Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het centriole veld te beantwoorden, zoals het lokaliseren van eiwitten naar een specifieke regio van de centriole. Het belangrijkste voordeel van deze technieken dat we de middelen bieden om centriole te concentreren om ze in meerdere richtingen te krijgen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chlamydomonas centriole biologie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals geïsoleerde menselijke en paramecium centrioles.

Het demonstreren van de procedure zal promovendus Nikolai Klena, een andere promovendus Maeva Le Guennec, en de postdoc in het laboratorium Davide Gambarotto. Om deze procedure te beginnen, eerst alle media en cultuur de C.Reinhardtii cellen zoals beschreven in het tekstprotocol voor te bereiden. Breng de bereide cellen over op 50 milliliter conische buizen en vercentrifugeer ze gedurende 10 minuten op 600 keer g.

Was de pellet eenmaal met 50 milliliter 1x PBS en draai de cellen gedurende 10 minuten opnieuw op 600 keer g. Gebruik een pipet om de pellet opnieuw op te hangen in 100 milliliter kamertemperatuurdeflagellatiebuffer. Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en voeg langzaam 0,5 molair azijnzuur toe aan een laatste pH van 4,5 tot 4,7.

Laat dit mengsel twee minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Voeg daarna langzaam druppels van een normale kaliumhydroxide toe om de pH te herstellen naar 7,0, breng de cellen over op 50 milliliter buizen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 600 keer g om losse flagella te verwijderen. Gooi de supernatant weg en bewaar de pellet op ijs tot ze klaar zijn om te wassen.

Als je klaar bent, was je de pellet twee keer met 50 milliliter 1x PBS bij vier graden Celsius per wasbeurt. Draai de gewassen pellet op 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Resuspend de pellet in 30 milliliter van 1x PBS.

Laad vervolgens langzaam de suspensie op een kussen van 20 milliliter van 25%sucrose, zonder te mengen. Draai 15 minuten op 600 g en vier graden Celsius om de resterende flagella te verwijderen en de cellen in de sacharose te verspreiden. Met behulp van een aspirator, zorgvuldig aspirate de supernatant houden van alleen de onderste-meest 20 milliliter.

Was de resterende sacharose door het toevoegen van 20 milliliter koude 1x PBS. Centrifuge op 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 1x PBS op vier graden Celsius, ervoor te zorgen dat er geen klonten in de oplossing.

Breng de geresuspended pellet naar een nieuwe 250 milliliter fles, voeg de lyse buffer, aangevuld met 5.000 eenheden van DNase, aan de fles met de cellen. Incubeer op vier graden Celsius gedurende een uur, terwijl het mengen van elke 15 minuten door zorgvuldig omkeren van de fles. Breng de gelyseerde cellen over op een conische buis van 50 milliliter en centrifuge bij 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Met behulp van een pipet, verzamel de supernatant en laad het in een 30 milliliter ronde bodem buis op ijs met twee milliliter van 60% sacharose kussen. Centrifuge dit op 10.000 keer g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Daarna zuigt u de supernatant tot een milliliter boven het sacharosekussen.

Let op de gele interface tussen de een milliliter van de resterende supernatant, en de twee milliliter van sacharose kussen. Met behulp van een gesneden P1000 tip, voorzichtig mengen de resterende supernatant met de sacharose. Pool alle sacharose kussens en bewaar ze op ijs.

Bereid vervolgens een sucrosegradiënt van 40% tot 70% in een dunwandige 38,5 milliliter polypropyleenbuis zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad de gepoolde interfaces langzaam in het verloop. Balanceer de buizen met de 10 millimolar K-PIPES buffer, en centrifuge op 68, 320 keer g en vier graden Celsius gedurende 75 minuten.

Gebruik hierna een naald van 0,8 millimeter om een gat in de bodem van de buis te maken, zodat u de verschillende sacharoselagen niet verstoort. Gebruik dit gat om 12 500 microliterfracties te verzamelen bij vier graden Celsius. Met behulp van een gesneden P200-tip, bereid een extra 10 microliter aliquot van elke fractie te gebruiken tijdens immunofluorescentie.

Vervolgens, snap-freeze de fracties in vloeibare stikstof. Om te beginnen plaatst u een steriele 12 millimeter coverslip op de verzonken onderkant van de concentrator, zorg ervoor dat de PDL-gecoate kant naar beneden te houden. Plaats de adapter direct op de top, om de coverslip cap.

Vervolgens, omkeren van de ronde bodem buis en plaats het over de concentrator, coverslip, en adapter. Met behulp van een pincet, voorzichtig duw het ensemble totdat het de onderkant van de buis bereikt, en vervolgens omkeren van de buis. Voeg 10 millimolar K-PIPES buffer toe tot deze de bovenkant van de concentrator bereikt.

Zorg ervoor dat er geen bellen in de centrale cilinder van de concentrator zitten. Voeg voorzichtig 100 microliters van 10 millimolar K-PIPES buffer toe aan een van de aliquots van de verrijkte centriolar fractie en meng grondig met behulp van een P200 pipet. Verwijder vervolgens 100 microliter K-PIPES-buffer uit het holle midden van de concentrator en voeg 100 microliter van het bufferfractiemengsel toe, zodat de inhoud in het holle midden van de concentrator blijft.

Draai 10.000 keer g gedurende 10 minuten in een centrifuge die voorgekoeld is tot vier graden Celsius. Gebruik hierna een pincet om de concentrator te verwijderen. Steek een met de hand van de hand aan de hand van een handgemaakt apparaat in het gat dat aanwezig is in de sleufrand van de adapter en til voorzichtig op om de coverslip te herstellen.

Zodra het de bovenkant van de buis bereikt, gebruik een gehandschoende vinger om de rand van de adapter te vangen en pincet te gebruiken om de coverslip te verwijderen, waarbij rekening wordt gehouden met welke kant van de coverslip centrioles bevat. Voer vervolgens fixatie en immunofluorescentie kleuring van de geconcentreerde centrioles uit. Om te beginnen, incubeer de coverslips met de centrioles in de voorbereide kristal polystyreen transmissie lab doos gevuld met 100% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende 5 minuten.

Breng met behulp van een pincet de coverslips over naar een transparante laboratoriumdoos gevuld met 50 milliliter 1x PBS. Laat de glijbanen vijf minuten wassen in de PBS bij kamertemperatuur. Vervolgens, pipet 60 microliters van primaire antilichaam mix op een stuk van het laboratorium afdichting wrap in een bevochtigde kamer.

Leg de coverslips voorzichtig op de antilichaammix met de centrioles direct tegenover de druppel. Laat de covers 45 minuten uitbroeden. Verwijder hierna de afdeklipjes en was ze vijf minuten in een doos met PBS.

Incubeer de gewassen covers gedurende 45 minuten, met secundaire antilichamen in PBS 1%BSA en 0,05%Tween-20. Verwijder de deklips en was ze gedurende vijf minuten in een doos met PBS. Monteer met een regelmatig anti-fading montagemedium de coverslip op een glijbaan.

Beeld vervolgens de geïsoleerde centrioles op een confocale microscoop bij een 63X oliedoelstelling met een N.A.van 1.4, terwijl deconvolutie wordt toegepast. Stel respectievelijk de boven- en onderkant van de Z-stack boven en onder het centriolesignaal in en verwerf een grote stapel beelden die het totale centriolesignaal bevatten. Projecteer de stapel en voer een gemiddelde van één deeltje uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Representatieve immunofluorescentie blijkt dat zes fracties zijn verrijkt voor geïsoleerde centrioles, met een piek voor fractie drie, terwijl de laatste twee fracties dat niet zijn, wat aangeeft dat de zuivering succesvol is. Slechts ongeveer 30 centrioletjes worden gezien per gezichtsveld zonder de concentrator, terwijl 183 worden gezien met de concentrator. Dit toont aan dat de concentratorstap succesvol is en een verzesvoudiging van centrioles in een gedefinieerd gebied mogelijk maakt, waardoor het gemakkelijker wordt om ze te detecteren en te beelden.

Super-resolutie microscopie wordt vervolgens gebruikt om het beeld centrioles gekleurd voor gemonoxtamylated tubuline, en software wordt gebruikt om een bijna perfecte gemiddelde voor elke gekozen oriëntatie te genereren. Na vijf iteraties werden twee klassen van gemiddelden gegenereerd van gemonoxtamyleerde centrioles: een bovenaanzicht van 63 objecten en een zijaanzicht van 98 deeltjes. De lengte van het zijaanzichtklassegemiddelde is 260 nanometer met een diameter van 250 nanometer, vergelijkbaar met het gemeten gemonoxtyleerde tubulinesignaal dat wordt gezien om te lokaliseren in de kern van het centriole.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de geïsoleerde centriole op ijs te houden en snap-freeze ze na isolatie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cryo-elektronenmicroscopie en massaspectrometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inheemse architectuur van de centriole of de centriole eiwitsamenstelling.