Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over dynamische eiwitsynthese en het proteoom dat bij het proces betrokken is. Deze techniek maakt identificatie mogelijk van de mRNA's die geselecteerd worden voor translatie, de microRNA's die kunnen deelnemen aan het proces en interfereren met translatie, en de eiwitten die bijdragen aan eiwittranslatie of zelf worden vertaald. Deze methode kan inzicht geven in hartreacties op stress, maar kan ook worden toegepast op de studie van acute reacties op stress in andere organen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Miroslava Stastna, een projectwetenschapper uit het laboratorium van Jennifer Van Eyk. Op de dag van het experiment, vult u het linker compartiment van een gradiëntmixer met vijf milliliter 15% sucrose gradiëntoplossing, en vult u het rechter compartiment met vijf milliliter 50% sucrose gradiëntoplossing. Open de kraan en zet de pomp aan om de twee kleine compartimenten met een magnetische roerder te roeren, en gebruik een buis verbonden met de tweede kraan om de gemengde sucroseoplossingen te laten stromen in een enkele ultracentrifugebuis met dunne wanden op ijs.

Homogeniseer vervolgens het verse of bevroren hartweefsel met een POLYTRON in gefilterde lysisbuffer gedurende 15 seconden op ijs. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u de lysate om het onoplosbare materiaal te verwijderen, en oogst u het supernatant. Zet 50 microliters van het supernatant opzij voor eiwitbepaling, RNA-isolatie en RNA-integriteitsanalyse, en legt u 100 tot 500 microliters van het resterende supernatant op de gradiëntoplossing.

Gebruik verse lysisbuffer om de volumes tussen de twee gradiëntbuizen in balans te brengen, en ultracentrifugeer de monsters in een ultracentrifuge met een zwenkrotor. Wees heel voorzichtig om de sucrosegradiënt niet te verstoren voor of na centrifugatie. Om de gradiënten te verzamelen, programmeert u de fractiecollector om de eerste drie minuten van de verzameling weg te gooien en om de zware, lichte en niet-vertalende fracties te verzamelen met een snelheid van één milliliter per minuut in 17 fracties van vier tot 19 minuten met continue monitoring van de absorptie op 254 nanometer.

Plaats elke fractie zodra deze is verzameld op ijs. Bewaar vervolgens de monsters op min 80 graden Celsius, als ze niet onmiddellijk worden verwerkt. Om eiwitten uit de polysoomfracties te extraheren, combineert u de verzamelde sucrosefracties in drie eindfracties, en markeert u de fracties als zwaar, licht en niet-vertalend.

Meng 0,5 milliliter van elk monster met 60 microliter 100% trichloorazijnzuur, of TCA. Incubeer de fracties een nacht bij min 20 graden Celsius in het donker. De volgende ochtend, ontdooi de monsters op ijs voordat u de eiwitten pellet door centrifugatie.

Gooi de supernatanten weg en was de pellets twee keer met 0,5 milliliter gekoelde aceton van min 20 graden Celsius per centrifugatie. Zorg ervoor dat de pellet, na TCA-precipitatie, volledig is opgelost, gebruik pulserende sonicatie om volledige solubilisatie te garanderen, indien nodig. Laat de pellets na de laatste was drogen voordat u ze in 360 microliters Tris-HCl buffer hersuspendeert.

Voeg vervolgens 40 microliter dithiothreitol toe voor een 45-minuten incubatie bij 55 graden Celsius met schudden. Aan het einde van de incubatie, voegt u 50 microliter iodoaceetamide toe aan de monsters voor een 30-minuten incubatie op de shaker bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, gevolgd door de vertering van de monsters met een een-op-vijftig gewicht-op-gewicht trypsine-tot-eiwitverhouding voor een nachtelijke schudden incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, na afkoeling, centrifugeert u de monsters kort en past u de pH aan tot twee tot drie met 10% formijnzuur om de trypsineactiviteit te stoppen.

Om de monsters te ontzouten, conditionert u eerst het sorptiemiddel in de putjes van een 96-putjesplaat met driemaal 200 microliters methanol, gevolgd door conditionering met driemaal 200 microliters 0,1% formijnzuur per putje. Laad vervolgens de monsters in elke put en was de monsters drie keer met 200 microliters 0,1% formijnzuur per wasbeurt. Gebruik zwaartekracht, gevolgd door laag vacuüm, om de monsters te elueren met 100 microliters 0,1% formijnzuur in 50% acetonitril tweemaal in één laag eiwitretentie 0,5-milliliterbuisje per monster.

Gebruik vervolgens een concentrator om de monstereluaten tot droogte te verdampen en reconstitueer elk tryptisch peptide-pellet in 50 tot 100 microliters 0,1% formijnzuur voor massaspectrometrie-analyse. mRNA-analyse kan worden uitgevoerd om de verdeling van een bepaald mRNA van belang in elke fractie te beoordelen of voor kwantificering en vergelijking van de gecombineerde polyribosomale translatiefracties met de niet-vertalende fractie als een verhouding van mRNA-overvloed per fractie. Hier, bijvoorbeeld, worden de veranderingen in mRNA-verdeling over de vertaalde en niet-vertaalde fracties na onderwerping van het muishart aan ischemie of ischemie-reperfusie, vergeleken met sham-hartbehandeling getoond.

In dit representatieve experiment onthulde de analyse van een subset van microRNA's in de gepoolde zware fracties dat 22 microRNA's geassocieerd waren met polysomen tijdens ischemie, negen waren geassocieerd tijdens ischemie en reperfusie, en zeven waren gemeenschappelijk voor beide omstandigheden, wat aantoont dat de associatie van microRNA's dynamisch is in reactie op de stress van ischemie en reperfusie. Verder werden de meeste mitochondriale ribosomale eiwitten geïdentificeerd in de lichte fractie, en de meeste cytosolische ribosomale eiwitten werden vaak geïdentificeerd in zowel de zware als lichte fracties. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat u heel voorzichtig moet zijn met de sucrosegradiënt.

TCA-precipitatie voor extractie van eiwitten uit polysoomfracties werd in ons workflow geselecteerd op basis van zowel het vermogen om de fractie met hoge concentratie sucrose te verwerken als het aantal eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de uitdagingen geassocieerd met de reproduceerbaarheid van de sucrosegradiënt.