Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals waar een menselijke tandzak stamcellen genetisch kunnen worden gemanipuleerd om hun therapeutische eigenschappen te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stamcellen kunnen worden gewijzigd door microRNA introductie zonder het gevaar van stabiele genoomintegratie. Begin met de procedure voor enzymatische vertering van de twee follikel, door voorverwarmen tot kamertemperatuur, menselijke tandzakstamcel of hDFSC-kweekmedium en PBSPSG-oplossing.

Ontdooi een aliquot elk van Collagenase type I en Dispase II voorraad oplossingen. Bereid een spijsverteringsoplossing voor door 500 microliter van de Collagenase type I-voorraadoplossing en 500 microliter van de Dispase II-voorraadoplossing toe te voegen aan 4 milliliter basalmedium met 1%antibioticum. Om besmetting op de plaats tijdens menselijke tandzakzakstamcelisolatie te voorkomen, moeten de gebruikte kweekmiddelen antibiotica bevatten.

Plaats een geëxtraheerd tandzak in een steriel petrischaaltje. Voeg 10 milliliter PBSPSG-oplossing toe om het geëxtraheerde weefsel te wassen. Aspirate en gooi de oplossing weg en voeg verse PBSPSG-oplossing toe om de was te herhalen.

Met behulp van een steriele scalpel gehakt de geëxtraheerde follikel in stukken als ongeveer 1 bij 1 millimeter. Breng het gehakte weefsel en PBSPSG-oplossing van de petrischaal in een 50 milliliter conische centrifugebuis, was de petrischaal met 10 milliliter PBSPSG-oplossing en breng de oplossing in dezelfde buis. Centrifuge de conische buis op 353 x g bij kamertemperatuur gedurende tien minuten.

Voeg 5 milliliter spijsverteringsoplossing toe aan het gepalleteerde weefsel, meng de oplossing en het weefsel voorzichtig, broed het mengsel twee uur lang uit bij 37 graden Celsius en 5% CO2 in een schuddende couveuse. Na twee uur, centrifugeren de verteerde cel en weefsel suspensie op 353 g gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg en hang de verkregen pallet opnieuw op in 6 milliliter HDFSC-kweekmedium.

Zaad de cel suspensie in een 25 vierkante centimeter cel cultuur fles, en incubeer de cellen op 37 graden Celsius. Na cel oogst en karakterisering van HDFSC is zoals beschreven in de tekst protocol, zaad hDFSCs in een 24 goed celkweekplaat. Incubeer bij 37 graden celsius, 5%CO2 en 20%Zuurstof gedurende 24 uur.

Op de volgende dag verdun 40 picomoles van microRNA in 66.7 microliter van verminderd serummiddel, en draaikolk de oplossing. Verdun 0,67 microliter kationisch lipidegebaseerd, transfectiereagensagemiddel in 66,7 microliter van verlaagd serummedium, vortex de oplossing en incuboïde vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na vijf minuten het voorverdunde microRNA toe aan het voorverdunde transfectiereagens, meng de oplossing en broed gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens de voorbereide transfectiecomplexiteiten, dropwise, direct toe aan het kweekmedium op cellen. Meng zachtjes door het schommelen van de 24 goed cel cultuur plaat heen en weer. Broed de cellen 24 uur lang in op 37 graden Celsius.

24 uur na de transfectie, verzamel de supernatant van monsters in respectievelijk 15 milliliter conische centrifugebuizen. Was de cellen met 1 milliliter PBS en breng de PBS over in de respectievelijke centrifugebuis. Voeg 500 microliter druppels en EDTA toe aan de cellen en broed de 24 putplaat uit op 37 graden Celsius, gedurende 3 minuten.

Stop de trypsinisatie door 1 milliliter celkweekmedium voor de cellen toe te voegen en de oplossing over te brengen naar de respectievelijke centrifugebuis. Centrifugeren de cellen op 300 x g en 4 graden celsius gedurende tien minuten. Vanaf hier houden de cellen en reagentia op ijs, tenzij anders vermeld.

Gooi de supernatant weg, zet de cellen opnieuw op in 100 microliter kleuringsbuffer en breng de celoplossing over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 0,5 milliliter amine reactieve kleurstof toe aan elk monster om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Meng de oplossing voorzichtig en broed gedurende tien minuten uit op 4 graden Celsius.

Voeg 1 milliliter PBS toe aan de cellen, en centrifuge bij 300g en 4 graden Celsius gedurende tien minuten Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 100 microliter van PBS, voeg 33 microliter paraformaldehyde toe en meng de oplossingen, bewaar de monsters op 4 graden Celsius beschermd tegen licht tot stroom cytometrische metingen. Breng de monsters over naar buizen die geschikt zijn voor cytometrische metingen en voer stroomcytometrie uit met behulp van de gatingstrategie die in het tekstprotocol wordt beschreven. De geïsoleerde menselijke tandzakstamcellen toonden alle kenmerken die voor de definitie van mesenchymale stromalcellen worden beschreven, de cellen waren plastichangend en toonden een glasvezel zoals morfologie, onder standaardcultuurvoorwaarden.

Flow cytometrische analyse bleek dat hDFSCs uitgedrukt een paneel van bepaalde oppervlakte antigenen, waaronder CD29, CD44, CD73, CD90, en CD105. Terwijl CD45 en CD117 afwezig waren. De adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie mogelijkheden van cellen onder specifieke In Vitro kweekomstandigheden werd bevestigd door immunostaining, een vetzuur bindend eiwit voor: Osteocalcin, en Aggrecan.

De gating strategie die wordt gebruikt voor de kwantificering van cytotoxiciteit en Cy3 gelabelde microRNA opname-efficiëntie 24 uur na transfectie, bevestigde microRNA opname in 100% van de levensvatbare cellen. Vergelijkbare hoeveelheden dode cellen in transfectede en onverzettede monsters geven aan dat microRNA efficiënt wordt geïntroduceerd zonder cytotoxische effecten. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals transdifferentiatie, om aanvullende vragen zoals Cytolab-plasticiteit te beantwoorden.