Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay
14 augustus 2018
Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.
Deze methode kan belangrijke onderzoeksvragen beantwoorden in de neurowetenschappen, oncologie en daarbuiten, zoals celtype-specifieke expressie en ruimtelijke kaartlegging van splice-varianten binnen de hersenen en tumoromgevingen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het exon-juncties, korte sequenties en puntmutaties in het weefselcontext kan detecteren met zeer hoge gevoeligheid en specificiteit in enkele cellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hell Pimentel, een universitair docent van ons laboratorium.
Om het weefsel voor te bereiden, fixeer het onmiddellijk na de dissectie gedurende 16 tot 32 uur in 10% neutraal gebufferd formaline op kamertemperatuur. Vervolgens wordt het monster verwerkt en in paraffine ingebed volgens standaardprocedures. Snijd het ingebedde weefsel in secties van vijf plus of min één micron met behulp van een microtoom.
Monteer de secties op elektrostatisch zelfklevende glazen platen en laat ze een nacht drogen bij kamertemperatuur. Een uur voordat de RNA NC2 hybridisatietest wordt uitgevoerd, plaats de gemonteerde weefselplaten in een platenrek en bak ze in een oven met circulerende lucht bij 60 graden Celsius. Zorg ervoor dat de hybridisatieoven op 40 graden Celsius staat voordat u de RNA NC2 hybridisatietest start.
Maak het bevochtigingspapier grondig nat, verwijder eventueel resterend water en plaats het deksel op de bevochtigingsregelaar. Bereid 200 milliliter commercieel verkrijgbaar 1X doelretrievalreagens voor door 20 milliliter 10X doelretrievalreagens toe te voegen aan 180 milliliter water. Plaats twee schuifjes in een stoommachine.
Vul één schuifje met 200 milliliter 1X doelretrievalreagens en de andere met 200 milliliter water. Verwarm beide oplossingen met behulp van de stoommachine tot kookpunt. Verwarm de 50X spoelbuffer gedurende 10 tot 20 minuten tot 40 graden Celsius.
Bereid vervolgens drie liter 1X spoelbuffer door 60 milliliter voorverwarmde 50X spoelbuffer te verdunnen met 2,94 liter water. Bereid in een afzuigingskast 50% Gill's hematoxine tegenkleuringsoplossing door 100 milliliter Gill's hematoxine toe te voegen aan 100 milliliter water. Bereid een bleekmiddel voor door 1,43 milliliter 20 tot 30% ammoniumhydroxide toe te voegen aan 250 milliliter water.
Verwarm de doelprobes gedurende 10 minuten op 40 graden Celsius voorafgaand aan probe hybridisatie. Breng de zeven versterkende reagentia, Amp 0 tot 6, op kamertemperatuur. Start het deparaffiniseren van het monster door secties uit de oven te verwijderen en de gemonteerde weefselplaten gedurende vijf minuten in xyleen met roeren te dompelen.
Deparaffiniseer opnieuw in vers xyleen gedurende vijf minuten. Ontvetten in 100% ethanol met roeren gedurende twee minuten. En herhaal opnieuw in vers 100% ethanol gedurende twee minuten.
Laat de platen gedurende vijf minuten drogen bij 60 graden Celsius in een oven met circulerende lucht totdat ze volledig droog zijn. Bewerk de secties vervolgens met ongeveer vier druppels gebruiksklare waterstofperoxide bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te onderdrukken. Giet de oplossing van de platen en spoel ze twee keer met water.
Dompel de secties kort in het voorverwarmde water en plaats de secties vervolgens in 200 milliliter doelretrievalreagens op 100 graden Celsius in de stoommachine gedurende 15 tot 30 minuten. Verwijder de platen uit de doelretrieval en spoel ze twee keer met water. Dompel in 100% ethanol gedurende drie minuten.
Laat de platen vervolgens drogen bij 60 graden Celsius in een oven met circulerende lucht totdat ze volledig droog zijn. Zodra de platen droog zijn, gebruik een hydrofobe pen om een ongeveer 0,75 bij 0,75 inch hydrofobe barrière rond de sectie te tekenen. Laat de barrière een minuut volledig drogen bij kamertemperatuur.
Plaats de platen in een platenrek en plaats het platenrek in de voorverwarmde vochtigheidsgecontroleerde lade. Voeg ongeveer vier druppels protease 3 toe aan elke plaat en incubeer gedurende 15 tot 30 minuten bij 40 graden Celsius in de hybridisatieoven. Giet de oplossing van de platen en spoel ze twee keer met water.
Om de probe hybridisatieprocedure te beginnen, voeg ongeveer vier druppels van de juiste gebruiksklare probe-oplossing toe om de hele sectie te bedekken. Hybridiseer de probes gedurende twee uur bij 40 graden Celsius in de hybridisatieoven. Giet de oplossing van de platen en was de platen in 200 milliliter 1X spoelbuffer bij kamertemperatuur met af en toe roeren gedurende twee minuten.
Herhaal de wasprocedure. De volgende stap is het versterken van het signaal door de secties te incuberen in een reeks versterkende reagentia. Voeg ongeveer vier druppels Amp 0 toe om de hele sectie op elke plaat te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius in de hybridisatieoven.
Giet vervolgens de oplossing af en was de platen in 200 milliliter 1X spoelbuffer bij kamertemperatuur met af en toe roeren gedurende twee minuten. Herhaal de wasprocedure. In dezelfde wijze, incubeer de secties in Amp 1 tot Amp 6 bij de temperatuur en voor de hoeveelheid tijd die in dit schema is aangegeven.
Nadat de platen zijn behandeld met de reeks versterkende reagentia, bereid een werkoplossing van Fast Red kleurstof voor. Voeg het juiste volume Fast Red-B kleurstof en Fast Red-A kleurstof toe aan een buis en meng goed. Giet het overtollige vocht van de platen en voeg de werkoplossing van Fast Red kleurstof toe aan de platen.
Incubeer de platen in een lade met een deksel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na 10 minuten, giet de Fast Red-oplossing af en spoel de platen twee keer door ze op en neer te dompelen met kraanwater. Om de weefselsecties tegenkleuren, dompel de platen gedurende twee minuten in 50
Overzicht
Dit artikel presenteert een in situ hybridisatie-assay die de gevoelige en specifieke detectie van RNA-sequenties toestaat, zo kort als 50 nucleotiden, op het niveau van een enkele cel. De methode is toepasbaar in verschillende gebieden, waaronder neurowetenschappen en oncologie, en vergemakkelijkt de visualisatie van splice-varianten en mutaties binnen weefselcontexten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- In situ hybridisatie is een krachtige techniek voor het bestuderen van genexpressie.
- Single-cell resolutie maakt gedetailleerde analyse van cellulaire heterogeniteit mogelijk.
- Detectie van splice-varianten en mutaties is cruciaal voor het begrijpen van ziektemechanismen.
- De assay kan handmatig of automatisch worden uitgevoerd, waardoor de toegankelijkheid wordt verbeterd.
Doel van studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het detecteren van korte RNA-sequenties met hoge gevoeligheid.
- Om visualisatie van genexpressiepatronen in weefselmonsters mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar celtype-specifieke expressie in verschillende biologische contexten te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van weefselmonsters met behulp van formaline-fixatie en paraffine-inbedding.
- Sectie van weefsel in dunne plakjes voor hybridisatie.
- Gebruik van target retrieval-reagentia en hybridisatie-probes.
- Amplificatie van signalen met behulp van een reeks reagentia om detectie te verbeteren.
Belangrijkste resultaten
- De assay detecteerde met succes exon-juncties en puntmutaties.
- Hoge specificiteit en gevoeligheid werden bereikt in single-cell analyses.
- Visualisatie van splice-varianten werd aangetoond in hersen- en tumorweefsels.
- De methode toonde potentieel voor bredere toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden.
Conclusies
- Deze in situ hybridisatie-assay is een waardevol hulpmiddel voor moleculair biologie-onderzoek.
- Het biedt inzichten in genexpressie op het niveau van een enkele cel.
- De techniek kan helpen bij het begrijpen van complexe biologische processen en ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate detection of RNA biomarkers in their native tissue context is critical for target validation and biomarker-driven drug development in oncology and neuroscience. This RNA in situ hybridization assay enables sensitive and specific visualization of splice variants, short sequences, and point mutations at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker alignment. By preserving spatial information lost in grind-and-bind methods, it enhances predictive confidence in preclinical target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing exon junction-specific splice variants like EGFRvIII and METΔ14 in tissue context.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data to clarify pathway activation and cellular heterogeneity in tumor microenvironments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by distinguishing mutant from wild-type alleles at single-nucleotide resolution (e.g., EGFR L858R, KRAS G12A).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects RNA targets as short as 50 nucleotides, enabling CDR3 sequence profiling in immune repertoires for immuno-oncology target discovery.
- Operational Value: Compatible with automated staining platforms, supporting assay standardization and scalability across preclinical programs.
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts that aid in assay optimization and reproducibility assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detection of clinically actionable variants in FFPE glioblastoma and cell line models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining morphological context during molecular analysis.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking genetic variants to cellular phenotypes in tissue sections.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly where spatial validation of genetic alterations informs target confidence and de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splice variant functionality and mutation impact in native tissue architecture.
- Screening: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening via spatially resolved target confirmation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell measurements of RNA variants that help compare experimental conditions and allelic ratios.
- Translational Research: Connects molecular findings to histopathological context, supporting biomarker-driven patient stratification models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for longitudinal monitoring of target expression across models and therapeutic interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from bulk RNA methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols compatible with manual and automated workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved evidence of target engagement and variant prevalence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on co-expression with phenotypic markers in tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, molecular pathology, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, slide processing systems, and automated stainers for high-throughput use.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and bioinformatics for consistent probe design and data interpretation.
- Must account for tissue fixation variables (e.g., formalin penetration time) that may affect accessibility of short or structured RNA targets.
- Limited by target availability; efficacy depends on probe specificity and accessibility of epitopes in FFPE sections.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Tissue Preparation
1:30
Equipment and Reagent Preparation
3:24
Sample Deparaffinization, Dehydration, and Pre-treatment
5:26
Probe Hybridization, Signal Amplification, and Detection
7:18
Counterstaining, Slide Mounting, and Visualization
8:18
Results: Detection of Splice Variants, Short Sequences, and Point Mutation In Situ
10:00
Conclusion
