Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica

Deze methode kan helpen bij de sleutelvraagstukken op het gebied van insectentoxicologie, zoals, of alle expressie van metabolische ontgiftingsgenen betrokken zijn bij insecticideresistentie? Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om grotere hoeveelheden eiwitten te produceren en de functie van deze eiwitten bij het metabolisme van insecticiden in vitro te karakteriseren. Xuechun Feng, een afstudeerstudent in mijn laboratorium, zal de procedures demonstreren.

Xuechen's PhD-onderzoek richt zich op de karakterisering van de functie van carboxylesterase bij parasietresistentie van huismuggen, Musca domestica. Om te beginnen, meng één microliter GFP-entryplasma-DNA met vijf microliter van een commercieel verkrijgbaar C-term lineair DNA in 250 microliter PCR-buisjes. Voeg vervolgens twee microliter commercieel verkrijgbare lambda-recombinatiemix toe aan elk van de PCR-buisjes.

Meng de buisjes voorzichtig en incubeer ze een nacht bij 25 graden Celsius. Zaai twee milliliter log-fasegroei van insect SF9-celcultuur gelijkmatig in de putjes van een celcultuurplaat. Laat de cellen vervolgens minimaal drie uur bij kamertemperatuur in de kap aanhechten.

Gebruik een omgekeerd fase microscoop bij 250x om de celaanhechting te controleren. Vervolgens verwijdert u het celcultuurmedium en vervangt u het door twee milliliter Grace's insectenmedium. Bereid vervolgens transfectiemixtuur A en B-oplossingen volgens het tekstprotocol.

Meng vervolgens voorzichtig transfectiemixtuur A en B door de buisjes te tikken. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur, in de kap, gedurende 35 minuten. Voeg vervolgens het mengsel druppelsgewijs toe aan de gezaaide cellen.

Versluit de putjes met tape en incubeer de cellen een nacht bij 27 graden Celsius. Vervang de twee milliliter Grace's insectenmedium door twee milliliter compleet groeimedium. Voeg vervolgens 100 micromol Ganciclovir toe aan elke put.

Versluit de putjes met tape en incubeer de cellen 72 uur bij 27 graden Celsius. Verzamel 72 uur na infectie het medium uit elke put en breng het over in 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes. Centrifugeer vervolgens de buisjes gedurende vijf minuten bij 1500 keer G en vier graden Celsius.

Voeg één milliliter compleet groeimedium toe aan de put en gebruik een microscoop met fluorescerend licht om de infectietekenen van cellen in de P1-baculovirusamplificatiefase te observeren. Breng de supernatant over in nieuwe 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes en bewaar deze bij vier graden Celsius in donkere omstandigheden. Zaai vervolgens twee milliliter log-fasegroei insect SF9-celcultuur gelijkmatig in de putjes van een celcultuurplaat.

Laat de cellen minimaal drie uur bij kamertemperatuur in de kap aanhechten. Inoculeer vijf microliter P1-virusstock in de gezaaide putten en voeg vervolgens 100 micromol Ganciclovir toe aan elke put. Versluit de putten en incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 27 graden Celsius.

Kweek eerst vijf milliliter log-fasegroei insect SF9-cellen met compleet groeimedium in T25 niet-behandelde flesjes. Voeg vervolgens 25 microliter P1-virusstockoplossing toe om de celcultuur gedurende 48 uur te infecteren, met zacht schudden, bij 27 graden Celsius. Bereid met acetonitril seriële verdunningen van 100 millimol permethrine.

Zaai vervolgens 200 microliter geïnfecteerde celcultuur aangevuld met 300 microliter compleet groeimedium in een 24-welplate. Zorg ervoor dat permethrine volledig is opgelost in de acetonitril en gelijkmatig in elk putje van de plaat is verdeeld. Na het toevoegen van de permethrine, schud de plaat voorzichtig om de permethrine volledig in het medium te mengen.

Versluit vervolgens de plaat met tape en incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 27 graden Celsius in donkere omstandigheden. Verwijder het celcultuurmedium uit de plaat zonder de onderaan gehechte cel laag te verstoren. Voeg 200 microliter van de MMT-reagens toe aan elke put.

Incubeer vervolgens de plaat gedurende vier uur bij 37 graden Celsius totdat donker paarse formazanprecipitaten in elke put worden gevormd. Voeg 500 microliter DMSO toe aan elke put om de precipitanten volledig op te lossen. Breng vervolgens 200 microliter van de opgeloste oplossing over in elke put van een 96-welplate.

Het volledig oplossen van het precipitaat in DMSO is cruciaal voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Nadat de DMSO in de monsters in de plaat is toegevoegd, worden de monsters meerdere keren met de pipette gewassen totdat het precipitaat volledig is opgelost. Gebruik ten slotte een microplaatlezer om de absorptiewaarden van de plaat bij 540 nanometer te meten.

In het P1-stadium is de infectieverhouding laag. In het P2-stadium was de infectieverhouding aanzienlijk verbeterd. In het P3-infectiestadium vertoonden bijna alle cellen symptomen van loslating van de celcultuurplaat, toename van celdiameter, evenals de stopzetting van celgroei.

Op basis van de gedetecteerde absorptiewaarden vertoonden de Md alpha E7-expresserende cellen significant hogere levensvatbaarheid vergeleken met de controle CAT-cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om celcontaminatie in alle stappen te voorkomen door het oppervlak van materialen, zoals flessen en buisjes, af te vegen met 70 procent ethanol voor het uitvoeren van de celexperimenten. Na dit proces kunnen andere methoden, zoals homologiemodellering en donkeranalyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de interacties tussen carboxylesterase-eiwit en permethrine-ligand.

Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van insectentoxicologie om de functionele karakterisering van genen en mechanismen in insecticideresistentie van insecten te verkennen. Vergeet niet dat werken met insecticiden erg gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen, zoals handschoenen en laboratoriumjassen, moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.