Name: Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer polysome profiling voor eiwittranslatie-analyse in geïsoleerde muizenharten na Langendorff-perfusie. Deze methode identificeert mRNA's, miRNA's en proteomen betrokken bij translationele regulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE) NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Women's Heart Center (RAG, JVE), Dorothy en E. Phillip Lyon stoel in moleculaire cardiologie (RAG), Erika Glazer begiftigd stoel in gezondheid (JVE) van het hart van de vrouw en de Tsjechische Academie van Wetenschappen Institutionele steun RVO: 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology%3A+Rna.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).</li>
<li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li>
<li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li>
<li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mirnas+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+therapeutics%3A+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li>
<li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnp%3AMrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
<li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li>
<li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li>
<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Polysoom profiel-analyse zorgt voor de studie van eiwit-vertaling door het analyseren van de translationeel status van een specifieke mRNA of de hele transcriptome6,7. Het is ook van groot nut wanneer lokale vertaling moet worden bestudeerd zoals synaptosomes8. Deze methode houdt traditioneel, de scheiding van mono - en polyribosomes en de bijbehorende mRNAs op een verloop van sacharose die kan gepaard gaan met genomic of proteomic technie...

Het hart komt tegemoet aan de schade van ischemie (I) en reperfusie (R) op een dynamische wijze. Er is echter weinig inzicht in acute wijzigingen in de eiwitsynthese tijdens de reactie. Om aan te pakken dit, wij profiteerde van de gevestigde methode van Polysoom1 ter identificatie van wijzigingen in eiwit overvloed die overeenkomen met herverdeling van ribosomen en translationeel regelgevende factoren van cytosol te polysomes, profilering en de stijging van de nieuw samengestelde eiwitten (OvN's). In de omgeving van I / R, de toename van nieuwe eiwitsynthese plaatsvindt in een tijdsbestek dat strookt met de transcriptie van nieuwe mRNAs2; Bovendien is verschil tussen mRNA uitdrukking niveaus en eiwit overvloed gerapporteerde3geweest. Om deze redenen, die wij hebben gekozen voor het analyseren van de wijzigingen in de dynamische Proteoom, zoals blijkt uit eiwit vertaling. Om dit te doen, we mRNA te kwantificeren in de Polysoom breuken, en analyseren van de samenstelling van eiwit in de Polysoom breuken. Ten slotte, omdat microRNAs (miRs) beschikbaarheid van mRNAs vertaaldienst reguleren en met de efficiëntie van eiwit vertaling4,5 interfereren kan, onderzochten we de verdeling van miRs in de Polysoom-fracties, zich te concentreren op de reactie op ik / R.
We kozen de geïsoleerde Langendorff perfusie muismodel en geoogste weefsel onder basale voorwaarden voor continue perfusie, na 30 min global neen-flow ischemie en na 30 min van ischemie gevolgd door 30 min van reperfusie te gebruiken. We solubilized het hartweefsel en gescheiden polysomes over een helling van sacharose, gevolgd door Proteoom analyse en selectieve opsporing van mRNAs en miRNAs door PCR en microarray, respectievelijk. Deze combinatie van methoden vertegenwoordigt een krachtige aanpak voor het begrip van de dynamische Proteoom, waardoor gelijktijdige opsporing van mRNA, miRNA, en OvN's, evenals de herverdeling van regelgevende eiwitten, miRNA en mRNA tussen de fracties van het nontranslating, lage-efficiëntie polysomes en hoog rendement polysomes (Zie Figuur 1). Inzicht in de dynamische regulering van dit proces zal worden uitgebreid door de verdere analyse van fosforylering van belangrijke regelgevende factoren zoals eIF2α of mTOR. Deze individuele stappen worden nu in detail beschreven.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>voor euthanasie</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>gebruikt in Langendorff bereiding</td></tr><tr><td>tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>gebruikt om het hart op te hangen</td></tr><tr><td>Langendorff systeem</td><td>Radnoti + zelfgemaakt</td><td>n/a</td><td>Een 'vier hart' systeem bestaande uit op maat geblazen glas, buizen en waterbaden</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Krebs buffer en Sucrose gradiënt</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Krebs buffer en Lysis buffer</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Sucrose poeder</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Sucrose gradiënt</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Sucrose gradiënt en Lysis buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Sucrose gradiënt en Lysis buffer</td></tr><tr><td>Xyleen Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Sucrose gradiënt</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Sucrose gradiënt en Lysis buffer</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>RNAse remmer voor Lysis buffer</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail tabletten, EDTA vrij</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Buis, dunne wand, ultrahelder, 13,2 ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugatie van de gradiënten</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugatie van de gradiënten</td></tr><tr><td>Biologic LP (pomp)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fractie van de gradiënten</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fractie van de gradiënten</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifugebuisjes, 2 ml buisje</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Gradiënt fractie en RNA extractie</td></tr><tr><td>TRIzol Reagens</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Luciferase Control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA kwaliteit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthese Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Kwantitatieve PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit voor totale RNA isolatie</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit voor miRNA omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit voor real-time PCR expressieanalyse van miRNA's</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Voor centrifugatie van 1,5 ml of 2,0 ml buisjes bij verschillende temperaturen. Max snelheid - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Voor real-time PCR plaat centrifugatie bij verschillende temperaturen. Max snelheid - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Voor omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Voor real-time PCR analyse</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Voor kwaliteitscontrole van RNA isolatie</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, laag profiel, dunne wand, gerand, groen/helder</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Voor real-time PCR analyse</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, kleefstof, optisch</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Voor real-time PCR plaat verzegeld</td></tr><tr><td>Research plus Enkelkanaals Pipette, grijs; 0,5-10 µL</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipetten, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipetten, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA kwaliteit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Verbetert de efficiëntie van de totale RNA isolatie</td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 ml Buisjes, natuurlijke kleur</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA isolatie en opslag; reagent mix</td></tr><tr><td>Thermal Cycling Buizen -0,2 ml Individuele Kappen, Standaard 0,2 ml buizen met optisch</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Omgekeerde transcriptie reactie</td></tr><tr><td>Sharp 10 Precisie barrière tips</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>Sharp 20 Precisie barrière tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>Sharp 200 Precisie barrière tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>Tips LTS 1 ml Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Voor pipetteren</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (200)</td><td>Qiagen</td><td>(verandert volgens de miRNA)</td><td>Voor real-time PCR analyse</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>Voor

dynamische proteomic en mirna analyse van polysomes van geïsoleerde muis hart na langendorff perfusie

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamische veranderingen in eiwit vertaling vereisen gespecialiseerde methoden. Hier onderzochten we veranderingen in nieuw-gesynthetiseerd eiwitten in reactie op de ischemie en reperfusie met behulp van het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis in combinatie met Polysoom profilering. Om verder te begrijpen de dynamische veranderingen in eiwit vertaling, wij gekenmerkt de mRNAs die werden geladen met cytosolische ribosomen (polyribosomes of polysomes) en ook teruggewonnen mitochondriale polysomes en vergeleken van mRNA en eiwit verdeling in de hoogrenderende breuken (vele ribosomen gekoppeld aan mRNA), laag-efficiëntie (minder ribosomen aangesloten) waaronder ook mitochondriaal polysomes, en de niet-vertalen van breuken. miRNAs kunt ook koppelen aan mRNAs die worden vertaald, waardoor de efficiëntie van de vertaling, onderzochten we de verdeling van de miRNAs over de fracties. De verdeling van mRNAs, miRNAs en eiwitten werd onder basale geperfundeerd voorwaarden, aan het einde van 30 min van globale neen-flow ischemie en na 30 min van reperfusie onderzocht. Hier presenteren we de gebruikte methoden voor het bereiken van deze analyse — met name de benadering van optimalisatie van eiwit extractie uit het verloop van de sucrose, als dit is niet beschreven voordat — en enkele representatieve resultaten opleveren.

mRNA analyse mRNA resultaten kunnen worden uitgedrukt als een verdeling van een bepaalde mRNA in elke fractie (figuur 3A); voor kwantificering, polyribosomal vertalen breuken combineren en vergelijken met de niet-vertalen breuk (figuur 3B), presentatie van een verhouding van mRNA overvloed in vertalen naar nontranslating breuken. Aanvullende informatie is verkregen door behandeling van de hoog rendement Polysoom breuk...

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over dynamische eiwitsynthese en het proteoom dat bij het proces betrokken is. Deze techniek maakt identificatie mogelijk van de mRNA's die geselecteerd worden voor translatie, de microRNA's die kunnen deelnemen aan het proces en interfereren met translatie, en de eiwitten die bijdragen aan eiwittranslatie of zelf worden vertaald. Deze methode kan inzicht geven in hartreacties op stress, maar kan ook worden toegepast op de studie van acute reacties op stress in andere organen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Miroslava Stastna, een projectwetenschapper uit het laboratorium van Jennifer Van Eyk. Op de dag van het experiment, vult u het linker compartiment van een gradiëntmixer met vijf milliliter 15% sucrose gradiëntoplossing, en vult u het rechter compartiment met vijf milliliter 50% sucrose gradiëntoplossing. Open de kraan en zet de pomp aan om de twee kleine compartimenten met een magnetische roerder te roeren, en gebruik een buis verbonden met de tweede kraan om de gemengde sucroseoplossingen te laten stromen in een enkele ultracentrifugebuis met dunne wanden op ijs.Homogeniseer vervolgens het verse of

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Langendorff-mode geïsoleerde perfusie hart, in combinatie...

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op...

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Leer polysome profiling voor eiwittranslatie-analyse in geïsoleerde muizenharten na Langendorff-perfusie. Deze methode identificeert mRNA's, miRNA's en proteomen betrokken bij translationele regulatie.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Meer video's verkennen