Name: Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer een efficiënte methode om immuuncellen uit het myocardium van muizen te isoleren en te identificeren met behulp van enzymatische digestie en flowcytometrie. Deze techniek maakt nauwkeurige immunofenotypering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (148808 en 148792), SE werd ondersteund door een hart en beroerte Foundation, personeel award van het Ontario provinciale Office, maart van dubbeltjes, Ted Rogers Centre voor onderzoek van het hart en de Peter Munk Hartcentrum. XCC houdt een CIHR Banting Fellowship. LA houdt een hart & beroerte/Richard Lewar studententijd Award.

Ethische verklaring: dit protocol is herzien en goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op het University Health Network (Toronto, Canada) en is in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care.
1. buffer voorbereiding
<ol><li>HBB buffer (Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 0,2% bovien serumalbumine) voor te bereiden. Voeg toe 10 mL van warmte geïnactiveerd runderserum en 1 g bovien serumalbumine aan 500 mL HBSS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereiden van FACS buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA, pH 8,0)). Voeg toe 10 mL warmte geïnactiveerd runderserum en 1 mL van de EDTA 0.5 M tot 500 mL PBS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: Oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
</ol>2. etikettering van circulerende leukocyten
<ol><li>Aseptisch bereiden anti-muis CD45 injectie met 1 microgram van antilichaam verdund in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een definitieve geïnjecteerde volume van 200 µL/muis. Volume in een 28.5G insuline spuit laden en blijf uit de buurt van licht. Opmerking: Gebruik twee verschillende fluorescerende-gelabelde anti-CD45 antilichamen om te onderscheiden van het intravasculaire (gekleurd door i.v. toediening) van de intracardiac kleuring (gekleurd na vertering; Zie stap 4).</li>
	<li>
Vooraf warm muizen (8-12 weken oud) door de staart aan een rode warmte lamp voor 5 min bloot te leggen. Let op: Niet oververhit raakt het dier. Houd van de lamp op een veilige afstand (> 30 cm).<ol>
<li>Beperken van het dier in de sternale positie met behulp van een geschikte inrichting. Bloot en stabiliseer de staart met de niet-dominante hand door immobilizing de basis van de staart met de index- en middelvinger en de medio-distale regio van de staart met de duim en de ringvinger. Let op: Geldt niet te veel kracht op het puntje van de staart, als de huid kan worden getrokken uit. Plaats de naald met de schuine kant naar boven in de ader. Houd de naald evenwijdig aan de ader te allen tijde als het is gemakkelijk om het doorprikken van de ader. Opmerking: Bloed invoeren van de injectiespuit kan optreden en is een teken van een goede injectie. Buigen de naald onder een hoek van 90° kan vergemakkelijken i.v. toediening. Bevestigen met uw veiligheid kantoor zoals buigende naalden kunnen een gevaar vormen.</li>
		<li>200 µL intraveneus injecteren in de ader van de staart. De vloeistof moet gemakkelijk stromen en schakelt u tijdelijk de ader. Let op: Forceer niet vloeistof in als weerstand wordt voldaan. Dit is een teken van omdat van de naald.</li>
		<li>Het toestaan van antilichaam circuleren gedurende 5 minuten voordat het humaan euthanizing muis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hart isoleren en spijsvertering
<ol><li>
Euthanaseren van muizen met behulp van CO2 of door andere institutioneel aanvaarde euthanasie procedure.
	<ol>
<li>Voor CO2 euthanasie, plaatst u de muisaanwijzer in de CO2 -kamer en het tarief van de opvulling ingesteld op 20% van het volume van de kamer per minuut (dat wil zeggen, als de kamer 10 L, opvulling op 2 L/min is). Een looptijd van 2 min en monitor muis totdat ademhaling heeft opgehouden.</li>
		<li>Uitschakeling van de CO-2 en laat de muis voor een extra 1-2 min. zorgen ademhaling heeft opgehouden alvorens de kamer te openen en uitvoeren van een teen snuifje om te bevestigen dat de muis is dood voordat wij overgaan tot het verwerken van de muis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spray de muis met 70% ethanol. Til de huid op de buik en ontleden de muis door te snijden langs het begin van de ventral midline op het niveau van de heupen tot het borstbeen. Open de buik en de lever om bloot van het middenrif te verplaatsen.</li>
	<li>
Snijd het middenrif en de ribben aan weerszijden van de middellijn, voorzichtig om te voorkomen dat het prikken van de longen en het hart.
	<ol>
<li>Expose het hart door peeling toen de ribben, snijd eerst de linker atria gevolgd door de juiste atria. Let op: Wees voorzichtig bij het snijden van de atria, ervoor te zorgen dat geen slagaders of aders zijn gewond, aangezien dit de efficiëntie van het spoelen van het bloed opgenomen in de organen kan verminderen.</li>
		<li>Perfuse het hart met 15-20 mL koude PBS met een 60 mL injectiespuit met een naald 21 G uitgerust en koude PBS. Zachtjes begrijpen van de basis van het hart met een tang en plaats de naald in het linkerventrikel in de buurt van de top. Herhaal de procedure in het rechterventrikel. Een correcte injectie resulteert in witte longen en bleke lever. Opmerking: Perfusie moet worden uitgevoerd binnen 5 minuten na euthanasie om te voorkomen dat bloed coagulatie, die de organen van belang met het circulerende cellen kan besmetten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Houd de basis van het hart met een tang en zachtjes het hart optrekken, dan loskoppelen van het hart door het snijden van de grote pulmonary slagaders en aders, aorta en de pericardvocht zak.
	<ol>
<li>Reinig het hart door het hart tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden in een schone stofvrije papieren handdoek en trek de atria en de overblijfselen van de grote slagaders en aders en eventuele andere verontreinigingen met een tang. Opmerking: Zorg ervoor het geheel van de atria wordt verwijderd en geen andere weefsels, zoals de longen of de bloedvaten, als deze weefsels hun eigen resident immune cellen hebben aanwezig zijn. De Long heeft met name een grote immuun cel bevolking die de kleinere bevolking van die binnen het myocardium maskeren kan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaats het hart in een 5 cm kunststof schotel met 50 µL van koude PBS.
	<ol>
<li>Blad voor het hart met gebogen ontleden schaar totdat er geen zichtbare deeltjes en het heeft een gladde consistentie. Opmerking: Probeer te houden het hart op een beperkt gebied van de schotel tijdens het hakken om te minimaliseren van verlies van weefsel.</li>
		<li>Overdracht thetrituratedheart weefsel met gebogen pincet in 2 mL microcentrifuge buis met 800 µL koude Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toevoegen van 450 U/mL ofcollagenase ik 60 U/mL hyaluronidase type I-S en 60 U/mL DNase-I bij elk monster.
	<ol>
<li>Incubeer monsters bij 37 ° C op een rockende shaker 50 rpm voor 45 – 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Na de vertering, kort vortex monsters (20 s) en onmiddellijk plaats op ijs te houden van de monsters bij 4 ° C.
	<ol>
<li>Met behulp van een pipet 1 mL, Pipetteer monsters op en neer totdat weefselsteekproeven homogeen zijn en niet het uiteinde van de pipet verstoppen doen. Opmerking: Vaststelling van een bepaald aantal keren naar Pipetteer reproduceerbaarheid kan verhogen. Als de harten zijn niet optimaal verteerd, kunnen stukken van myocard belemmeren de pipet. Voorzichtig slijpen de pipet tip tegen de microcentrifuge buis zal helpen Meng grotere stukken van weefsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Natte vooraf een 40 µm cel zeef geplaatst op een conische buis van 50 mL met 1 mL koude HBB.
	<ol>
<li>Gehomogeniseerde monster toevoegen aan de filter en wassen via door het langzaam stromende 12 – 14 mL koude HBB.</li>
		<li>Gefilterde monsters overbrengen in een conische buis van gelabelde 15 mL en houden bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.
	<ol>
<li>Lyse rode bloedcellen door toevoeging van 1 mL lysis-buffermengsel van Ammonium-Chloride-kalium (ACK) aan elk monster. Resuspendeer monsters door vortexing en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Zodra lysis heeft voltooid, voeg 5 – 8 mL van koude Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) om te stoppen met hemolyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven op 400 x Gvoor 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.</li>
	<li>Voeg 1 mL FACS buffer toe aan elk monster tot een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis. Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier voor maximaal 2 uur met monsters opgeslagen bij 4 ° C.</li>
</ol>4. Stroom Cytometry kleuring en analyse
<ol><li>
Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
	<ol>
<li>Verklein de niet-specifieke antilichaam-bindende en Verdun 1:100 anti-CD16/CD32 en monocyt Blocker (1:20) (Zie Tabel van materialen) boekhouding voor 50 µL FACS per monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
		<li>De administratieve verwerking van antilichaam, verdunning (1:250 voor elke antilichaam) van 50 µL van FACS per monster te bereiden. Opmerking: Een levensvatbaarheid kleurstof kan worden opgenomen in het antilichaam cocktail om uit te sluiten van de dode cellen. Als alternatief, kleine grootte uitsluiting door flow analyse kan worden gebruikt (Figuur 1C en D).</li>
		<li>Zonder wassen, voeg 50 µL van antilichaam master mix aan elk monster en meng.</li>
		<li>Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>600 µL FACS toevoegen aan elk monster te wassen en centrifugeren van de monsters bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd uit supernatant en resuspendeer de pellet in 300 µL FACS. Houd de monsters bij 4 ° C in het donker. Opmerking: Sommige levensvatbaarheid kleurstoffen, zoals DAPI, vereisen binnen 10 min voordat u stroom cytometry kleuring.</li>
	<li>Analyseren door stroom cytometry (Zie figuren 1 en 2) binnen de volgende 3 h. Als een langere tijd is vereist, op korte termijn fixatie met behulp van een lage concentratie paraformaldehyde (0,5 – 1% in PBS) wordt aanbevolen voor het behoud van de kleuring. Opmerking: Het is sterk aanbevolen om het filteren van monsters door een zeef cel 40 µm vóór starten stroom cytometry analyse ter voorkoming van obstructie van de fluidics van de cytometer van de stroom.</li>
</ol>

<ol><li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Immunopathology+Research%22%5BJournal%5D)">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814(2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25349429">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24675722 ">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
<li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD103%28%2B%29+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li>
<li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+migration+of+effector+CD8%2B+T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li>
<li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD103%2B+dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha%2B+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Myocardiale ontsteking of myocarditis, is een functie van meest cardiovasculaire ziekten. Het myocardium is echter niet gespeend van eigen immuunsysteem componenten in niet-ziekte staten. Tijdens steady-state, vele immune cellen bevinden zich in het myocardium en spelen de essentiële rol van onderhoud en bescherming. De karakterisering van deze verschillende populaties van cellen zou niet mogelijk zijn geweest zonder methoden zoals gepresenteerd in dit protocol.
Een combinatie van mechanische ...

Verschillende vormen van myocardiale stress of schade, met inbegrip van ischemische (ischemie-reperfusie of myocardinfarct) en niet-ischemische (hypertensie of myocarditis), bevordering van de rekrutering van ontstekingscellen met herstellend en beschermend, maar ook pathogene eigenschappen. Al in 1891, beschreven Romberg eerst de aanwezigheid van cellulaire infiltreert in het myocardium van patiënten geïnfecteerd met tyfus en roodvonk1. De gedetailleerde studie van immuun hartcellen vereist echter de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van de immunophenotyping. Dientengevolge, zijn pas onlangs we begonnen te begrijpen dat een diverse bevolking van immune cellen met essentiële onderhoud rollen tijdens steady-state zich binnen het myocardium bevindt.
Histologie is geweest, en nog steeds is, de meest voorkomende methode te karakteriseren immuun hartcellen tijdens ontsteking. Terwijl histologie een waardevolle diagnostisch hulpmiddel vertegenwoordigt, heeft het gebruik ervan in de studie van immuun hartcellen echter belangrijke beperkingen. De immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium vertegenwoordigen een zeer klein percentage van het totaal aantal cellen en zijn min of meer gelijkmatig verdeeld in een proportioneel immense ruimte. Ook Toon verschillende vormen van cardiale ontsteking, zoals virale myocarditis, focal patronen van ontsteking. Dit betekent dat de nauwkeurige analyse van het immuunsysteem van het hart vaak hogere graden van de histologische bemonstering, verhoging van de kosten te verminderen van bias vereisen. Histologie biedt bovendien een zeer beperkte hoeveelheid bruikbare informatie in cel identificatie (bijvoorbeeld aantal parameters). Met een steeds groeiend aantal cel subsets kunt weergeven die het gebruik van meerdere expressie markers vereisen (met inbegrip van oppervlakte markeringen, transcriptiefactoren of secreted moleculen), heeft stroom cytometry zich gevestigd als de meest krachtige tool voor immunophenotyping, Als gevolg van lage kosten en hoge gegevensdoorvoer.
Het gebruik van immunophenotyping technieken is sterk afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte spijsvertering protocollen dat is toegestaan voor single-cellen analyse van grote aantallen cellen. De ontwikkeling van uitputtende protocollen van de extractie van de cel opende een nieuw venster van mogelijkheden in de studie van cardiale immunologie. Door de combinatie van de spijsvertering en stroom cytometry transcriptomics zijn de grote bevolking van macrofagen en dendritische cellen die woonachtig zijn in het hart gekarakteriseerd2,3. De overvloedigste bevolking van immuun hartcellen tijdens steady-state zijn CD64++ MerTK macrofagen, die kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking voor CCR2 of CD11c2. CCR2+ macrofagen zijn afkomstig uit beenmerg volwassen Haematopoiese, overwegende dat de meerderheid van CCR2- -macrofagen, dat hoge of lage niveaus van MHC-II uitdrukken kunnen, zijn hoofdzakelijk van prenatale oorsprong. Macrofagen belangrijke taken uitvoeren zoals reparatie4 en verwijdering van puin5 tijdens blessure of ondersteunende elektrische connectiviteit6 in stabiele toestand. Tijdens verschillende vormen van ontstekingen een belangrijke toevloed van Ly6Chi MHC-IIlo CD64int monocyten optreden, die later differentiëren in Ly6CHallo CCR2+ macrofagen2,7 . Een aanzienlijk kleiner, maar belangrijke bevolking van cellen die woonachtig zijn in het myocardium van gezonde individuen is samengesteld uit dendritische cellen8,9. De twee belangrijke subsets van cardiale conventionele DCs (cDCs) hebben onlangs gekenmerkt: cDC1 (CD103+ DCs) en cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spelen een belangrijke rol in de verdediging tegen infectie8 maar kunnen ook bevorderen zelfverwonding tijdens ontsteking, met name tijdens een myocardinfarct9.
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van levensvatbare immuun hartcellen van muis myocard. De methode combineert enzymatische en mechanische spijsvertering met een cel-zeef filtratie met het oog op een interne celsuspensie dat kan worden geanalyseerd, of verder gezuiverd is, wat door de stroom cytometry sorteren of magnetische kraal verrijking. Nauwkeurige metingen van extravascular myocardcellen vereisen cardiale perfusie om het verwijderen van eventuele verontreinigingen uit de bloedbaan van de cardiale microvasculature. Daarnaast presenteren wij een optionele stap van intravasculaire labeling van immune cellen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden verder myocardcellen van intravasculaire contaminanten, gebaseerd op de Galkina et al. protocol10. Tot slot presenteren we een fundamentele stroom cytometry analyse ter identificatie van de grote macrophage en cDC subpopulaties.

<table><tbody><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) PrecisionGlide-naald</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s gebalanceerde zoutoplossing</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumfilter, 0,2 &micro;m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc insulinesyringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL-spuit</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM met 4,5 g/L glucose en L-Glutamine en Natrium Pyruvaat</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>van Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hyaluronidase type I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>van rundpancreas</td></tr><tr><td>Celzeef, 40 &micro;m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride- Kalium (ACK) lysebuffer</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-muis/mens CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-muis Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>APC anti-muis CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-muis CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>PE anti-muis Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-muis I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>FITC anti-muis CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-muis CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-muis CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 verdunning</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-muis CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 verdunning</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyt Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 verdunning</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Muis: Batf3-/-</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en identificatie van extravascular immuuncellen van het hart

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Het immuunsysteem is een essentieel onderdeel van een gezond hart. Het myocardium is herbergt een rijke bevolking van verschillende immuun cel subsets met functionele brandcompartimentering zowel tijdens steady-state en tijdens verschillende vormen van ontsteking. Tot voor kort, de studie van immuuncellen in het hart vereist het gebruik van microscopie of slecht ontwikkelde spijsvertering-protocollen, die geboden van voldoende gevoeligheid tijdens ernstige ontsteking maar konden vertrouwen identificeren kleine — maar belangrijke — populaties van cellen tijdens steady-state. Hier bespreken we een eenvoudige methode combineren enzymatische (collagenase, hyaluronidase en DNAse) en mechanische vertering van lymfkliertest harten voorafgegaan door intravasculaire administratie van fluorescently-gelabelde antilichamen tegen kleine onderscheiden maar onvermijdelijke intravasculaire cel contaminanten. Deze methode genereert een suspensie van geïsoleerde levensvatbare cellen die kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry voor identificatie, fenotypering en kwantificering, of verder gezuiverd met fluorescentie-geactiveerde cel sorteren of magnetische kraal scheiding voor transcriptionele analyse of in vitro studies. Wij zijn een voorbeeld van een stapsgewijze flow cytometrische analyse om te onderscheiden van de belangrijkste macrophage en dendritische cel populaties van het hart. Voor een middelgrote formaat experiment (10 harten) vereist de voltooiing van de procedure 2 – 3 h.

Tot op heden is geen goede methode ontwikkeld om te isoleren van immune cellen van andere cardiale celbestanddelen, zoals cardiomyocytes. Analyse van de cardiale eencellige schorsing door stroom cytometry heeft dus een vooraf gating met CD45 om te identificeren van de immuun cel populaties, gevolgd door eencellige en klein uitsluiting gating (Figuur 1A). Anderzijds kan een levensvatbaarheid kleuring worden uitgevoerd als u wilt uitsluiten van...

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling van immuuncelsubpopulaties in het hart, zowel in normale als in ziektetoestanden. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt voor nauwkeurige immunofenotypering van cardiale immuuncelpopulaties, inclusief zeer zeldzame subpopulaties. Dit protocol is relatief eenvoudig.Echter, injecties in de staartader kunnen moeilijk zijn, dus het is belangrijk om deze techniek te oefenen totdat u zich comfortabel voelt voordat u experimentele dieren gebruikt. Om de circulerende leukocyten te labelen, laadt u 200 microliter vers bereide muis fluorofoor-geconjugeerde anti-CD45 antilichaam in PBS in een insulinesyringe van 28,5 gauge en verwarmt u acht 12 weken oude muizen voor op een waterdeken ingesteld op 35 tot 41 graden Celsius gedurende vijf tot tien minuten. Wanneer de staartader is verwijd, houdt u het eerste dier in de sternale positie in een geschikte bevestigingsvoorziening.Als de staartaderen niet voldoende verwijd zijn, dompelt u de staart gedurende één tot twee minuten in water van 36 tot 40 graden Celsius. Wanneer de staartaderen klaar zijn, veegt u het injectiegebied af met 70% ethanol-geweekt gaas en immobiliseert u de basis van de staart met de wijs- en middelvinger en het midden-distale gebied van de staart met de duim en ringvinger. Houd de naald met de snede omhoog en parallel aan de ader, steek de naald in een verwijde staartader en injecteer intraveneus het gehele volume antilichaam.Laat vervolgens het antilichaam vijf minuten circuleren voordat u het dier humanitair euthanasieert. Om het hart te verzamelen, spuit u de muis met 70% ethanol en til het de huid van de buik op om de buik langs de ventrale middenlijn van de heupen tot het borstbeen te openen. Open het peritoneum en verplaats de lever om het middenvlies bloot te leggen.Snijd het middenvlies en de ribben aan beide zijden van de middenlijn, zorg ervoor dat u de longen en het hart niet puncteert. Verwijder de ribben om het hart bloot te leggen voordat u de linker en rechter atria snijdt. Pak voorzichtig de basis van het hart vast met een pincet, steek een 21-gauge naald die aan een 60-milliliter spuit is bevestigd in de linker ventrikel nabij de apex en perfuseer het hart met 15 tot 20 milliliter koud PBS.Goede perfusie van het hart is essentieel om intravasculaire contaminanten te vermijden. Daarom zorg ervoor dat u het hart snel na euthanasie ontleedt en perfuseert om besmetting door gecoaguleerd bloed te voorkomen. Na de perfusie van de rechter ventrikel zoals net gedemonstreerd, moeten witte longen en een bleke lever worden waargenomen.Houd de basis van het hart vast met het pincet, trek het hart voorzichtig omhoog en snijd de grote longslagader en -aders, aorta en pericardiale zak door om het hartweefsel los te maken. Houd het hart voorzichtig tussen de duim en wijsvinger en maak het hart schoon met een schone pluisvrij papieren handdoek en gebruik het pincet om de atria en eventuele restanten van grote slagaders en aders of andere contaminanten te verwijderen. Plaats het schoongemaakte hart in een plastic schaal van vijf centimeter en voeg 50 microliter koud PBS toe.Gebruik gebogen dissectiescharen om het hart te hakken totdat er geen zichtbare stukken meer zijn en het weefsel een gladde, dikke consistentie heeft. Gebruik gebogen pincetten om het weefsel over te brengen naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter die 800 microliter koud DMEM bevatten. Supplementeer met collageenase, DNase en hyaluronidase en incubeer gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius en 50 rpm.Aan het einde van de vertering, wervel de monsters gedurende 20 seconden en plaats ze onmiddellijk op ijs. Het monster moet altijd op vier graden Celsius worden bewaard, tenzij anders gespecificeerd, omdat sommige oppervlakteantigenen kunnen worden geïnternaliseerd als ze op kamertemperatuur worden gelaten. Bevochtig vervolgens een 140-microliter celzevener in een kegelbuis van 50 milliliter per monster met één milliliter koud HBB.Gebruik een pipet van één milliliter om de monsters te pipetten totdat de weefselsuspensies homogeen zijn en de pipettip niet verstopt is en voeg de gehomogeniseerde monsters toe aan de filters. Was de monsters langzaam door de filters met 12 tot 14 milliliter koud HBB per monster en breng de gefilterde monsters over in een gelabelde kegelbuis van 15 milliliter op ijs. Een goede vertering wordt aangetoond door de afwezigheid van hartresten in de filter.Verzamel de monsters door centrifugatie en verwijder het supernatant. Voeg één milliliter ammoniumchloride-kalium lysebuffer toe aan elk monster. Resuspendeer de monsters met kort wervelen, gevolgd door een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur.Stop vervolgens de hemolyse met vijf tot acht milliliter koud HBSS. Verzamel de monsters door centrifugatie en resuspendeer de pellets in één milliliter fluoresceine-geactiveerd celsorteer- of FACS-buffer en breng ze over in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor een andere centrifugatie. Om de monsters te analyseren door middel van flowcytometrie, resuspendeer de pellets in 50 microliter anti-CD16/CD32 antilichaam en een monocytblokker om de niet-specifieke antilichaambinding te verminderen gedurende een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur.Zonder wassen, voeg 50 microliter antilichaam mastermix toe aan elk monster met mengen voor een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met 600 microliter FACS-buffer per buis en resuspendeer de pellets in 300 microliter verse FACS-buffer of 1% paraformaldehyde. Analyseer vervolgens de cardiale leukocyten door flowcytometrie volgens standaard flow-analyseprotocollen.Analyse van de cardiale enkele celsuspensie door flowcytometrie vereist pre-gating met CD45 om immuuncellen te onderscheiden van niet-immuuncellen van het hart, gevolgd door enkele cel- en kleine grootte-uitsluitingsgating. Macrofagen, geïdentificeerd door hun CD64-expressie, zijn de belangrijkste immuuncelpopulatie van het hart, die 60 tot 70% van alle immu

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.

In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

In dit artikel wordt een methode om te isoleren van de cardiale mesenchymale stromale cellen uit de bioptic monsters endomyocardial van arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten verstrekt. Hun karakterisering en het protocol bij het stimuleren van hun adipogenic differentiatie worden beschreven.

Isolatie en karakterisatie van cardiale mesenchymale stromale cellen uit de Bioptic monsters Endomyocardial van Arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten

Hier gepresenteerd is een protocol om verschillende subgroepen van macrofagen en andere niet-immuuncellen van mens en muis myocardium te isoleren door het voorbereiden van een enkelvoudige celsuspensie door enzymatische spijsvertering. Gating schema's voor flow cytometrie gebaseerde identificatie en karakterisering van geïsoleerde macrofagen worden ook gepresenteerd.

Isolatie van macrofaag subsets en stromale cellen van myocardiale monsters van mens en muis

Het doel van dit werk is het ontwikkelen van een methode om cardiomyocyten reproduceerbaar te isoleren van het volwassen hart en het DNA-gehalte en nucleatie te meten.

Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

We presenteren een protocol voor de isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen uit rattenharten door sequentiële weefselvertering in een spijsverteringsbuffer, celverzameling uit terugkerende centrifugecycli en celzuivering met behulp van antiratten-CD31 microbeads.

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Het hier gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze aanpak voor de isolatie van cardiale residente macrofagen uit het sinoatriale knooppunt (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) gebied van muizenharten.

Isolatie en kweek van residente cardiale macrofagen van de Murine Sinoatriale en Atrioventriculaire Knoop

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

Dit protocol demonstreert microscopiegeleide isolatie en immunofluorescentiekleuring van longaders van muizen. We bereiden weefselmonsters voor die het linker atrium, de longaders en de bijbehorende longen bevatten en kleuren ze voor cardiale troponine T en Connexin 43.

Microdissectie en immunofluorescentiekleuring van myocardiale hulzen in longaders van muizen

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Leer een efficiënte methode om immuuncellen uit het myocardium van muizen te isoleren en te identificeren met behulp van enzymatische digestie en flowcytometrie. Deze techniek maakt nauwkeurige immunofenotypering mogelijk.

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Meer video's verkennen