Name: Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer de biochemische karakterisering van tRNA-isopentenyl transferase-activiteit in vitro met dit eenvoudige en directe assay. Deze methode detecteert covalente RNA-modificaties en is aanpasbaar voor diverse RNA-modificerende enzymen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij wil Dr. David Engelke bedanken voor zijn begeleiding en nuttige opmerkingen op dit manuscript. PJS - Ball State University laboratorium opstarten middelen; SCHAR - 1R15AI130950-01 verlenen.

Opmerking: Het protocol werd aangepast van Ref. 24.
1. verkrijgen van RNA en enzym van belang
<ol><li>Gebruik in vitro getranscribeerd RNAs intern aangeduid met 32P en recombinant His6-Mod5 uitgedrukt in en gezuiverd van E. coli, als eerder beschreven24.<ol>
<li>Voeren in vitro getranscribeerd RNAs (sectie 3) met behulp van T7 RNA polymerase in aanwezigheid van labelloze ATP, UTP, CTP, GTP en 10 µCi van gel-gezuiverd, ethanol-neergeslagen α-ATP, geresuspendeerde in 1 x TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA), en opgeslagen bij-80 ° C 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>U kunt ook verkrijgen verkrijgbare fluorescently geëtiketteerde RNAs van belang. De enzyme(s) van belang in elk gewenste expressie systeem produceren. Let op: Interne fluorescerende labels in het RNA kunnen veranderen RNA structuur en erkenning door enzymen.</li>
</ol>2. het opstellen van een 20% Polyacrylamide denaturering van Gel
Opmerking: Met het oog op een voldoende resolutie van RNA fragmenten, een 40 cm lengte verticale plaat gel wordt aanbevolen. De breedte van de gel gebruikt wordt bepaald door het aantal monsters te analyseren.
<ol><li>Grondig schoon glasplaten. Eerst wassen met zeep en water, spoel goed met gedeïoniseerd water, en tot slot schoon met isopropanol en pluisvrije doekjes.</li>
	<li>Het monteren van de platen en afstandhouders.</li>
	<li>Meng de volgende reagentia om 100 mL 20% acrylamide, 7,5 M ureum, 1 x TBE gel: 80 mL ureum gel concentreren (237.5 g/L van acrylamide, 12,5 g/L methyleen bisacrylamide, 7,5 M ureum in gedeïoniseerd water), 10 mL verdunningsmiddel van ureum gel (7.5M ureum in gedeïoniseerd water) , en 10 mL van ureum gel buffer (0,89 M Tris-boraat-20 mM EDTA buffer pH 8.3 en 7.5 M ureum). Opmerking: De hoeveelheid gel oplossing moet worden aangepast volgens de afmetingen van de gel.</li>
	<li>Voeg 40 µL van N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) en 800 µL van vers bereide 10% ammoniumnitraat persulfate (APS).</li>
	<li>Gel oplossing opstellen in een grote injectiespuit en afzien tussen de glazen platen. Kraan op glas met vingers tijdens het gieten om te voorkomen dat de formatie van de zeepbel.</li>
	<li>Laat gel te stollen voor 30 min.</li>
	<li>Klem gestolde gel op verticale gel apparaat met bindmiddel clips.</li>
	<li>Bovenste en onderste buffer kamers vullen met 1 x TBE.</li>
	<li>Twee uur vóór het laden van de gel, stel vooraf de gel op 20 mA, voor 2 h om de grens van de buffer te verslaan de kleinste oligonucleotides - anders de kleinste nucleotiden en oligonucleotides neigen te storten aan de voorzijde van de buffer.</li>
</ol>3. RNA Isopentenylation Assay
<ol><li>Bereiden reacties in een eindvolume van 17 µL, 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1.2 mM ATP, 5.8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 U van RNase remmer (bijvoorbeeldSuperRNaseIn), 40.000 CPM intern 32P-geëtiketteerden RNA, 5.3 µM met Mod5, en 1.2 mM 2 - mercaptoethanol.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur reacties.</li>
	<li>Ethanol-neerslag RNAs gebruik van 2,5 volumes (42,5 µL) van 100% ethanol en 1/10 volumes (1.7 µL) van 3,5 M natrium acetaat pH 5.5, en plaats bij-20 ° C voor 1 h of 's nachts.</li>
	<li>Centrifugeer RNA monsters voor 20 min op 15,400 x g- en 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig en wassen van de RNA-pellet met 500 µL van 70% ethanol.</li>
	<li>Monsters van de centrifuge op voor 5 min 15,400 x g- en 4° C.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant en aan RNA pellets gedurende 15 minuten of totdat alle ethanol is verdampt.</li>
	<li>Resuspendeer RNA pellets in 10 µL van 8 M ureum.</li>
	<li>Voeg 150 U van RNase T1 en Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Voeg 2 µL van 6 x het laden van de buffer (60% glycerol, 0,1% xyleen cyanol).</li>
	<li>Laden 10 µL van elk monster RNA op een vooraf uitvoeren, 20% polyacrylamide, 7,5 M ureum gel (zie punt 2 van Protocol). Opmerking: Radiolabeled RNA grootte ladders kunnen worden opgenomen als een markering voor extra mobiliteit.</li>
	<li>Gel voor 2 h draaien op 25 mA.</li>
	<li>Stoppen met gel en verwijderen van apparaten.</li>
	<li>Break afdichting tussen de twee glasplaten en verwijder een van de glazen platen, met de gel nog op de bodemplaat "". Opmerking: Wees voorzichtig niet te scheuren van de gel tijdens deze stap.</li>
	<li>Plaats een laagje plastic wikkel over de gel en bloot op een scherm van fosfor voor 3 h. anderzijds plaats gel op chromatografie papier en droog met een gel droger voorafgaand aan fosfor scherm blootstelling.</li>
	<li>Fosfor scherm op een fosfor imager.</li>
</ol>

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li>
<li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li>
<li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+modification+of+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li>
<li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li>
<li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li>
<li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li>
<li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li>
<li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li>
<li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+MOD5%2C+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li>
<li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li>
<li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li>
<li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li>
<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
<li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li>
<li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA-modifying+protein%2C+TRIT1%2C+forms+amyloid+fibers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23716598">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li>
<li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li>
<li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N%281%29-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+reveals+a+conserved%2C+widespread%2C+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li>
<li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053(2011).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

Geen openbaar te maken.

RNA wijzigingen blijven aan steeds meer belangrijke en gevarieerde rol spelen in de cellulaire en organisch functie getoond. Als zodanig, staat de ontwikkeling van tests te ondervragen van RNA wijzigen enzymen centraal in het meer inzicht te krijgen in de fundamentele aspecten van de biologie. Dit protocol beschrijft een hoge resolutie in vitro assay karakteriseren de tRNA wijziging activiteit van Mod5.
Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het verstrekken van een directe, en ...

Ten minste 163 verschillende posttranscriptional RNA wijzigingen zijn geïdentificeerd, met deze wijzigingen verlenen divers en context-afhankelijke functies aan RNAs direct RNA structuur te beïnvloeden en op het gebied van interacties van RNA met andere moleculen1,2. Naarmate de waardering voor het aantal en de verscheidenheid van RNA wijzigingen toeneemt, is het essentieel om te testen dat betrouwbaar ondervragen kunnen zowel de RNA-wijzigingen en de enzymen die hen katalyseren ontwikkelen.
Een van de eerste wijzigingen van het RNA kan worden geïdentificeerd optreedt bij base 37 in tRNAs, grenzend aan de anti-codon op de 3' kant3,4. Een groep isopentenyl wordt overgedragen van dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) naar de positie van de N6 van adenosine 37 (ik6A37) 3,,5 op een subset van zowel de cytoplasmatische en de mitochondriale tRNAs. Ik6A37 verbetert vertaling trouw en efficiëntie door het verhogen van het tRNA affiniteit voor het ribosoom4,6 en ik6A37 is belangrijk voor de stressrespons bij bacteriën7. De enzymen die het uitvoeren van deze wijziging tRNA isopentenyl enzym worden genoemd en zijn zeer geconserveerd in bacteriën8,9, schimmels10wormen11, planten12en hogere eukaryoten13 , met inbegrip van mensen14.
Mutaties in het menselijk tRNA isopentenyl transferase gen, TRIT1, worden geassocieerd met ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, is een mutatie in TRIT1 gecorreleerd met een ernstige Mitochondriale ziekte, waarschijnlijk veroorzaakt door een defect in de mitochondriële eiwit synthese15,16. Verder TRIT1 is beschreven als een tumor suppressor gen17,18 en is betrokken bij verschillende soorten kanker, met inbegrip van melanoom19, borst20, maag21en longkankerziekten22 ,23. Tot slot, TRIT1 en Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl enzym zijn aggregatie-naar voren gebogen eiwitten die prion-achtige amyloïde vezels24,25,26 vormen. Deze opmerkingen betrekken mogelijk tRNA isopentenyl enzym in neurodegeneratieve ziekten, hoewel directe bewijs hiervoor is nog niet aangetoond.
Gezien de rol van dat isopentenyl enzym in vertaling en ziekte, methoden die direct meten ik6een isopentenyl transferase activiteit zijn belangrijk voor een mechanistische begrip van deze enzymen onder normale en ziekte staten. Een toenemend aantal methoden zijn beschikbaar om te detecteren ik6A RNA wijzigingen, met inbegrip van in vitro isopentenylation testen, positieve kruising bij gebrek aan ik6een (PHA6) testen, dunne laag chromatografie (TLC), amino acid aanvaarding activiteit testen en massaspectrometrie benaderingen (herzien in Ref. 4).
Een isopentenylation in vitro assay is beschreven dat gebruik maakt van de 14C-DMAPP en labelloze tRNAs. In deze test, wordt radioactieve koolstof overgebracht naar RNA van 14C-DMAPP door de isopentenyl transferase. Terwijl deze test zeer gevoelig is, is het vaak moeilijk om te bepalen de specifieke residu dat is gewijzigd9,20,27. PHA6 testen zijn afhankelijk van de omvangrijke ik6A wijziging kruising van een 32P-geëtiketteerden sonde verspreid over het gewijzigde residu verstoren. Als zodanig, hybridisatie is groter bij gebrek aan een i6een wijziging18,28,29. PHA6 testen zijn zeer gevoelig, en staat totaal RNA cellulaire lysates is onttrokken te analyseren. Bovendien geeft de mogelijkheid om het ontwerp van de sondes die specifiek zijn voor het RNA van belang deze methode aanzienlijke doel flexibiliteit. PHA6 tests zijn echter beperkt tot de karakterisering van de wijzigingen die optreden inzake residuen in het gerichte gebied van de sonde en zijn dus minder kans op identificatie van nieuwe wijziging sites. Bovendien, zoals gebrek aan bindende is een indicatie van de wijziging, zal andere wijzigingen of mutaties die invloed hebben op RNA-bindende verwarren gegevensanalyse.
Een andere benadering combineert benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose chromatografie met aminozuur aanvaarding activiteit als een uitlezing van ik6A wijzigingen in tRNA30. Deze aanpak testen direct de functie van de i6A wijziging, maar het is een indirecte benadering te detecteren ik6A wijziging en mist resolutie om wijzigingen aan een specifiek residu in het RNA in kaart. Een TLC-aanpak is gebruikt voor het detecteren van totale tRNA ik6A wijzigingen. In deze benadering intern 32P-label tRNAs naar één nucleotiden worden verteerd en tweedimensionale TLC-analyse wordt gebruikt ter identificatie van de isopentenylation. Deze benadering is zeer gevoelig voor het opsporen van total ik6A in een RNA monster maar op de spijsvertering, alle opeenvolgingsinformatie verloren; de onderzoeker heeft dus geen enkele manier om te bepalen welke residuen geweest gewijzigde31.
Meer recentelijk, vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) methoden hebben ontwikkeld die kwantitatief vergelijk totale RNA wijzigingen tussen soorten, celtypes en proefomstandigheden32,33, 34. Een beperking van deze methode is dat het minder goed in staat om de identiteit en positie binnen het RNA waaruit de gemodificeerde nucleoside was afgeleid34. Bovendien, de deskundigheid en apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van deze experimenten beperken de bruikbaarheid van deze aanpak.
Daarnaast zijn verschillende technologieën van de volgende generatie sequencing ontwikkeld om te kaart RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende34. Immunoprecipitation van RNAs met antilichamen specifiek voor een bepaalde wijziging (RIP-Seq) kunnen de onderzoeker te identificeren alle sequenties met een specifieke wijziging35,36. Reverse-transcriptase-gebaseerde benaderingen zoals Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing is bovendien afhankelijk van verstoringen van de omgekeerde transcriptie reactie op de gewijzigde residuen37,38,39. Ondanks het voordeel van deze technieken om de kaart van RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende, worden RIP-seq en Chem-Seq technologieën beperkt door het gebrek aan betrouwbare antilichamen of reactieve chemicaliën beschikbaar voor elke specifieke modificatie, respectievelijk34. Bovendien, reverse-transcriptase enzymen moeten uitvoeren Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing technieken kunnen worden belemmerd door stabiele RNA structuren. De sterk gewijzigde en structureel stabiele aard van tRNAs maken hen bijzonder moeilijk te ondervragen met behulp van deze technieken. Tot op heden, hebben next-generation sequencing gebaseerde technologieën niet nog is gebruikt om kaart ik6een wijzigingen-34.
Hierin beschrijven we een eenvoudige en directe aanpak om te detecteren ik6A tRNA wijzigingen in vitro. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met recombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse ik6A wijzigingen in kaart. Deze aanpak is direct en vereist weinig gespecialiseerde expertise om de gegevens te analyseren. Bovendien is deze methode kan worden aangepast aan andere RNA wijzigen van enzymen, met inbegrip van enzymen die covalent het molecuulgewicht van RNA of een RNA van mobiliteit door een gel veranderen.

<table><tbody><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UreaGel Concentrate</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als onderdeel van een kit</td></tr><tr><td>UreaGel Diluent</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als onderdeel van een kit</td></tr><tr><td>UreaGel Buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als onderdeel van een kit</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als onderdeel van een kit</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyleendiamine (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Xyleencyanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur en benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korte glazen platen (20-40 cm B x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lange glazen platen (20-40 cm B x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verticaal gelapparaat</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>50 mL wegwerpspuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Binderclips van roestvrij staal</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosfoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Plasticfolie</td><td>(plaatselijke supermarkt)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een in vitro assay trna-isopentenyl transferase activiteit detecteren

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6- isopentenyladenosine RNA wijzigingen zijn functioneel divers en hoogst geconserveerde onder de prokaryoten en de eukaryoten. Een van de hoogst geconserveerde N6- isopentenyladenosine wijzigingen plaatsvindt aan de A37 positie in een subset van tRNAs. Deze wijziging verbetert vertaling efficiëntie en trouw doordat de affiniteit van het tRNA van het ribosoom. Mutatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor deze wijziging in eukaryoten zijn geassocieerd met verschillende staten van de ziekte, met inbegrip van mitochondriale dysfunctie en kanker. Daarom is het belangrijk voor begrip van de normale en pathologische eukaryotische biologie inzicht in de specificiteit van het substraat en biochemische activiteiten van deze enzymen. Veelzijdige methoden heeft tewerkgesteld te karakteriseren ik6A wijzigingen. Hierin is beschreven van een directe aanpak voor het opsporen van isopentenylation door Mod5. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met een recombinant isopentenyl transferase, gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse te detecteren ik6A wijzigingen. Bovendien, wordt het potentiële aanpassingsvermogen van dit protocol te karakteriseren van andere RNA-aanpassen-enzymen besproken.

Mod5 was geïncubeerd met een tyrosine tRNA of serine tRNA in de aanwezigheid of afwezigheid van DMAPP. Na de wijziging reactie waren producten RNase T1-verteerd, die cleaves het einde 3' van alle guanosines verlaten van een 3' calciumguanosine monophosphates (GMP)24 (Figuur 1). Volledige spijsvertering van de RNAs produceert een voorspelbaar patroon van radiolabeled fragmenten(Figuur 2),di...

Hier beschrijven we een protocol voor de Biochemische karakterisering van de gist RNA-aanpassen enzym, Mod5, en bespreken hoe dit protocol kan worden toegepast op andere RNA-aanpassen-enzymen.

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Het algemene doel van dit protocol is om biochemisch te karakteriseren tRNA-Isopentenyl Transferase Activiteit In Vitro. Deze methode is nuttig voor de in-vitro detectie en karakterisering van tRNA-isopentenyl transferase activiteit van gezuiverde recombinante enzymen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en directe test wordt gebruikt om een covalente RNA-modificatie te detecteren.Hoewel deze methode inzicht geeft in tRNA-isopentenyl transferase activiteit, is het potentieel aanpasbaar voor de biochemische karakterisering van breed scala of RNA wijzigenzymen. De eerste stap in deze procedure is om de glasplaten die zullen worden gebruikt voor het gieten van de gel grondig schoon te maken. Was de borden met zeep en water, spoel goed af met gedeïoniseerd water en maak de borden schoon met isopropanol en pluisvrije doekjes.Monteer vervolgens de platen en afstandhouders. Meng de volgende reagentia om een 100 milliliter 20% acrylamide, 7.5 molaire ureum, 1x TBE gel te maken. 80 milliliter ureum gelconcentraat, 10 milliliter ureum gel verdunningsmiddel en 10 milliliter ureumgelbuffer.Voeg 40 microliter T-med en 800 microliter vers bereide 10% ammoniumpe

an-in-vitro-assay-to-detect-trna-isopentenyl-transferase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT...

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole en haar freebase analoge vertonen een lage micromolaire cel cytotoxiciteit. Dit manuscript beschrijft een RNA transcriptie reactie, beeldvorming RNA met ethidiumbromide gekleurde gel en kwantificeren RNA met UV-Vis spectroscopie, teneinde transcriptie remming te bepalen door corroles en toont een eenvoudige methode voor de beoordeling antikanker kandidaat eigenschappen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Leer de biochemische karakterisering van tRNA-isopentenyl transferase-activiteit in vitro met dit eenvoudige en directe assay. Deze methode detecteert covalente RNA-modificaties en is aanpasbaar voor diverse RNA-modificerende enzymen.

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

Meer video's verkennen