Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van macrofaag en dendritische celbiologie over de subcellulaire lokalisatie en dynamiek van verschillende eiwitten in deze celtypen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het relatief eenvoudig, goedkoop, en toont een betere efficiëntie en stabiliteit van de expressie dan de meerderheid van de andere beschikbare methoden. Het aantonen van de procedure zal Jarmila Kralova zijn, een student uit mijn laboratorium.

Voor de productie van het retrovirus, plaat een eencellige suspensie van Platinum Eco-verpakkingscellen in een 10 centimeter petrischaal en cultiveren van de cellen in 15 milliliter DMEM, aangevuld met 10%foetale runderserum, of FBS, totdat de cultuur is 50 tot 60%confluent. De volgende dag, voeg 20 microgram van de retrovirale constructie van belang en 10 microgram van PCL eco-verpakking vector tot 1 milliliter DMEM zonder serum, met zachte mengen. Voeg 75 microliter PEI in 1 milliliter DMEM zonder serum en antibiotica toe aan een tweede buis voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, en meng de inhoud van beide buizen samen voor een extra incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.

Vervang vervolgens voorzichtig het medium op de Platinum Eco-cellen door 8 milliliter verse 37 graden Celsius DMEM aangevuld met 2%FBS en voeg voorzichtig het transfectiemengsel in druppels toe aan de plaat. Na een 4 uur durende incubatie bij 37 graden Celsius, vervang de supernatent met 10 milliliter van 37 graden Celsius DMEM, aangevuld met 10%FBS voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende dag, gebruik maken van een 5 milliliter pipet om de ecotrope retrovirale deeltjes-bevattende supernatent overbrengen naar een 15 milliliter centrifuge buis en verwijder het puin en met cellen door centrifugatie.

Voeg ondertussen 10 milliliter van 37 graden Celsius DMEM plus 10%FBS toe aan het kweekschotel voor nog eens 24 uur incubatie bij 37 graden Celsius en verzamel een tweede ronde virale deeltjes zoals net aangetoond. Om het beenmerg te oogsten, in een weefselkweekkap, gebruik je een pincet en een schaar om de huid en een deel van de spieren uit de achterste ledematen te verwijderen en het acetabulum voorzichtig uit het heupgewricht te verjagen zonder het dijbeen te breken. Snijd de poten aan de enkelgewrichten en spray de botten met 70%ethanol.

Verwijder vervolgens de rest van de spier met een papieren handdoek en plaats de botten in een 5 centimeter petrischaaltje PBS aangevuld met 2%FBS. Buig vervolgens het kniegewricht van elke botset en scheid de botten zorgvuldig met een schaar. Gebruik de schaar te verwijderen ongeveer een tot twee millimeter van elke epifyse van een bot en gebruik een twee of vijf milliliter spuit uitgerust met een 30-meter naald geladen met verse PBS plus FBS om het beenmerg spoelen van beide uiteinden van het bot in een 15 milliliter centrifuge buis.

Wanneer het merg is verzameld uit elk van de botten, pellet de botcellen door centrifugatie en opnieuw opschorten de pellet in 2,5 milliliter van rode bloedcel lyse buffer gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Na lysing, filter de cellen door een 100 micrometer celzeef in een nieuwe 15 milliliter centrifugebuis en herstel de vasthoudendheid met 12 milliliter PBS plus FBS. Re-suspend de pellet in DMEM, aangevuld met 10%FBS en antibiotica voor het tellen en plaat vijf tot 10 keer 10 tot de zesde beenmergcellen in een 10 centimeter, niet-weefsel cultuur behandeld petrischaal in 10 milliliter DMEM aangevuld met serum en macrofaag kolonie stimulerende factor, of MCSF.

Op dag vijf van de cultuur, voorzichtig kantelen de cel cultuur schotel en verwijder alle, maar ongeveer 5 milliliter medium van het oppervlak in de buurt van de rand van de schotel. Voeg vervolgens 20 milliliter vers 37 graden Celsius medium aangevuld met FBS en MCSF toe aan de schotel en breng de cellen terug naar de celkweek incubator. Om de cellen te oogsten, op dag zes tot zeven, verwijder alle middelgrote en drijvende cellen en was de cultuur met 37 graden Celsius PBS.

Maak de aanhangende cellen met vijf milliliter van 0,02%EDTA en PBS gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius in de weefselkweek incubator en gebruik een vijf milliliter pipet om de gescheiden cellen voorzichtig van de plaatbodem te spoelen. Breng de cellen vervolgens over naar een 50 milliliter centrifugebuis met 25 milliliter verse PBS. Om EGFP-gelabelde eiwitexpressie in door beenmerg afgeleide antigeencellen te induceren, verdunt u aan het begin van het celdifferentiatieprotocol de beenmergcellen tot twee tot vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter DMEM plus FBS en antibioticaconentratie en bord de cellen van één milliliter medium per put, aangevuld met de juiste differentiatie cytokine.

Voeg na vier tot zes uur in de celkweek incubator twee milliliter van de eerste ronde verzameld virus toe, aangevuld met polybrene en transduceer de celculturen door centrifugatie en een vier uur durende incubatie in de celkweek incubator. Breng aan het einde van de transductieperiode de niet-loodzwaarte cellen van elke bron over in individuele 15 milliliter centrifugebuizen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Als grotere hoeveelheid cellen nodig is, kunnen de cellen worden geïnfecteerd met dezelfde constract in meerdere putten en gepoold vóór differentiatie.

Dan opnieuw opschorten de pellets in 10 milliliter van cultuur medium aangevuld met de juiste differentiatie cytokine en plaat de cellen op een 10 centimeter niet-weefsel cultuur behandeld petrischaal per buis, voor hun zes tot acht dagen cultuur, zoals net aangetoond. Evaluatie van de werkzaamheid van Platinum Eco transfection door stroomcytometrie na de verzameling van het tweede virus dat supernatent bevat, toont een gemiddelde transfectie-efficiëntie aan van 62% voor PSTPIP2-EGFP en 53% voor OPAL1-EGFP. Retrovirale transductie heeft geen invloed op de differentiatiestatus van de beenmerg afgeleide cellen met meer dan 90% van de cellen in beide culturen die positiviteit aantonen voor hun respectieve markers na transductie met beide virussen.

En met de juiste, karakteristieke morfologische veranderingen waargenomen voor beide soorten gedifferentieerde cel. De algemene expressie van EGFP was lager in beenmerggevormde dendritische celculturen in vergelijking met de uit beenmerg afgeleide macrofaag-EGFP-expressie, ongeacht het type retrovirus. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om niet-weefsel te gebruiken, cultuur behandeld plastic gerechten die meestal worden gebruikt voor het cultiveren van bacteriën als u van plan bent om cellen te verwijderen uit de schotel voor experiment.

Na deze procedure kunnen andere methoden live cell imaging, super resolutie microscopie of andere soorten microscopie worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over de subcellulaire lokalisatie en dynamiek van dendritische cel en macrofaag eiwitten van belang. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie bij het verkennen van de distributie en ruimtelijke relaties van eiwitten uitgedrukt door macrofagen en dendritische cellen en in het bevorderen van ons begrip van de functie van deze eiwitten tijdens immuunreacties. Vergeet niet dat het werken met virale deeltjes zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het minimaliseren van aerosol generatie, het dragen van beschermende apparatuur, en het gebruik van een laminaire stroomkap, moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.