Homogenisator&nbsp;</td></tr><tr><td>Solid-glass beads</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>Z273627</td><td>Glazen kraal met diameter 2&nbsp;mm</td></tr><tr><td>CPA225D-0CE</td><td>Sartorius AG, Göttingen, Duitsland</td><td>SECURA225D-1OBR</td><td>Analytische weegschaal</td></tr><tr><td>C-Phycocyanin from Spirulina sp.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>P2172</td><td>Phycocyanine standaard</td></tr><tr><td>Allophycocyanin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>A7472</td><td>Allophycocyanine standaard</td></tr><tr><td>Bicinchoninic Acid Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>BCA1, B9643</td><td>Complete kit voor totale eiwitbepaling</td></tr><tr><td>AlgaeTron&nbsp;</td><td>Photon System Instruments Ltd., Drásov, Tsjechië</td><td>AG 130-ECO&nbsp;</td><td>Kweekkamer voor E. kolven, met regelbare licht- en atmosfeer</td></tr><tr><td>Fotobioreactor</td><td>Photon System Instruments Ltd., Drásov, Tsjechië</td><td>FMT-150</td><td>Kweekapparatuur voor cyanobacteriën en algen met volledig regelbare omgeving</td></tr><tr><td>Cellometer&nbsp;</td><td>Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, VS</td><td>Auto M10</td><td>Celteller</td></tr><tr><td>Corning 15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS</td><td>CLS430791&nbsp;</td><td>15 ml Centrifuge buis voor droog gewicht bemonstering</td></tr><tr><td>Herasafe KS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, VS</td><td>51024579</td><td>Laminaire stroomkap</td></tr></tbody></table>

spectrofotometrische bepaling van phycobiliprotein in cyanobacterium synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Dit is een simpel protocol voor de kwantitatieve bepaling van phycobiliprotein in het model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteïnen zijn de belangrijkste onderdelen van de phycobilisomes, het grote licht-oogst antennes in cyanobacteriën en verschillende taxa van de algen. De phycobilisomes van de Synechocystis bevatten twee phycobiliproteïnen: phycocyanin en allophycocyanin. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van zowel phycocyanin en allophycocyanin in dit model cyanobacterium. We vergeleken de verschillende methoden van phycobiliprotein extractie en spectrofotometrische kwantificering. De extractie procedure zoals beschreven in dit protocol was ook met succes toegepast voor andere cyanobacteriën stammen zoals Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., en Nostoc sp., alsmede over de rode algen Porphyridium cruentum. Echter de coëfficiënten uitsterven van specifieke phycobiliproteïnen van verschillende taxa kunnen verschillen en het is daarom aangeraden voor het valideren van de methode spectrofotometrische kwantificering voor elke één stam individueel. Het protocol vereist weinig tijd en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de wetenschap van het leven van de standaard aangezien het vereist alleen standaard uitrusting.

Voor de eerste methode tests, was Synechocystis als batch culturen in conische kolven op een shaker gekweekt in BG11 teelt middellange20 (aangevuld met 17 mM HEPES) bij 25 ° C, onder een warm wit licht met een intensiteit van 50 µmol (fotonen) / (m 2·s) en met 1% CO2 in de kweken atmosfeer. Tijdens de teelt, de culturen werden bemonsterd safe-lock buizen en gecentrifugeerd (15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 ...

Hier presenteren we een protocol om te phycobiliprotein inhoud in de cyanobacterium Synechocystis een spectrofotometrische methode kwantitatief te bepalen. De extractiemethode werd ook met succes toegepast op andere cyanobacteriën en algen stammen; wegens verschillen in pigment absorptiespectra is het echter noodzakelijk is om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk onderzoek.

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Het algemene doel van dit protocol is om de phycobiliproteïne-inhoud in het modelcyanobacterium Synechocystis kwantitatief te bepalen met behulp van een spectrofotometrische methode. Phycobiliproteïnen zijn in water oplosbare pigment-eiwitcomplexen die de belangrijkste componenten vertegenwoordigen van de licht-oogstantennes in prokaryotische cyanobacteriën en verschillende groepen eukaryote algen. Omdat ze de belangrijkste licht-oogstcomplexen zijn, vertegenwoordigen phycobiliproteïnen een van de cruciale factoren die de productiviteit van algen en cyanobacteriën bepalen.Synechocystis is een modelcyanobacterium dat in honderden laboratoria wereldwijd wordt gebruikt. Synechocystis bevat twee phycobiliproteïnen, fycocyanine en allofycocyanine. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van beide phycobiliproteïnen in deze schimmelstam.We vergeleken verschillende methoden, extractie en spectrofotometrische kwantificering van phycobiliproteïnen. De kwantificatiemethode moet voor elke stam afzonderlijk worden getest, omdat de absorptiespectra van phycobiliproteïnen kunnen variëren tussen verschillende stammen. Bij het begin

spectrophotometric-determination-phycobiliprotein-content

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Source: Weber, N. et. al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a focused LED-based assay for studying phototaxis in filamentous cyanobacteria. The bacteria migrate toward the light source, forming a dense accumulation at the illuminated center, which is visualized and quantified through pixel intensity analysis of the captured image.

Phototaxis Assay of Filamentous Cyanobacteria Using Focused Light Illumination

Source: Jiang, H., Ho, M. Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria. J. Vis. Exp.(2021).This video demonstrates the procedure for culturing cyanobacteria to obtain biomass by growing cells under continuous illumination with carbon dioxide supply and nutrient-rich conditions, followed by harvesting via centrifugation.

Preparation of Cyanobacterial Culture for Biomass Production

Source: Zhan, Y., et al. Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the procedure for photobleaching pigments in cyanobacterial cells using xenon light under cold conditions to improve the fluorescence imaging of growth-regulating proteins.

Photobleaching Cyanobacterial Pigments for Imaging Growth-Regulating Proteins

Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.

Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus

Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.

Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.

Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze autofluorescentiebeeldvorming en evaluatie van fycobiliproteïneveranderingen in rode algen op basis van spectrale analyse. Dit is een labelvrije en niet-destructieve methode om cellulaire aanpassing aan extreme habitats te evalueren, wanneer alleen schaars materiaal beschikbaar is en cellen langzaam of helemaal niet groeien onder laboratoriumomstandigheden.

Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren

De adsorptie van peptiden op plastic tijdens traditionele seriële verdunningen met pipetpunten kan de bepaling van de potentie aanzienlijk beïnvloeden en het begrip van structuur-activiteitsrelaties verwarren die worden gebruikt voor fasen van loodidentificatie en loodoptimalisatie in de ontdekking van geneesmiddelen. Hier worden methoden beschreven voor geautomatiseerde akoestische non-contact seriële verdunning van peptidemonsters.

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Leer een spectrofotometrische methode om fykobilineiwitten in het modelcyanobacterium Synechocystis te kwantificeren. Dit protocol biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoek naar lichtopvang-efficiëntie.

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Meer video's verkennen