Name: Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Leer de isolatie en microRNA-gebaseerde genetische modificatie van humane tandheelkundige follikelstamcellen. Deze veilige methode verbetert therapeutische eigenschappen zonder stabiele genoom-integratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het programma van de FORUN van het Rostock universitair medisch centrum (889018) en de VOCHTIGE Foundation (2016-11). Daarnaast P.M. en R.D. worden ondersteund door de goedgekeurd (VIP + 00240).

HDFSCs zijn geïsoleerd van de tandheelkundige follikels uitgepakte verstandskiezen geboden door het departement van orale en maxillofaciale plastische chirurgie van het Rostock University Medical Center. Geïnformeerde toestemming en schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten. Deze studie werd gemachtigd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Rostock (No. A 2017-0158 toestemming).
1. isolatie van hDFSCs
Opmerking: Voorkom bacteriële besmetting en moeten wijsheid tanden niet worden uitbrak vóór de extractie
<ol><li>
Voorbereiding van vereiste oplossingen
	<ol>
<li>Bereiden-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) / penicilline-streptomycine-Glutamine (P-S-G) oplossing: Meng 495 mL PBS met 5 mL P-S-G oplossing. Winkel aliquots van 50 mL bij 4 ° C.</li>
		<li>HDFSC-kweekmedium bereiden: Meng 445 mL van basaal medium met 5 mL antibiotica agent en 50 mL van foetale runderserum (FBS). Bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereiden van Collagenase type ik stockoplossing (30 mg/mL): 300 mg van Collagenase type ik in 10 mL van basaal medium aangevuld met 1% antibiotica agent verdunnen. Krachtig Meng de oplossing. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 µm filter. Winkel aliquots van 500 µL van Collagenase typ ik stockoplossing bij-20 ° C.</li>
		<li>Dispase II-stockoplossing (40 mg/mL) bereiden: Verdun 40 mg Dispase II 10 ml van basaal medium aangevuld met 1% antibiotica agent. Krachtig Meng de oplossing. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 µm filter. Winkel aliquots van 500 µL van Dispase II stockoplossing bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgische ingreep
	<ol>
<li>Injecteren van een voldoende hoeveelheid (maximale: 2 mL) van lokale verdoving.</li>
		<li>Maken en een driezijdige mucoperiosteal klep te verhogen. Het verhogen van een meertalige klep is niet vereist.</li>
		<li>Bescherm de meertalige aspect met een periosteal lift.</li>
		<li>Zachtjes molen buccale en distale bot met een ronde hard metalen burr.</li>
		<li>Los van het weefsel van de follikel met een periosteal lift. Verwijder voorzichtig de volledige tand (kiem) en follikel door te trekken uit de kroon (en follikel) met achterste (derde-molar) pincet.</li>
		<li>Debride en bevloeiing van de socket grondig met NaCl-oplossing.</li>
		<li>Vervang de mucoperiosteal klep met vicryl hechtingen (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>De follikel tand uit de mondholte te verwijderen en plaats hen in een aliquoot deel van 50 mL PBS/P-S-G oplossing. Opmerking: Het monster kan bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enzymatische vertering van de follikel tand
	<ol>
<li>Vooraf warm hDFSC kweekmedium en PBS/P-S-G oplossing tot kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Ontdooi een aliquoot gedeelte van elk type Collagenase I en Dispase II stamoplossingen. Bereid een oplossing van de spijsvertering van 3 mg/mL Collagenase type ik en 4 mg/mL Dispase II door toevoeging van 500 µL van elke Collagenase type I en Dispase II stockoplossing tot 4 mL voor basale gemiddeld met 1% antibiotica agent.</li>
		<li>Plaats van uitgepakte follikel in een steriele petrischaal en voeg 10 mL PBS/P-S-G oplossing te wassen het uitgepakte weefsel. Herhaal deze stap wassen tweemaal.</li>
		<li>Mince de uitgepakte follikel aan stukken van ongeveer 1 mm x 1 mm met een steriel scalpel binnen de petrischaal met 10 mL PBS/P-S-G oplossing.</li>
		<li>Pipetteer gehakt weefsel en PBS/P-S-G oplossing van de petrischaal in een tube van 50 mL conische centrifuge. Wassen van de petrischaal met 10 mL PBS/P-S-G oplossing en breng de oplossing kwantitatief over in de dezelfde buis.</li>
		<li>Centrifugeer de conische centrifugebuis gedurende 10 minuten bij 353 x g bij RT en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg 5 mL van de oplossing van de spijsvertering aan het Ingehuld weefsel. Meng voorzichtig de oplossing en het weefsel. Incubeer het mengsel bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur in een schudden incubator.</li>
		<li>Centrifuge verteerd cel/weefsel schorsing bij 353 x g gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 6 mL hDFSC kweekmedium.</li>
		<li>Zaad celsuspensie in een 25 cm2 cel cultuur kolf en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 en 20% O2cellen. Opmerking: Het resterende weefsel overbrengen de kolf van de cultuur van de cel zo goed als weefsel wordt niet volledig verteerd.</li>
		<li>Wijzigen medium zorgvuldig 24 h na het zaaien van de cel. Daarna medium elke drie dagen tot confluentie wijzigen. Opmerking: HDFSCs kunststof-aanhanger 24 h na het zaaien van de cel moet worden en kunnen worden gescheiden van niet-aanhanger cellen en bloedbestanddelen door simpelweg het veranderen van het medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cel oogsten
	<ol>
<li>Vooraf warm hDFSC kweekmedium, PBS/P-S-G oplossing en trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing voor RT.</li>
		<li>Verwijder het supernatant van cultuur kolf en wassen van confluente cellen met 5 mL PBS/P-S-G oplossing.</li>
		<li>Voeg 1 mL trypsine/EDTA-oplossing over in een maatkolf van de cultuur en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Stop het spijsverteringsproces bij 3 mL hDFSC kweekmedium aan de kolf cultuur toe te voegen.</li>
		<li>Pipetteer celsuspensie in een tube van 15 mL conische centrifuge en centrifugeren van de suspensie voor 10 min bij 353 x g bij RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid van een hDFSC voedingsbodem.</li>
		<li>Cellen tellen: meng zachtjes 10 µL celsuspensie met 10 µL van Trypan blauwe oplossing. 10 µL van toepassing in een kamer tellen en berekent het bedrag van de cel hDFSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. karakterisering van hDFSCs
<ol><li>
Immunophenotyping
	<ol>
<li>Voorbereiding van cellen voor flow cytometrische analyse<ol>
<li>Voorbereiding van vereiste oplossingen<ol>
<li>PBS/EDTA (2 mM) bereiden: Meng 996 mL PBS met 4 mL EDTA (0,5 M).</li>
				<li>Kleuring buffer bereiden: Meng 995 mL PBS/EDTA (2 mM) met 5 g van BSA. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 µm filter eenheid en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.</li>
				<li>Paraformaldehyde (PFA) stockoplossing (4%) bereiden: Verdun 4 g PFA in 100 mL PBS en verwarm de oplossing tot 80 ° C. De oplossing mengen en de pH-waarde tot 7.3. Aliquot verkregen PFA oplossing in de respectieve bedragen (1,5 mL) en opslag bij-20 ° C tot gebruik. Let op: Omdat PFA dampen giftig zijn, bereid de PFA-oplossing in een geventileerde zuurkast.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Pipetteer 14 monsters van 5 x 104 cellen in 1,5 mL microcentrifuge buizen na cel oogsten (1.4). Centrifugeer de schorsingen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Cellen en reagentia op ijs houden tenzij anders vermeld.</li>
			<li>Resuspendeer de cellen in bepaalde hoeveelheden van kleuring buffer (4 ° C) en voeg FcR blokkeren reagens (4 ° C) zoals aangegeven in tabel 1.</li>
			<li>Voeg de volgende antistoffen op de binnenzijde van het respectieve monster zoals aangegeven in tabel 1: Allophycocyanin (APC) muis anti-mens op het gebied van CD29; APC muis IgG1 κ isotype controle; Peridinin-chlorofyl eiwit (PerCP)-Cyanine5.5 muis anti-mens op het gebied van CD44; PerCP-Cyanine5.5 muis IgG2b κ isotype controle; V500 muis anti-mens op het gebied van CD45; V500 muis IgG1 κ isotype controle; Phycoerythrin (PE) muis anti-mens op het gebied van CD73; PE muis IgG1 κ isotype controle; PerCP-Cyanine5.5 muis anti-menselijke CD90; PerCP-Cyanine5.5 muis IgG1 κ isotype controle; Anti-menselijke CD105 muis: Alexa Fluor (AF) 488; muis IgG1 negatieve controle: AF488; PE-Cyanine7 muis anti-mens op het gebied van CD117; PE-Cyanine7 muis IgG1, κ isotype controle. Nadat antilichamen hebben toegevoegd aan elk monster, spin down antilichamen en meng voorzichtig. Incubeer de oplossingen voor 10 min bij 4 ° C.</li>
			<li>Voeg 1 mL PBS (4 ° C) en centrifugeren van de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
			<li>Resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS (4 ° C) en 33 µL van PFA (4%) toe te voegen. Meng de oplossingen en bewaren op ijs of bij 4 ° C tot flow cytometrische analyse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cytometrische Stroommeting van cellen Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Houden cellen op ijs tot meting.<ol>
<li>Pipetteer monsters in buizen geschikt voor stroom cytometrische metingen te onderzoeken de expressie van oppervlakte antigenen.</li>
			<li>Minstens 2 x 104 evenementen met behulp van een cytometer van de stroom te meten. Analyseren zoals afgebeeld in Figuur 2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multipotente differentiatie mogelijkheden van hDFSCs
	<ol>
<li>Gebruik een commercieel beschikbare menselijke mesenchymale stamcellen functionele identificatie Kit om te bevestigen, adipogenic, osteogenic en chondrogenic differentiatie mogelijkheden van hDFSCs. Toepassen van de ezel anti-geit AF488 secundair antilichaam voor de kleuring van vetzuur bindend-proteïne 4 (FABP4) en aggrecan evenals ezel anti-muis AF488 secundair antilichaam voor verkleuring van de osteocalcin. Voor de kleuring van kernen, montage medium met 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) te gebruiken. Opmerking: Voorbereiding van monsters zonder primair antilichaam als negatieve controles voor microscopische analyses.</li>
		<li>Het analyseren van expressie van eiwitten door laser scanning confocal microscopie. Microscopie instellingen: 40 x doelstelling met olie-immersie; excitatie laser 488 nm (voor AF488) en 405 nm (voor DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de transfectie van hDFSCs
<ol><li>Zaad na cel oogsten (1.4), hDFSCs op een 24-well cel cultuur plaat 24 h vóór transfectie. Opmerking: Het starten van de celdichtheid is ongeveer 4 x 104 cellen per putje. Cellen moeten bereiken ~ 80% samenvloeiing op dag van transfectie. Opmerking: Zaad één extra cel monster als besturingselement voor flow cytometrische analyse.</li>
	<li>Voorbereiding van transfectie complexen Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting van RNases, reinigt u de werkruimte rechtstreeks voor de bereiding van transfectie complexen met behulp van RNase decontaminatie oplossing. Gebruik alleen RNase-vrij materiaal en oplossingen. Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer.<ol>
<li>MiR-stockoplossing (50 µM) bereiden: resuspendeer Cy3-gelabelde voorloper miR (5 nmol) in 100 µL van de nuclease-vrij van het water. Aliquot verkregen stockoplossing van het miR in respectieve bedragen (5 µL) en winkel in het donker bij-20 ° C tot gebruik.</li>
		<li>Verdun 40 pmol van miR (0.8 µL van de stockoplossing van de miR 50 µM) in 66,7 µL van verminderde serum medium. Meng de oplossing voorzichtig</li>
		<li>Verdun 0,67 µL van kationische lipide gebaseerde transfectiereagens in 66,7 µL van verminderde serum medium. Meng de oplossing voorzichtig en incubeer gedurende 5 min op RT.</li>
		<li>Na incubatie toevoegen de vooraf verdunde transfectiereagens naar de vooraf verdunde miR. Meng de oplossing voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten op RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De complexen bereid transfectie ontkleuring rechtstreeks aan het kweekmedium aan cellen toevoegen. Meng voorzichtig door de 24-well cel cultuur plaat heen en weer schommelen.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2en 20% O2 gedurende 24 uur.</li>
</ol>4. analyse van de Transfectie
Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer.
<ol><li>
Cel oogsten na transfectie Opmerking: Het verzamelen van alle mobiele oplossingen van één monster in de dezelfde conische centrifugebuis van 15 mL.<ol>
<li>24 uur na de transfectie, verzamelen het supernatant van monsters in de respectieve centrifuge buizen.</li>
		<li>Cellen met 1 mL PBS wassen, Breng PBS in de respectieve centrifugebuis en voeg 500 µL trypsine/EDTA (RT) naar cellen. Incubeer de oplossingen gedurende 3 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Stoppen trypsinebehandeling door toevoeging van 1 mL gestolde voedingsbodem (RT) op de cellen en de overdracht de oplossing in de respectieve centrifugebuis. Centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Opmerking: Vanaf dit moment, houd cellen en reagentia op ijs tenzij anders vermeld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van cellen voor flow cytometrische analyse
	<ol>
<li>Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 100 µL van kleuring buffer (4 ° C) en overdracht cel oplossing voor een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
		<li>0,5 µL van amine reactieve kleurstof aan de monsters toevoegen om het onderscheid tussen levende en dode cellen. Zachtjes Meng de oplossing en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Voeg 1 mL PBS (4 ° C) tot cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS (4 ° C) en 33 µL van PFA (4%) toe te voegen. Meng de oplossingen en bewaren op ijs of bij 4 ° C tot flow cytometrische analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometrische Stroommeting van cellen Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Houden cellen op ijs tot meting.<ol>
<li>Pipetteer monsters in buizen geschikt voor stroom cytometrische metingen.</li>
		<li>Onderzoeken van de levensvatbaarheid van de cellen en miR opname efficiëntie met behulp van een cytometer van de stroom. Minstens 2 x 104 gebeurtenissen te meten. Gebruik de gating strategie afgebeeld in Figuur 4. Opmerking: Untransfected cellen worden gebruikt als negatieve controle te regelen de gating voor Cy3 positieve cellen en voor de berekening van de celdood, veroorzaakt door transfectie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volwassen stamcellen zijn momenteel in focus voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In het bijzonder, beenmerg (BM)-afgeleid van stamcellen, met inbegrip van hematopoietische stamcellen (HSCs) en de MSCs, onder intensieve klinisch onderzoek47. BM oogsten is echter een invasieve procedure veroorzaken van pijn op de site van donatie en kan leiden tot ongewenste voorvallen48. Onlangs, het postnatale tandheelkundige weefsel heeft ontpopt als een roman en g...

De menselijke tandheelkundige follikel is een losse ectomesenchymally afkomstige bindweefsel rondom de ontwikkelende tand1,2. Naast zijn functie om osteoclastogenesis en osteogenesis voor de tand uitbarsting proces te coördineren, herbergt dit weefsel cellen van de stam en voorlopercellen vooral voor de ontwikkeling van het parodontium3,4,5. De tandheelkundige follikel is derhalve als een alternatieve financieringsbron te oogsten menselijke adulte stamcellen6,7.
Verschillende studies aangetoond dat stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel (hDFSCs) geschikt zijn voor differentiatie in de parodontale afkomst, met inbegrip van botcellen, ligament fibroblasten en cementoblasts8,9,10 . Bovendien, deze cellen werden getoond aan alle kenmerken van mesenchymale stromale cellen (MSCs) met inbegrip van zichzelf vernieuwende capaciteit, de naleving van de plastic, expressie van specifieke oppervlakte markers (b.v., CD73, CD90, CD105) zo goed als osteogenic, adipogenic en chondrogenic differentiatie potentiële11,12,13. Andere studies bleek ook een potentieel van de neurale differentiatie van hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Als gevolg van hun veelbelovende eigenschappen en gemakkelijke toegang werd hDFSCs onlangs relevant voor weefsel engineering19,20,21. De eerste studies geconcentreerd op het potentieel van DFSCs voor de regeneratie van bot, parodontale en tand wortels19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Sinds de kennis van de neurogene vermogen van hDFSCs, is hun toepassing als mogelijke behandeling voor neurodegeneratieve ziekten onderzochte31,32,33. HDFSCs hebben ook opgedaan belang met betrekking tot het herstel van andere weefsels (bijvoorbeeld hoornvlies epitheel)34,35. De therapeutische mogelijkheden van hDFSC is niet alleen gebaseerd op hun directe differentiatie mogelijkheden maar ook op hun paracrine activiteit. Onlangs, hDFSCs is aangetoond dat het afscheiden van een schat aan bioactieve factoren, zoals matrix metalloproteinasen (MMP), insuline-achtige groei factor (IGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF) en hepatocyte groei factor (HGF), die een cruciale rol voor de angiogenese, immunomodulatie, extra cellulaire matrix remodelleren en herstellend processen36.
Brede klinische vertaling van stamcel therapie is echter nog steeds aangetast door verschillende uitdagingen, zoals massale eerste celdood en37,38van de effecten van de lage positieve cel van de stam. Genetische manipulatie biedt een veelbelovende strategie om deze problemen aan te pakken en daarom kan sterk verbeteren van de therapeutische werking van stamcellen38,39,40. Voor tijdelijke cel manipulatie zijn microRNAs (miRs) geschikte kandidaten, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie41,42, 43. tot op heden verschillende heilzame miRs geconstateerd bevordering van stam celproliferatie, overleving, homing, paracrine activiteit, evenals hun differentiatie in verscheidene geslachten44. Bijvoorbeeld, ontworpen miR-133a MSCs toonde een hogere overleving en de engraftment in infarcted rat hart wat resulteert in een verbeterde cardiale functie wanneer vergeleken bij ongewijzigde van de MSCs45. MiR-146a overexpressing MSCs werden ook getoond om hogere bedragen van VEGF die op zijn beurt geleid tot een verbeterde therapeutische efficiëntie in ischemische weefsel46afscheiden.
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor de selectieve extractie en genetische manipulatie van hDFSCs. Voor dit doel beschreven we de oogsten en enzymatische vertering van menselijke tandheelkundige follikels en de daaropvolgende Isolatievan hDFSCs. Om het karakteriseren van geïsoleerde cellen, zijn belangrijke aanwijzingen voor de verificatie van MSC eigenschappen opgenomen overeenkomstig de richtsnoeren van de International Society for cellulaire therapie13. Daarnaast bieden wij een gedetailleerde beschrijving voor de generatie van miR gemodificeerde hDFSCs door toepassing van een strategie van kationische lipide gebaseerde transfectie en de evaluatie van de efficiëntie van de transfectie en cytotoxiciteit.

<table><tbody><tr><td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6, monoklonaal</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Clone MAR4, monoklonaal</td></tr><tr><td>APC Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Clone MOPC-21, monoklonaal</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Clone AD2, monoklonaal</td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Clone MOPC-21, monoklonaal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>Clone 104D2, monoklonaal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>Clone MOPC-21, monoklonaal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>Clone G44-26, monoklonaal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone 27-35, monoklonaal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Clone 5E10, monoklonaal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Clone MOPC-21, monoklonaal</td></tr><tr><td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>Clone HI30, monoklonaal</td></tr><tr><td>V500 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Clone X40, monoklonaal</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0.22 &micro;m, radio-gesteriliseerde, polyethersulfone</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontaminatieoplossing; RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-gelabelde precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negatieve Controle #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA-precursor Negatieve Controle #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Kationisch lipid-gebaseerde transfectiereagens; Lipofectamine 2000 Transfectiereagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Gereduceerd serum medium; Opti-MEM I Gereduceerd Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Sterk Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>Montagemedium; Fluoroshield met DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>histologie montage medium</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-oplossing (0,05%/ 0,02%)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>in PBS, zonder: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Amine reactieve kleurstof; LIVE/DEAD&trade; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7,4; zonder: Ca en Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Basaal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filter, Sterifix spuitfilter 0,2 &micro;m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp;mL kegelvormige centrifugeerbuis</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL kegelvormige centrifugeerbuis</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flesk 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,002</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flesk, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>Vriesmedium, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Trypan blauw oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Telkamer</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Locaal verdovingsmiddel, Xylocitin (lidocaïne hydrochloride) 2% met adrenaline (epinefrine) 0,001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl oplossing</td><td>Braun</td><td></td><td>0,9 %</td></tr><tr><td>Vicryl naalden, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

isolatie, karakterisering en microrna gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Tot op heden, zijn de verschillende types van de stamcel op verschillende ontwikkelingsstadia in de focus voor de behandeling van degeneratieve ziekten. Echter verminderde bepaalde aspecten, zoals de eerste massale celdood en lage therapeutische effecten, hun brede klinische vertaling. Genetische manipulatie van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie naar voren gekomen als een veelbelovende methode voor het optimaliseren van de cel van de stam van de therapeutische effecten. Gen van de veilige en efficiënte levering systemen zijn echter nog steeds ontbreekt. Daarom kan de ontwikkeling van geschikte methoden biedt een aanpak om op te lossen van de huidige uitdagingen in stamcel gebaseerde therapieën.
Dit protocol beschrijft de extractie en de karakterisatie van menselijke tandheelkundige follikelstimulerend stamcellen (hDFSCs) en hun niet-virale genetische modificatie. De postnatale tandheelkundige follikel onthuld als een veelbelovende en gemakkelijk toegankelijke bron voor het oogsten van adulte multipotente stamcellen hoge proliferatie potentieel bezitten. De procedure beschreven isolatie presenteert een eenvoudige en betrouwbare methode om te oogsten hDFSCs van beïnvloed wijsheid tanden. Dit protocol bevat ook methoden om te definiëren van de kenmerken van de cel van de stam van geïsoleerde cellen. Voor genetische manipulatie van hDFSCs, wordt een geoptimaliseerde kationische lipide gebaseerde transfectie strategie gepresenteerd waardoor hoogefficiënte microRNA Inleiding zonder cytotoxische effecten. MicroRNAs zijn geschikte kandidaten voor voorbijgaande cel manipulatie, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie. Dit protocol vormt aldus, een veilige en efficiënte procedure voor de engineering van hDFSCs die belangrijk zijn voor het optimaliseren van hun therapeutische werking kan worden.

Hier presenteren we een gedetailleerd isolatie instructie om te oogsten van de hDFSCs van menselijke tandheelkundige follikel weefsel. Als gevolg van de gemakkelijke toegang van de tandheelkundige follikel tijdens een routine-operatie is het een veelbelovende bron voor de winning van volwassen stamcellen.
De geïsoleerde hDFSCs toonde alle kenmerken voor de definitie van MSCs13beschreven. In feite, cellen ...

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals waar een menselijke tandzak stamcellen genetisch kunnen worden gemanipuleerd om hun therapeutische eigenschappen te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stamcellen kunnen worden gewijzigd door microRNA introductie zonder het gevaar van stabiele genoomintegratie. Begin met de procedure voor enzymatische vertering van de twee follikel, door voorverwarmen tot kamertemperatuur, menselijke tandzakstamcel of hDFSC-kweekmedium en PBSPSG-oplossing.Ontdooi een aliquot elk van Collagenase type I en Dispase II voorraad oplossingen. Bereid een spijsverteringsoplossing voor door 500 microliter van de Collagenase type I-voorraadoplossing en 500 microliter van de Dispase II-voorraadoplossing toe te voegen aan 4 milliliter basalmedium met 1%antibioticum. Om besmetting op de plaats tijdens menselijke tandzakzakstamcelisolatie te voorkomen, moeten de gebruikte kweekmiddelen antibiotica bevatten.Plaats een geëxtraheerd tandzak in een steriel petrischaaltje. Voeg 10 milliliter PBSPSG-oplossing toe om het geëxtraheerde weefsel te wassen. Aspirate en gooi de o

isolation-characterization-microrna-based-genetic-modification-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

De voortdurend groeiende muis snijtand is een model voor het bestuderen van de vernieuwing van tandweefsel van tandheelkundige epitheliale stamcellen (DESCs). Een robuust systeem voor consistente en betrouwbare wijze verkrijgen van deze cellen van de snijtanden en de uitbreiding van deze in vitro wordt hier gemeld.

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Een ideaal model voor het bestuderen van de biologie van volwassen stamcellen is de muis haarfollikel. Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van verschillende populaties van haarfollikelstamcellen en epidermale keratinocyten, met behulp van enzymatische vertering van de dorsale muishuid gevolgd door FACS-analyse.

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

De tandheelkundige follikel bevat een epitheliale populatie en mesenchymale cellen. De epitheliale populatie werd geselecteerd uit de heterogene tandheelkundige follikelcelpopulatie door een afzonderlijk kweekmedium te bieden. Epitheelcellen overleefden en vormden kolonies in een serumvrij medium.

Isolatie van epitheelcellen uit menselijke tandheelkundige follikel

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

De isolatie van BAMBIhogeMFGE8hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBIhogeMFGE8hoge UC-MSC's.

Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

Leer de isolatie en microRNA-gebaseerde genetische modificatie van humane tandheelkundige follikelstamcellen. Deze veilige methode verbetert therapeutische eigenschappen zonder stabiele genoom-integratie.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Meer video's verkennen