Name: In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer de isolatie van hondenneutrofielen en visualisatie van NET-vorming met fluorescentiemicroscopie. Deze methode kwantificeert citrullinated histone H3 voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De overeenkomstige auteur werd gefinancierd door de Stichting dier Morris (D15CA-907). De studie werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Californië, Davis, Center voor de gezondheid van de paarden en Center for Companion Animal Health (2016-24-F). De auteurs wil erkennen Geena Ng voor haar hulp bij de cijfers en Nghi Nguyen voor haar hulp bij de video.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Universiteit van Californië, Davis (protocol nummer: 18338).
1. de bloedinzameling
<ol><li>Trekken 10 mL bloed ofwel de cephalic of jugular ader met behulp van een naald 21 G door spuit aspiratie.</li>
	<li>Om te voorkomen dat buitensporige schuifspanning, verwijder de naald van de spuit vóór de overbrenging van bloed in de sproeibuis(-buizen) met Natrium heparine (75 USP). Voorzichtig omkeren de buizen een paar keer om ervoor te zorgen dat voldoende mengen van antistollingsmiddel en bloed. Bewijs van stolsels of rode cel aggregaten controleren voordat het plaatsen van de monsters op ijs.</li>
</ol>2. neutrofiele isolatie
<ol><li>Verdun vertonen bloed met een gelijk volume ijskoude Dubecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (pH 7.4, zonder divalente kationen). Pipetteer 8 mL verdunde bloed in een 50 mL polypropyleen conische buis met 25 mL van 3% dextran (vanaf Leuconostoc spp. opgelost in 0,9% natriumchlorideoplossing). Plaats de buis rechtop bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten dat aggregatie en sedimentatie van erytrocyten.</li>
	<li>Zorgvuldig laag 5 mL leukocyte-rich plasma (Figuur 1) op de top van 5 mL van de kleurovergang media dichtheid in een polypropyleen ronde-onderkant-buis van 14 mL. Wees voorzichtig niet te mengen van de 2 oplossingen11.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 400 x g met versnelling/vertraging (A/D) zijn ingesteld op 0 (geen rem) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Serologische Pipetteer met behulp van een 5 mL en verzamelen de cellaag granulocyt door het omzeilen van het plasma en de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) lagen (Figuur 1). Gebruik een nieuwe Pipetteer telkens om te minimaliseren van verontreiniging.</li>
	<li>Plaats 4 tot en met 6 mL van de cellaag van de polymorphnuclear (PMN) in een polypropyleen conische tube van 50 mL. Omdat een kleine hoeveelheid erytrocyt aggregaten kan worden aanzuiging samen met de laag PMN, kunt een serologische 1 mL-pipet zachtjes verwijderen de erytrocyt aggregaten die aan de onderkant van de buis worden afgewikkeld.</li>
	<li>Lyse de resterende erythrocyten met 20 mL koud ultrazuiver water. Voorzichtig omkeren de buis meerdere keren voor 30 tot 60 s om te zorgen voor voldoende lysing alvorens toe te voegen een gelijk volume van ijskoude 1.8% natriumchloride-oplossing.</li>
	<li>Centrifugeer bij 112 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, A/D ingesteld op 0.</li>
	<li>Herhaal de erytrocyt lysis stap als deze pellet wordt rood weergegeven. Verwijder het supernatant zorgvuldig met een serologische Pipetteer en zachtjes resuspendeer de pellet in 100 µL van DPBS (5 mM dextrose, 0,9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2 en 1% bovien serumalbumine, pH 7.3). Alle geresuspendeerde cellen combineren en plaats op ijs.</li>
	<li>Uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een geautomatiseerde cel analyzer en bevestig de graaf door een hemocytometer. Indien nodig, PMNs concentreren op een glasplaatje met behulp van een cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) en het percentage van de neutrofielen bepalen door het aantal neutrofielen uit het totale aantal cellen te tellen.</li>
	<li>Bepalen van de levensvatbaarheid van de neutrofielen door een trypan blauw uitsluiting test uit te voeren zoals beschreven door Strober et al. 12 succesvolle isolatie moet een levensvatbaarheid van 95 tot 100% opleveren en neutrofielen groter moeten zijn dan 95%.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van neutrofielen de cel totaal telling wordt vermenigvuldigd met de procentuele levensvatbaarheid en percentage neutrofiele granulocyten. Succesvolle isolatie moet toegeven een concentratie van neutrofielen 1.5 aan 6 x 106/mL.</li>
	<li>Neutrofielen naar een eindconcentratie van 1 x 106/mL met DPBS met 5 mM dextrose, 0,9 mM MgCl21.9 mM CaCl2en 1% bovien serumalbumine met pH aangepast aan 7.3 verdund.</li>
</ol>3. fluorescent microscopie van levende neutrofiele granulocyten
<ol><li>Plaats 200 tot 400 μL van neutrofiele granulocyten (1 x 106/mL) in elk putje van een poly-L-lysine gecoat 12-well cultuur plaat. Het toestaan van neutrofielen vast te houden aan de onderkant van de putten door de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten aan het broeden.</li>
	<li>Label nucleic zuren met 1 μM één van de twee kleurstoffen van de nucleïnezuur, die in cellen met intact membranen vlekken en één die in cellen met een permeabele membraan vlekken (Zie Tabel of Materials), gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Activeren van neutrofiele granulocyten met 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als positieve controle of gelijkwaardige hoeveelheid DPBS als negatieve controle voor 180 min bij 37 ° C.</li>
	<li>Verwerven van beelden met behulp van het GFP (excitatie: 470/22 nm, emissie: 525/50 nm) en Texas Red kanalen (excitatie: 585/29 nm, emissie: 628/32 nm) op een fluorescentie microscopie bij 40 X vergroting op de volgende tijdstippen: 30, 90, 120 en 180 min.</li>
</ol>4. netto kwantificering en opsporing van netto onderdelen met behulp van immunofluorescentie
<ol><li>Zorgvuldig plaats 18 mm diameter Poly-D-lysine gecoat cover slips in de putjes van de plaat van een 12-well cultuur. Label de putjes op de juiste manier.</li>
	<li>Zaad 100 tot 200 μL van neutrofiele granulocyten (1 x 106/mL) direct op de coverslips geïsoleerd en toestaan van neutrofielen vast te houden aan de hoes glijdt door het broeden van de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Activeren neutrofielen zoals beschreven in punt 3.3. NETTO vorming afremmen door de voorbehandeling van neutrofiele granulocyten met 200 µΜ Cl-amidine (15 min, 37 ° C) vóór activering zoals eerder beschreven door Li et al. 13 zorg ervoor dat het juiste voertuig besturingselement (DMSO) is opgenomen in het experiment.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig cover slips met een fijne Tang. Een blad van paraffine film over een reageerbuis stand maken van ondiepe putten en plaats 2 tot 3 druppels van 4% in lagen PFA in elke goed10. Label de putjes op de juiste manier en de cover glijdt zachtjes ondersteboven te leggen op de PFA gevulde putten. Toestaan dat cellen vast te stellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
	<li>De cellen in DPBS voor 5 minuten, 3 keer wassen door ze uit een put te verplaatsen naar de volgende.</li>
	<li>Als immunolabelling kan niet worden uitgevoerd kort na neutrofiele activering en fixatie, toestaan cover slips als lucht gedroogd door het plaatsen van de cover slips gezicht-up op een stuk papier van absorptie. Cover slips kunnen maximaal 1 week gezicht-omhoog in een gelabelde 12-well cultuur plaat bij 4 ° C tot verdere analyse worden opgeslagen. Wassen van de cellen 3 keer in DPBS voor 1 min met gebruikmaking van dezelfde techniek, zoals beschreven in 4.4 voordat u verdergaat met de volgende stap.</li>
	<li>Als u wilt permeabilize cellen, zachtjes Leg de cover slip ondersteboven op een daling van 1% NP-40 voor 1 min met behulp van de techniek in 4.4 beschreven. 3 keer wassen in DPBS voor 1 min op een rocker.</li>
	<li>Willekeurig toewijzen van elk monster aan een nummer en gebruik een diamant punt marker op het etiket van de coverslips dienovereenkomstig.</li>
	<li>Bereiden en label individuele petrischalen bekleed met paraffine film en plaatsen van 100 tot 200 μL van 5% geit serum op de film (blokkeerbuffer). Leg de coverslips ondersteboven op de buffer met blokkerend. Plaats op een rocker en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker.</li>
	<li>Verdun het primaire antilichaam (1:400 konijn polyklonale anti-citrullinated Histon H3 (citH3) in 5% geit serum). Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en incubeer gedurende 1 uur bij 37° C.</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker.</li>
	<li>Verdunde secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorophore (1:200) in serum van 5% geit. Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en Incubeer 1 uur bij 37 ° C in het donker.</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.</li>
	<li>Volg de volgende stappen voor een gemodificeerde dubbele immunolabeling-protocol, zoals beschreven door Li et al. voor gelijktijdige opsporing van myeloperoxidase (MPO) 13
</li>
	<li>Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 100-200 μl van 10% konijn serum onder zachte wiegen (overnachting, 4 ° C, in het donker).</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 50 μg/mL-unconjugated geit, anti-konijn Fab fragmenten gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rocker in het donker.</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.</li>
	<li>Verdun primair antilichaam (1:200 konijn polyclonal anti-menselijke MPO antilichaam) in 5% geit serum. Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en Incubeer 1 uur bij 37° C in het donker.</li>
	<li>Verdun secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorophore in 5% geit serum en incubeer zoals beschreven in 4.8</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.</li>
	<li>Interferentie controles moeten worden opgesteld door met uitzondering van incubatie met ofwel primaire antilichamen in de tweede stap van de immuun-etikettering.</li>
	<li>Vlekken van DNA met 300 nM van 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) gedurende 5 min. in het donker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>3 keer wassen in DPBS voor 1 min op een rocker in het donker.</li>
	<li>Een druppel (~ 50 µl) van de toepassing van antifade inbedmiddel op een glasplaatje. Tik zachtjes op de rand van het dekglaasje aan op een absorberend papier te verwijderen overtollige buffer voordat het dekglaasje aan met de cellen ondersteboven monteren. Het medium montage moet vormen een dunne laag tussen het dekglaasje aan en het glasplaatje. Als u wilt verwijderen van luchtbellen, heel zachtjes druk op het dekglaasje aan met een fijne Tang.</li>
	<li>Toestaan van monsters te genezen 's nachts in het donker bij 4 ° C. Het medium van de montage moet harden voor microscopische analyse met immersie-lenzen. Monsters opslaan in 4 ° C in het donker.</li>
</ol>5. neutrofiele extracellulaire Trap kwantificering
<ol><li>Blind de exploitant(en) verwerven en analyseren van de beelden van de Microscoop aan de experimentele omstandigheden.</li>
	<li>Het gebruiken van een fluorescentie Microscoop op 40 X vergroting, neem 10 beelden willekeurig uit verschillende regio's van elke dekglaasje aan in een experiment onder de respectieve kanalen. Ervoor dat de belichtingstijd, de helderheid en het contrast van elk kanaal consistent de overname van afbeeldingen worden gehouden.</li>
	<li>Het analyseren van de beelden met behulp van beschikbare software zoals ImageJ (NIH). Identificeren van netten op basis van co lokalisatie van cfDNA, citH3 en MPO (figuur 3A, B). Het aantal netten en neutrofielen in 10 willekeurige velden voor elke experimentele voorwaarde te kwantificeren. Nummers van netten uitgebracht kan worden uitgedrukt als een ratio (aantal netten: totaal aantal neutrofielen) voor elke experimentele voorwaarde.</li>
	<li>Om de effecten van de behandeling op de intracellulaire citH3 expressie, tellen het aantal neutrofielen met intracellulaire citH3 en aantal neutrofielen zonder intracellulaire citH3 in 10 willekeurige velden bij 40 X vergroting onder de respectieve kanalen ( Figuur 3, rode pijlen). Intracellulaire citH3 expressie kan worden uitgedrukt als de verhouding van het aantal neutrofielen met intracellulaire citH3 aan het aantal neutrofielen zonder intracellulaire citH3.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
<li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij presenteren hier een protocol om te zien hoe de veranderingen in kernen bevleesdheid en cfDNA release in levende canine neutrofiele granulocyten met behulp van zowel een cel permeant kleurstof en een cel impermeant kleurstof. Het belangrijkste voordeel van deze test is dat het mogelijk voor real-time detectie van netto vorming door high-resolution microscopie in levende neutrofielen zonder cel fixatie, daarom bieden een eenvoudige en waardevolle tool maakt voor de naleving van de in vitro netto vorming. Aang...

Neutrofielen zijn kortstondige granulocyten die verantwoordelijk is voor de eerste verdediging tegen invasie ziekteverwekkers. Neutrofiele granulocyten, gerekruteerd om de plaats van de infectie, elimineren micro-organismen door fagocytose, degranulatie en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS)1. In aanwezigheid van bacteriën en endotoxines versierd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), samengesteld uit extracellulaire chromatine met histonen en korrelig eiwitten zoals elastase en myeloperoxidase (MPO)2. Netten weliswaar onmisbaar antimicrobiële eigenschappen, suggereert verhoging van experimentele en klinisch bewijs dat overijverige netto formatie tijdens sepsis tot meerdere orgel dysfunctie en dood3,4, leiden kan 5 , 6.
Omdat netten een soortgelijke pathofysiologische rol bij honden spelen kunnen, kunnen therapeutische ingrepen die ofwel voorkomen of verminderen van netto vorming dienen als roman behandelingsstrategieën in septische dieren. Om deze reden is er een behoefte aan een betrouwbare techniek voor het beoordelen en kwantificeren van NETosis en netto onderdelen bij honden. NETTO componenten zoals cel-gratis DNA (cfDNA) en nucleosomes zijn eerder geëvalueerd in canine neutrofielen en plasma van klinische honden7,8,9. Met behulp van fluorescentie testen, Goggs en Letendre gevonden dat septische honden hogere niveaus van cfDNA dan gezonde honden8 hebben. Hoewel deze technieken zeer objectieve en kwantitatieve zijn, is meting van cfDNA en nucleosomes als markeringen van NETosis niet-specifieke aangezien zij necrotische cellen dan NETosing neutrofiele granulocyten kunnen worden ontleend. Hier beschrijven we een techniek die gebruik maakt van fluorescentie microscopie te onderzoeken van de gedragingen van de neutrofiele granulocyten live NETosing. We detail ook een gewijzigde protocol, met behulp van dubbel-immunolabeling te subjectief kwantificeren netten en hun onderdelen zoals MPO en citH3 in canine neutrofielen10.

<table><tbody><tr><td>Dextran van Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Moleculaire massa 450.000 &ndash; 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>Met tweewaardige kationen</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Zonder tweewaardige kationen</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; kleurt cellen met permeabele membranen</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM in DMSO; kleurt cellen met intacte membranen</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine gecoate coverslips</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Anti-citrullineerde histone H3 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Ongeconjugeerd geiten-anti-konijn Fab fragmenten</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Specificiteit: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase antilichaam</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenylin (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro canine neutrofiele extracellulaire trap vorming: dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In reactie op de invasie ziekteverwekkers, vrijgeven neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die de extracellulaire van DNA versierd met histonen en antimicrobiële eiwitten netwerken. Buitensporige netto vorming (NETosis) en citH3 release tijdens sepsis is gekoppeld aan meerdere orgaanstoornis en sterfte bij muizen en mensen, maar de implicaties ervan bij honden zijn onbekend. Hierin beschrijven we een techniek om te isoleren canine neutrofielen van volbloed voor observatie en kwantificering van NETosis. Leukocyten-rich plasma, gegenereerd door dextran sedimentatie, wordt gescheiden door verkrijgbare dichtheid verlopende scheiding media en granulocyten verzameld voor cel tellen en levensvatbaarheid testen. Om te zien hoe de realtime NETosis in levende neutrofielen, worden cel permeant en cel impermeant fluorescerende nucleïnezuur vlekken toegevoegd aan de neutrofielen geactiveerd door lipopolysaccharide (LPS) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA). Veranderingen in nucleaire morfologie en netto vorming worden waargenomen na verloop van tijd door fluorescentie microscopie. In vitro NETosis wordt verder gekenmerkt door co-colocalization van cel-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) en citrullinated Histon H3 (citH3) met behulp van een gemodificeerde dubbel-immunolabelling-protocol. Om objectief te kwantificeren netto vorming en citH3 expressie met behulp van fluorescentie microscopie, netten en citH3-positieve cellen worden gekwantificeerd in een geblindeerde wijze met behulp van beschikbare software. Deze techniek is een specifieke bepaling voor de evaluatie van de capaciteit in vitro van canine neutrofielen NETosis ondergaan.

Met behulp van dit protocol voor levende cellen imaging, kunnen onderzoekers observeren de nucleaire morfologie, de plasma membraan integriteit en de aanwezigheid van cfDNA in levende neutrofiele granulocyten. Een cel impermeant nucleaire kleurstof vlekken kernen zuren rode in cellen met beschadigde celmembranen. Een andere cel-permeant kleurstof, etiketten intracellulaire nucleic zuren in levende cellen met een intact plasma membraan. Alle intact neutrofielen, ongeacht hun behandelingen,...

We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over neutrofiel extracellulair valnet of NET-vorming bij honden of andere diersoorten. De belangrijkste voordelen van deze technieken omvatten de realtime detectie van NET-vorming en identificatie van NET-componenten zoals milde peroxidase en gecitrullineerde histone H3. Begin met het verkrijgen van 10 tot 20 milliliter bloed uit de halsslagader van een gezonde hondelijke donor, verwijder de naald van de spuit voordat u het bloed in natriumheparinebuizen afgeeft om overmatig delen te voorkomen. Draai de buizen voorzichtig een paar keer om om een voldoende menging van het bloed en anticoagulans te garanderen, en controleer op stolsels en rode celaggregaten voordat u de monsters op ijs plaatst.Verdun het anticoaguleerde bloed met een gelijk volume ijskoud Dulbecco's PBS, en breng acht milliliter verdund bloed over in een 50 milliliter polypropyleen conische buis met 25 milliliter gefilterd 3% Dextran. Plaats de buis rechtop gedurende 30 minuten op kamertemperatuur om aggregatie en sedimentatie van de erytrocyten mogelijk te maken. Breng vervolgens voorzichtig vijf milliliter leukocytenrijk plasma aan bovenop vijf milliliter dichtheidsgradiëntmedium in een 14 milliliter polypropyleen ronde bodembuis.Na dichtheidsgradiëntcentrifugering, gebruik een vijf milliliter serologische pipet om de intermediaire granuloccytenlaag over te brengen naar 50 milliliter conische en lyseer eventuele erytrocyten die meegezogen zijn met de polymorfonucleaire cellen met 20 milliliter koud, ultrapuur water. Draai de buis voorzichtig gedurende 30 tot 60 seconden om voldoende lysering te garanderen voordat u de cellen wast in een gelijk volume ijskoud 1,8% natriumchlorideoplossing. Na enkele keren de buis omgekeerd te hebben, centrifugeer bij vier graden Celsius.Gebruik een serologische pipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen en resuspendeer voorzichtig de pellet in 100 microliter celcultuurbuffer. Tel en bevestig hun levensvatbaarheid door trypanblauwuitsluiting. Verdun vervolgens de neutrofielen tot een concentratie van een keer tien tot de zes cellen per milliliter celcultuurbuffer.Het is essentieel om een goede steriele techniek te gebruiken en de neutrofielen voorzichtig te hanteren tijdens het isolatieproces, omdat besmetting en schaarkrachten kunnen leiden tot in vitro necrose en cellyse. Om de neutrofielen door middel van fluorescentiemicroscopie te beeld, voegt u 200 tot 400 microliter cellen toe aan elke put van een met poly-L-lysine gecoate 12-welscultuurplaat voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de neutrofielen zich aan de bodem van de putjes hebben gehecht, label de cellen met een geschikte fluorescente nucleïnezuurkleurstof gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, activeer de neutrofielen met 100 microgram per milliliter LPS, 100 nanomolair PMA als positieve controle, of een gelijk volume celcultuurbuffer als negatieve controle bij 37 graden Celsius. Beeld vervolgens de neutrofilocultuur af door middel van fluorescentiemicroscopie bij een 40-voudige vergroting op de aangegeven tijdstippen. Voor een NET-kwantificering, plaats voorzichtig deksels met een diameter van 18 millimeter gecoat met poly-D-lysine in individuele putjes van een 12-welscultuurplaat en label de putjes volgens de experimentele stimulus.Zaai vervolgens 100 tot 200 microliter van de geïsoleerde neutrofielen direct op de deksels voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de neutrofielen zich hebben gehecht aan de deksels, activeer de neutrofielen in elke put met LPS, PMA of DPBS gedurende 180 minuten zoals net gedemonstreerd. Tijdens de laatste 30 minuten van de incubatie, legt u een paraffinefolieblad over een testbuisstandaard om ondiepe putjes te maken en voegt u twee tot drie druppels 4% paraformaldehyde toe aan elke put.Label de putjes experimenteel passend en gebruik fijne tang om de deksels voorzichtig van elk plaatputje ondersteboven over te brengen naar het overeenkomstige PFA-gevulde putje. Na 20 minuten bij kamertemperatuur, was de gefixeerde cellen drie keer gedurende vijf minuten in twee tot drie druppels gebufferde zoutoplossing per wasbeurt door de cellen van de ene put met DPBS naar de volgende te verplaatsen. Om de cellen te permeabiliseren, legt u de deksels voorzichtig ondersteboven op een druppel 1% NP-40 gedurende één minuut, gevolgd door drie eenminuut gebufferde zoutoplossing wasbeurten op een rocker.Na de laatste wasbeurt, plaats de deksels ondersteboven in 100 tot 200 microliter 5% geitenserum in afzonderlijk gelabelde petrischalen met verse plastic paraffinefolie voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius met wiegen. Aan het einde van de blokkerende incubatie, was de deksels drie keer in gebufferde zoutoplossing met wiegen zoals net gedemonstreerd. Breng de deksels over in afzonderlijke plastic paraffinefolie gevulde petrischalen in 50 tot 100 microliter van het juiste antilichaam van belang voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius met wiegen.Na het wassen, incubeer de deksels met het juiste fluorfosfor-geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende één uur bij 37 graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de secundaire antilichaam incubatie, was de deksels drie keer in gebufferde zoutoplossing in het donker met wiegen gevolgd door nucleïnezuurkleuring met DAPI gedurende vijf minuten in het donker bij kamertemperatuur. Na drie eenminuut gebufferde zoutoplossing wasbeurten in het donker met wiegen, brengt u een druppel van 50 microliter antifade montagemedium aan op één glazen dia per monster en monteert u elke gedroogd deksel voorzichtig ondersteboven op één druppel montagemedium.Laat de monsters vervolgens een nacht bij vier graden Celsius beschermd tegen licht uitharden. De volgende ochtend, verkrijg willekeurig 10 beelden uit verschillende regio's van elke deksel bij een 40-voudige vergroting. Alle intacte neutrofielen, ongeacht de behandeling, moeten groen verschijnen en de karakteristieke lobulaire kernen vertonen bij nul tot 30 minuten na stimulatie.<p

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn driedimensionale structuren gegenereerd door geprikkeld neutrofiele granulocyten. Het is in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat netten betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan ziekten. Detectie van netten in weefsel kan diagnostische relevantie hebben, zodat gestandaardiseerde protocollen voor het labelen van NETTOCOMPONENTEN vereist zijn.

Immunofluorescentie-etikettering van humane en Muriene neutrofiele extracellulaire vallen in paraffine-ingesloten weefsel

We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.

Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Leer de isolatie van hondenneutrofielen en visualisatie van NET-vorming met fluorescentiemicroscopie. Deze methode kwantificeert citrullinated histone H3 voor immunologisch onderzoek.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen