Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1^{- / -} muizen

Tijdens de Zika-virusinfectie kunnen T-cellen immuunprivilegeerde organen infiltreren voor viruseliminatie, maar kunnen ze ook bijdragen aan immunopathogenese, zoals het Guillain-Barre syndroom of testeenletsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de tetramer-gebaseerde detectie van antigeen-specifieke T-cellen in immunoprivileged organen vergemakkelijkt, zowel tijdens zika virusinfectie en na vaccin immunisatie. In dit model wordt Zika-virusinfectie geïnitieerd in interferon alpha/beta receptor knock-out muizen, waardoor het volgen van Zika-virusspecifieke T-cellen in de hersenen, teelballen en milt mogelijk is.

Met behulp van een tetramer kleuring benadering, is het mogelijk om alleen kenmerken van immunoprivileged orgaan infiltreren Zika virus-specifieke T-cellen te onderzoeken om T-cel bijdragen aan immunoprotectie en immunopathogene cellen te verkennen. Voor Zika virus infectie, leveren een keer 10 aan de vier focus-vormende eenheden van Zika virus in 100 microliters van PBS via retro-orbitale inenting in zes-tot acht weken-oude interferon alpha / beta receptor knock-out muizen. Controleer vervolgens 15 dagen dagelijks het gewicht en de klinische symptomen van de besmette dieren.

Zeven dagen na inenting, zet het besmette dier in de supinepositie op een chirurgisch schuim en gebruik een steriele scalpel om een huidincisie langs de middellijn van de buik te maken. Gebruik een schaar om de buikspieren te openen, en voorzichtig extraheren van de lever. Verwijder vervolgens de milt en spoel het weefsel drie keer in PBS om het bloed te verwijderen.

Na de laatste wasbeurt, plaats de milt op 1,5 milliliter ijskoud RPMI medium op ijs totdat alle milten zijn verzameld. Om een eencellige suspensie te genereren, plaatst u de milt in een steriele, 40-micrometer meshcelzeef bovenop een buis van 50 milliliter en voegt u twee milliliter ijskoud RPMI-medium toe, aangevuld met 10%foetaal runderserum, of FBS, aan de zeef. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van vijf milliliter om het weefsel door het filter te macereren, met behulp van vers medium om de vrijgekomen cellen door het gaas te spoelen.

Breng de eencellige suspensie over naar een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie en zet de pellet opnieuw op in vijf milliliter rode bloedcellysebuffer. Na vijf tot zes minuten bij kamertemperatuur, stop de lysis met 10 milliliter ijskoude RPMI plus FBS voor een tweede centrifugatie, en resuspend de pellet in 10 milliliter van volledig medium voor het tellen. Zeven dagen na inenting, immobiliseren van een geëuthanaseerde, geïnfecteerde, mannelijke muis in de gevoelige positie op een snijplank, en zet de hoofdhuid met rechte een-door-twee-tanden tangen.

Gebruik irisschaar om een middellijn incisie op de hoofdhuid te maken, de schedel bloot te stellen en gebruik scherpe pincet om de twee zijden van de banen te klemmen met een scherp pincet, waardoor de hersenen worden vastgesteld. Het plaatsen van een puntje van scherpe iris schaar in de foramen magnum, lateraal gesneden in de schedel aan elke kant. Zorgvuldig gesneden uit dezelfde holte op de middellijn, in de richting van de neus, het houden van de schaar tips zo oppervlakkig mogelijk om te voorkomen dat verwonding van de hersenen.

Til de hersenen met tangen, en gebruik scherpe iris schaar om zorgvuldig ontleden de craniale zenuwvezels. Gebruik vervolgens de tangen om de hersenen over te brengen naar een buis van 15 milliliter met vijf milliliter ijskoude RPMI plus FBS. Om de teelballen te isoleren, til de buikhuid op met tangen en gebruik de irisschaar om een longitudinale incisie door het integument en de buikwand te maken en het onderste deel van de buik bloot te leggen.

Duw de teelballen tot aan de incisie en gebruik een pincet om de vetlaag voorzichtig te trekken, om een bolvormige testis aan beide zijden bloot te leggen. Gebruik de irisschaar om de vetlaag en epididymis zorgvuldig te ontleden en breng de teelballen over naar een buis van 15 milliliter met vijf milliliter ijskoude RPMI plus FBS. Om een eencellige suspensie te genereren van een van de geoogste weefsels, plaats het orgaan op een steriele celzeef met een 100-micron gaas bovenop een buis van 50 milliliter en voeg twee milliliter ijskoude RPMI plus FBS toe aan de zeef.

Met behulp van de zuiger van een vijf-milliliter spuit, pureer het weefsel, en was het filter met vers medium totdat het orgaan volledig is gemalen door het gaas. Breng de eencellige suspensie over naar een buis van 15 milliliter voor centrifugatie en zet de pellet opnieuw op in vijf milliliter van 30%-dichtheidsgradiëntmedium. Voorzichtig laag de cel oplossing over twee milliliter van 70% dichtheid gradiënt medium in een nieuwe 15-milliliter buis, en scheiden van de cellen door dichtheid gradiënt centrifugatie.

Breng vervolgens de cellen van de interfase tussen de twee dichtheidsgradiënten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter met 10 milliliter koude RPMI plus FBS voor nog een centrifugatie, en resuspend de pellet in 10 milliliter ijskoude RPMI/FBS voor het tellen. Om de cellen te analyseren door de stroom cytometrie, verdun de cellen tot een vijf keer 10 tot de zes cellen per 100 microliter in FACS buffer concentratie, en incubeer de celmonsters met 10 microliter van anti-muis CD16/CD32 blokkeren antilichaam per monster. Voeg na 10 minuten bij kamertemperatuur 20 microliter cellen toe aan het juiste aantal putten van een 96-put, ronde bodemplaat volgens het experimentele stroomcytometriekleuringsprotocol, en voeg 20 microliter van de E-eiwittetramet mix toe aan elke put voor een 30-minuten durende incubatie bij kamertemperatuur in het donker.

Voeg aan het einde van de incubatie de antilichamen van het celoppervlak van belang toe aan de cellen voor een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Vervolgens was de cellen twee keer met 200 microliters facs buffer per was, en zorgvuldig resuspend de cellen in elke put met 200 microliters van verse FACS buffer. Bewaar vervolgens de monsters op vier graden Celsius, beschermd tegen licht, tot hun analyse op een stroomcytometer.

Pathologische symptomen en tekenen zoals myeloparalyse en motorparese worden zeven dagen na de inenting met het Zika-virus waargenomen in interferon alpha/beta receptor 1 knock-outmuizen. Gewichtsveranderingen in de geïnfecteerde interferon alpha/beta receptor 1 knock-out dieren werden gecontroleerd gedurende 15 dagen, met gewichtsverlies voor het eerst waargenomen vier dagen na infectie en gewichtsverlies begin op dag zeven na infectie. Representatieve beelden van geïnfecteerde murine hersenen onthullen duidelijke oedeem en hyperemie zeven dagen na inenting met het Zika-virus.

Representatieve beelden van murine Zika geïnfecteerde teelballen tonen een geleidelijke krimp van dag zeven tot 30 dagen na infectie. Histopathologische analyse van met Zika geïnfecteerde hersen- en testiculaire weefselsecties illustreert ook het effect van de destructieve pathologische veranderingen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. Zoals verwacht van de macro- en histopathologische analyses worden ook hoge virale belastingen gedetecteerd in de hersenen en teelballen van met het Zika-virus geïnfecteerde muizen door immunostaining.

Dat gaat gepaard met een robuuste CD3-positieve T-cel infiltratie in de hersenen post-Zika infectie. Zika virus-specifieke CD3-positieve, CD8-positieve T lymfocyten worden gedetecteerd, zowel in Zika virus geïnfecteerde en vaccin-geïmmuniseerde muizen door E-eiwit tetramer vlekken. E-eiwit tetramer-specifieke CD8-positieve T-cellen kunnen ook worden gedetecteerd in de hersenen en testen zeven dagen na inenting met Zika virus.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in de studie van pathogene-specifieke T-celkarakterisering in immunoprevalente organen tijdens natuurlijke infecties in diermodellen. Deze methode kan ook worden toegepast op andere immuun-heersende organen, zoals placenta of oog, evenals op zowel virale infectie en kanker. Na deze procedure kunnen MHC-I tetrameren worden gebruikt voor de immunohistochemische of immunofluorescente detectie van pathogene specifieke T-cellen om toegang te krijgen tot de verdeling van hersen- of teelballen-infiltrerende T-cellen.