Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Het algemene doel van dit protocol is om de phycobiliproteïne-inhoud in het modelcyanobacterium Synechocystis kwantitatief te bepalen met behulp van een spectrofotometrische methode. Phycobiliproteïnen zijn in water oplosbare pigment-eiwitcomplexen die de belangrijkste componenten vertegenwoordigen van de licht-oogstantennes in prokaryotische cyanobacteriën en verschillende groepen eukaryote algen. Omdat ze de belangrijkste licht-oogstcomplexen zijn, vertegenwoordigen phycobiliproteïnen een van de cruciale factoren die de productiviteit van algen en cyanobacteriën bepalen.

Synechocystis is een modelcyanobacterium dat in honderden laboratoria wereldwijd wordt gebruikt. Synechocystis bevat twee phycobiliproteïnen, fycocyanine en allofycocyanine. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van beide phycobiliproteïnen in deze schimmelstam.

We vergeleken verschillende methoden, extractie en spectrofotometrische kwantificering van phycobiliproteïnen. De kwantificatiemethode moet voor elke stam afzonderlijk worden getest, omdat de absorptiespectra van phycobiliproteïnen kunnen variëren tussen verschillende stammen. Bij het begin van de extractie van phycobiliproteïnen, brengt u een milliliter cyanobacteriële cultuur over in een safe-lockbuis.

Als u besluit het droge gewicht van de monsters te bepalen, weegt u de lege buizen voor het monsteren van de cultuur. Zorg ervoor dat de cultuur niet is gezakt. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 15.000 G bij laboratoriumtemperatuur.

Gooi de supernatant voorzichtig weg. Zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Plaats de monsters in de vriezer.

Voor langdurige opslag, bewaar de monsters op 80 graden Celsius. Dit is noodzakelijk om afbraak van phycobiliproteïnen te voorkomen. Zodra de monsters zijn bevroren, plaatst u ze in de vriesdroger.

Zodra het vriesdrogen is begonnen, controleert u de temperatuur en druk op de vriesdroger. De temperatuur moet lager zijn dan 60 graden Celsius en de druk moet rond de één hectopascal zijn. Vriesdoog de monsters een nacht lang.

Na het voltooien van de vriesdroogcyclus, sluit u de buizen zo snel mogelijk om herabsorptie van water uit de lucht te voorkomen. Voeg vier PCs van twee milliliter glazen kralen toe aan elke monsterbuis. Homogeniseer de monsters met de glazen kralen gedurende 15 seconden.

Een goed gehomogeniseerd monster wordt over het hele binnenoppervlak van de safe-lockbuizen verspreid. Na homogenisatie van de cellen, voegt u één milliliter fosfaatgebufferd zout oplossing toe aan de monsters om de phycobiliproteïnen te extraheren. De optimale pH van de PBS is ongeveer 7,4.

Meng de cellen vijf seconden lang met de PBS op de homogenisator. Dit zorgt voor optimale menging van het monster voor een efficiënte extractie van phycobiliproteïnen. Na het mengen zijn de monsters groenachtig.

Laat de monsters 60 minuten op ijs staan voor de meest efficiënte extractie van phycobiliproteïnen. Na de extractie, centrifugeer de monsters bij 15.000 G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Na centrifugatie heeft de supernatant een cyaanblauwe kleur.

Voor de spectrofotometrische meting, kalibreert u de spectrofotometer met behulp van de PBS als een blanco. Zodra de spectrofotometer is gekalibreerd, gooit u de PBS uit een spectrofotometercuvet en pipet de supernatant met geëxtraheerde phycobiliproteïnen in plaats van de weggegooide buffer. Voor de kwantificering van fycocyanine en allofycocyanine wordt de supernatant met geëxtraheerde phycobiliproteïnen gemeten bij 615, 652 en 720 nanometer.

Zoals beschreven in de tekst, zijn er verschillende vergelijkingen voor de kwantificering van phycobilisomen bekend in de literatuur. De vergelijking die in dit protocol wordt gebruikt, werd gevonden als de beste correlatie tussen fycocyanine en allofycocyanineconcentraties als pigmenten en stippen. Kritische stappen van het protocol zijn celhomogenisatie en extractie, die zowel een hoge opbrengst als hoge specificiteit moeten bieden.

We testten verschillende extractieprocedures, zoals celvernietiging door sonicatie, homogenisatie met zirkoniumoxidekralen of bevriezing van celkoppeling. De methode uit dit protocol leverde de hoogste phycobilisomenopbrengst op. Omdat zelfs een kleine besmetting van het eiwitextract door chlorofyl kan leiden tot een overschatting van het phycobiliproteïnegehalte, is het noodzakelijk om elke chlorofylextractie uit de cellen te voorkomen.

We detecteerden chlorofyl in het ruwe extract, daarna gebruikten we sonicatie voor celvernietiging. Met herhaalde sonicatiecycli nam de chlorofylconcentratie toe. De homogenisatietijd werd geoptimaliseerd op 15 seconden.

Homogenisatie gedurende zowel vijf seconden als 20 seconden leverde iets lagere opbrengsten op. Toevoeging van natrium- of kaliumchloride aan de PBS-buffer of aan water, verhoogde de extractie-efficiëntie van phycobiliproteïnen niet, net als extractie in natriumacetaatbuffer. De extractietijd van phycobiliproteïnen werd geoptimaliseerd op 60 minuten, omdat na 120 en zelfs 240 minuten, de phycobiliproteïneconcentratie niet significant veranderde.

Zorg ervoor dat de absorptie bij 615, 652 en 720 nanometer past in het nabije absorptiebereik van de spectrofotometer. De spectrofotometer die in dit protocol wordt gebruikt, toont het nabije absorptiebereik tussen 0,1 en drie. We vergeleken verschillende vergelijkingen van spectrofotometrische phycobiliproteïnekwantificering die bekend zijn uit de literatuur.

De vergelijking van Bennett en Bogorad leverde de beste reconstructie op van zowel fycocyanine als allofycocyanine-inhoud in de pigmentstandaarden met bekende eiwitconcentraties. De verschillen tussen de individuele vergelijkingen zijn verbonden met variaties in de extinctiecoëfficiënten van phycobiliproteïnen van het specifieke organisme. Het gebruik van streptomycinesulfaat leidde niet tot vermindering van chlorofyl A in monsters waar sonicatie werd toegepast of vermeden.

Als representatieve gegevens, hebben we het gehalte aan phycobiliproteïnen in Synechocystis-cellen bepaald. Het gehalte aan phycobiliproteïnen nam af onder toenemend