Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen op het gebied van biomaterialen. Vooral voor botregeneratie. Ze worden gebruikt om de effectiviteit van biomaterialen en potentiële immuunreacties te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van dit multidisciplinaire platform is dat het een reeks parameters biedt voor het voorspellen van biocompatibiliteit van biomaterialen die worden gebruikt voor botreparatie. De implicaties van deze in vitro en in vivo bottechnieken reiken tot andere botaandoeningen. Vanwege de noodzaak van preklinische screening van nieuwe orthopedische biomaterialen.

De dermatologische methodologie kan inzicht geven in biomaterialen voor botgenezing, het kan ook worden toegepast op biomateriële beoordelingen voor andere klinische indicaties. Aspirate cultuurmedium van primaire osteoblasten 14 dagen na de toevoeging van osteogeen mineralisatiemedium. Spoel twee maal af met 0,5 milliliter 1X PBS.

Bevestig vervolgens de cellen door 0,5 milliliter van 10% gebufferde formaline oplossing toe te voegen en 10 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden. Na 10 minuten, aspirate de 10%gebufferd formaline met een single-use pipet en was twee keer met 0,5 milliliter ultrazuiver water. Voeg vervolgens 250 microliters van 40 millimolar Alizarin Red S kleuroplossing toe aan de vaste osteoblasten.

En de plaat 10 minuten lang op kamertemperatuur incubeer maken op een shaker met 100 shakes per minuut. Na de incubatie met kleuroplossing, aspirate de kleuroplossing met een single-use pipet en spoel met een milliliter ultrazuiver water. Herhaal deze stap vijf tot 10 keer totdat de spoeloplossing vrijkomt om niet-specifieke vlekken te verwijderen.

Na het aspirating van de laatste was, voeg een milliliter koude PBS. En de plaat 10 minuten lang op kamertemperatuur incubeer maken op een shaker. Breng vervolgens de gekleurde tricalciumfosfaatschijven over naar een nieuwe put en scan de platen met een flatbedscanner om mineralisatie vast te leggen.

Voeg na het vastleggen van de afbeelding 250 microliters van 10% cetylpyridiniumchlorideoplossing toe en schud gedurende 15 minuten om de Alizarin Red S-kleurstof te extraheren. Breng vervolgens de oplossing van de putten over naar afzonderlijke buizen van 1,5 milliliter en centrifuge op 17,000 x g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun het extract met 10%cetylpyridiniumchlorideoplossing bij een verdunningsrantsoen van 1:10 tot 1:20 in een buis van 1,5 milliliter.

Breng vervolgens 300 microliter van elk verdund monster over in de putten van de 96-putplaat. Neem twee lege putten op die slechts 10% cetylpyridiniumchloride bevatten. Bereid vervolgens zeven Alizarin Red S-referentienormen voor, variërend van 4 400 micromolar door 40 milliomolar Alizarin Red S-kleuroplossing te verdunnen met 10% cetylpyridiniumchlorideoplossing om een standaardcurve te genereren.

Laad 300 microliter van elke standaard in de plaat. Lees ten slotte de absorpties van de monsters, blanks en referentienormen op 520 nanometer. Isoleer beenmerg osteoplast precursoren van de femurs en scheenbeen van een geëuthanaseerde muis met behulp van steriele schaar om de benen te verwijderen uit het lichaam op het heupgewricht.

Snijd de ledematen aan de knie- en enkelgewrichten en verwijder het zachte weefsel met steriele scalpel en tangen. Snijd de epifyses af. Steek een 27-meter naald bevestigd aan een spuit gevuld met een milliliter botgroeimedium in het lumen en spoel het merg in een zes centimeter steriele petrischaal.

Na het herhalen van dit voor alle femurs en tibiae, breng de celsuspensie naar een 50 milliliter conische buis. Was de zes centimeter petrischaal met vijf milliliter botgroeimedium en breng het over op dezelfde 50 milliliter conische buis. Centrifuge op 350 x g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Na centrifugatie opnieuw opschorten van de cellen in een milliliter per put van osteoclast differentiatie medium. Een BALB / c muis biedt voldoende aantallen osteoclast precursoren voor een 24-well cultuur plaat. Voeg primaire osteoblasten die in botgroeimedium zijn opgehangen aan het biomateriaal en de controles op 8,8*10^4 cellen per vierkante centimeter.

Hier worden bètatricalciumfosfaatschijven, gecontroleerd runderbeen en weefselkweekplastic gebruikt. Incubeer bij 37 graden Celsius in vijf procent kooldioxide gedurende 24 uur. Voeg na 24 uur vers geïsoleerde beenmergoclastvoor precursoren en osteoclastendimiddel toe aan de gekweekte primaire osteoblasten en keer terug naar de couveuse voor vijf dagen cultuur bij 37 graden Celsius bij vijf procent kooldioxide.

Vervang het medium om de dag door vers bereide osteoclast differentiatiemedium. Dan vlek osteoclasten voor tartraat resistente zuurfosfatase om differentiatie te evalueren. Scheer de hoofdhuid van een verdoofde acht weken oude BALB/c muis en maak het oppervlak schoon met 7,5% povidone jodiumoplossing en 70% ethanol.

Bedek de ogen met oogheelkundige zalf om te voorkomen dat drogen tijdens de procedure. Zorg voor een passend niveau van anesthesie door gebrek aan een reactie op een teen en staart snuifje. Dan na het maken van een middellijn sagittale incisie verwijder de paracranium bindweefsel boven de juiste pariëtale bot door schrapen met een scalpel.

Gebruik vervolgens een steriele tandtrefine met een diameter van vier millimeter bij 2000 rotaties per minuut om een kritisch defect in het rechter pariëtale bot te creëren. Irrigeer het gebied voortdurend met steriele zoutoplossing terwijl het juiste pariëtale bot wordt opgevallen en de ectocortext en sommige endocortex doorsnijdt. Om schade aan de Dera Mater te voorkomen, gebruikt u een kleine periosteallift om de resterende endocortex te doorbreken.

Gebruik vervolgens tangen om het calvariale bot voorzichtig op te tillen en te verwijderen. Het resulterende defect moet cirkelvormig zijn en ongeveer 3,5 millimeter in diameter. Vul vervolgens het calvariale defect met bètatricalciumfosfaatcollageenschuim, voorgekookt in steriele PBS.

Om het biomateriaal op zijn plaats te houden, breng 0,5 microliter weefsellijm aan het einde van het defect op twee tegenovergestelde punten. Sluit vervolgens de huid met een niet-ondreerbare hechting. Plaats een verdoofde muis op zijn rug, scheer de buikbont en maak het geschoren oppervlak schoon met 7,5% povidone jodiumoplossing en 70% ethanol.

Na het maken van een acht millimeter lange middellijn incisie door de huid langs de linea alba van de buik, implantaat PBS doorweekt biomateriaal onder de huid. Hecht vervolgens de huid met een niet-onabsorbare hechting. Acht weken na de implantatie, de implantatieplaats wegvoeren met omringend weefsel van de geëuthanaseerde muis.

Dit beeld toont aan dat de groei op bèta tricalciumfosfaatschijven die in open staven worden getoond geen osteoblast levensvatbaarheid in vergelijking met de groei op weefselcultuur plastic op zeven en 14 dagen van de cultuur. Gekweekte osteoblasten werden na 14 dagen bevlekt met Alizarin Red S. Mineralisatie was hoger voor mineralisatie medium controles in vergelijking met osteoblasten gekweekt in medium alleen.

En op bèta tricalciumfosfaatschijven in suspensiecultuurputten. Wanneer een chirurgisch geïnduceerd calvariaaldefect van cruciaal formaat leeg bleef, werd een dunne laag waargenomen die het gehele defect bedekte, maar er was geen significante botvorming aanwezig na 12 weken na de operatie. Wanneer het defect daarentegen bètatricalciumfosfaatcollageschuim bevatte, overbrugden schuimresten omringd door dicht vezelig weefsel, waaronder sommige bloedvaten en ontstekingscellen, het defectgebied zonder bewijs van botvorming.

Na onderhuidse bètatricalciumfosfaatcollageen schuim implantatie, een ontstekingsreactie met vreemde lichaam gigantische cellen werd waargenomen op hematoxylin en Eosin-gekleurde secties een bewijs van fibrose op trilchrome masson's gekleurde secties op acht weken. In tegenstelling, de implantatie site van de sham controles had minimale ontsteking en geen fibrose. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om nauwkeurige en reproduceerbare notching van het calvarium te doen zonder het dier pijn te doen.

Na deze procedure andere methoden zoals osteoclast differentiaties testen en hoge doorvoer in peritoneale immuunmodellen kunnen worden voorgevormd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals osteoclast's reactie op biomaterialen en het type van immuunrespons.