Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart
23 augustus 2018
Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling van immuuncelsubpopulaties in het hart, zowel in normale als in ziektetoestanden. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt voor nauwkeurige immunofenotypering van cardiale immuuncelpopulaties, inclusief zeer zeldzame subpopulaties. Dit protocol is relatief eenvoudig.
Echter, injecties in de staartader kunnen moeilijk zijn, dus het is belangrijk om deze techniek te oefenen totdat u zich comfortabel voelt voordat u experimentele dieren gebruikt. Om de circulerende leukocyten te labelen, laadt u 200 microliter vers bereide muis fluorofoor-geconjugeerde anti-CD45 antilichaam in PBS in een insulinesyringe van 28,5 gauge en verwarmt u acht 12 weken oude muizen voor op een waterdeken ingesteld op 35 tot 41 graden Celsius gedurende vijf tot tien minuten. Wanneer de staartader is verwijd, houdt u het eerste dier in de sternale positie in een geschikte bevestigingsvoorziening.
Als de staartaderen niet voldoende verwijd zijn, dompelt u de staart gedurende één tot twee minuten in water van 36 tot 40 graden Celsius. Wanneer de staartaderen klaar zijn, veegt u het injectiegebied af met 70% ethanol-geweekt gaas en immobiliseert u de basis van de staart met de wijs- en middelvinger en het midden-distale gebied van de staart met de duim en ringvinger. Houd de naald met de snede omhoog en parallel aan de ader, steek de naald in een verwijde staartader en injecteer intraveneus het gehele volume antilichaam.
Laat vervolgens het antilichaam vijf minuten circuleren voordat u het dier humanitair euthanasieert. Om het hart te verzamelen, spuit u de muis met 70% ethanol en til het de huid van de buik op om de buik langs de ventrale middenlijn van de heupen tot het borstbeen te openen. Open het peritoneum en verplaats de lever om het middenvlies bloot te leggen.
Snijd het middenvlies en de ribben aan beide zijden van de middenlijn, zorg ervoor dat u de longen en het hart niet puncteert. Verwijder de ribben om het hart bloot te leggen voordat u de linker en rechter atria snijdt. Pak voorzichtig de basis van het hart vast met een pincet, steek een 21-gauge naald die aan een 60-milliliter spuit is bevestigd in de linker ventrikel nabij de apex en perfuseer het hart met 15 tot 20 milliliter koud PBS.
Goede perfusie van het hart is essentieel om intravasculaire contaminanten te vermijden. Daarom zorg ervoor dat u het hart snel na euthanasie ontleedt en perfuseert om besmetting door gecoaguleerd bloed te voorkomen. Na de perfusie van de rechter ventrikel zoals net gedemonstreerd, moeten witte longen en een bleke lever worden waargenomen.
Houd de basis van het hart vast met het pincet, trek het hart voorzichtig omhoog en snijd de grote longslagader en -aders, aorta en pericardiale zak door om het hartweefsel los te maken. Houd het hart voorzichtig tussen de duim en wijsvinger en maak het hart schoon met een schone pluisvrij papieren handdoek en gebruik het pincet om de atria en eventuele restanten van grote slagaders en aders of andere contaminanten te verwijderen. Plaats het schoongemaakte hart in een plastic schaal van vijf centimeter en voeg 50 microliter koud PBS toe.
Gebruik gebogen dissectiescharen om het hart te hakken totdat er geen zichtbare stukken meer zijn en het weefsel een gladde, dikke consistentie heeft. Gebruik gebogen pincetten om het weefsel over te brengen naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter die 800 microliter koud DMEM bevatten. Supplementeer met collageenase, DNase en hyaluronidase en incubeer gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius en 50 rpm.
Aan het einde van de vertering, wervel de monsters gedurende 20 seconden en plaats ze onmiddellijk op ijs. Het monster moet altijd op vier graden Celsius worden bewaard, tenzij anders gespecificeerd, omdat sommige oppervlakteantigenen kunnen worden geïnternaliseerd als ze op kamertemperatuur worden gelaten. Bevochtig vervolgens een 140-microliter celzevener in een kegelbuis van 50 milliliter per monster met één milliliter koud HBB.
Gebruik een pipet van één milliliter om de monsters te pipetten totdat de weefselsuspensies homogeen zijn en de pipettip niet verstopt is en voeg de gehomogeniseerde monsters toe aan de filters. Was de monsters langzaam door de filters met 12 tot 14 milliliter koud HBB per monster en breng de gefilterde monsters over in een gelabelde kegelbuis van 15 milliliter op ijs. Een goede vertering wordt aangetoond door de afwezigheid van hartresten in de filter.
Verzamel de monsters door centrifugatie en verwijder het supernatant. Voeg één milliliter ammoniumchloride-kalium lysebuffer toe aan elk monster. Resuspendeer de monsters met kort wervelen, gevolgd door een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur.
Stop vervolgens de hemolyse met vijf tot acht milliliter koud HBSS. Verzamel de monsters door centrifugatie en resuspendeer de pellets in één milliliter fluoresceine-geactiveerd celsorteer- of FACS-buffer en breng ze over in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor een andere centrifugatie. Om de monsters te analyseren door middel van flowcytometrie, resuspendeer de pellets in 50 microliter anti-CD16/CD32 antilichaam en een monocytblokker om de niet-specifieke antilichaambinding te verminderen gedurende een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur.
Zonder wassen, voeg 50 microliter antilichaam mastermix toe aan elk monster met mengen voor een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met 600 microliter FACS-buffer per buis en resuspendeer de pellets in 300 microliter verse FACS-buffer of 1% paraformaldehyde. Analyseer vervolgens de cardiale leukocyten door flowcytometrie volgens standaard flow-analyseprotocollen.
Analyse van de cardiale enkele celsuspensie door flowcytometrie vereist pre-gating met CD45 om immuuncellen te onderscheiden van niet-immuuncellen van het hart, gevolgd door enkele cel- en kleine grootte-uitsluitingsgating. Macrofagen, geïdentificeerd door hun CD64-expressie, zijn de belangrijkste immuuncelpopulatie van het hart, die 60 tot 70% van alle immu
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een eenvoudige en efficiënte methode om immuuncellen te isoleren, identificeren en kwantificeren die zich in het myocard van muizen bevinden tijdens rusttoestand of ontsteking. De methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling van immuuncelsubsets in het hart, zowel tijdens rust als ziektetoestand.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Cardiologie
- Flow Cytometrie
Achtergrond
- Het hart bevat verschillende populaties immuuncellen.
- Het begrijpen van deze populaties is cruciaal voor de hartgezondheid.
- Accurate immunofenotypering is noodzakelijk voor het bestuderen van zeldzame immuunsubsets.
- Injecties in de staarsafvoer zijn een veelgebruikte methode voor het labelen van circulerende leukocyten.
Doel van het onderzoek
- Om immuuncellen in het myocard te isoleren en kwantificeren.
- Om immuuncelsubsets te analyseren tijdens verschillende fysiologische toestanden.
- Om technieken te verbeteren voor het bestuderen van immuunreacties in het hart.
Gebruikte methoden
- Enzymatische en mechanische vertering om een enkele celsuspensie te maken.
- Flow cytometry voor het analyseren van immuuncelpopulaties.
- Injecties in de staarsafvoer van fluorofoor-geconjugeerd anti-CD45 antilichaam.
- Muizen voorverwarmen om de toegang tot de staarsafvoer te vergemakkelijken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van immuuncellen uit het myocard van muizen.
- Identificatie van verschillende immuuncelsubsets.
- Demonstratie van de effectiviteit van de techniek in zowel rust als ontstekingstoestanden.
- Benadrukking van het belang van oefening voor succesvolle injecties in de staarsafvoer.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van immuuncellen in het hart.
- Het verbetert het begrip van immuunreacties in het hart.
- De techniek is toegankelijk voor onderzoekers met de juiste training.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate profiling of cardiac immune cell subsets enables mechanistic de-risking in cardiovascular target validation by clarifying inflammatory pathways and immune-mediated mechanisms of action. This method supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible immunophenotyping data that informs go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical gap in studying rare but functionally significant immune populations during steady-state conditions, enhancing translational relevance for immuno-cardiology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell composition and functional compartmentalization in the myocardium.
- Operational Value: Provides a reliable method to distinguish true tissue-resident immune signals from intravascular contamination, improving data integrity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through precise identification of macrophage and dendritic cell subsets implicated in cardiac inflammation and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized single-cell suspension suitable for high-dimensional flow cytometry panels, enabling consistent immunophenotyping across experiments.
- Operational Value: Combines enzymatic and mechanical digestion with vascular labeling to achieve high viability and purity, reducing assay variability.
- Strategic Value: Establishes a reproducible workflow for immune cell isolation that can be adapted across disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal immune monitoring from steady state to inflammatory conditions, supporting biomarker discovery and mechanistic insight.
- Operational Value: Outputs are compatible with downstream applications such as FACS sorting, magnetic bead separation, and single-cell RNA sequencing for functional validation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement and immune modulation in relevant preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing immune profiling data that informs mechanism of action and safety assessment in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of key immune subsets like CD64+ macrophages and CD11c+ MHC-IIhi dendritic cells in the heart.
- Screening: Delivers quantitative, flow-cytometry-ready single-cell suspensions that allow comparison of immune composition across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates multi-parametric immune phenotypes (e.g., CD103+ vs CD11b+ dendritic cell ratios) that help de-risk targets by revealing subset-specific responses.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics to disease progression, supporting biomarker alignment in models of cardiac inflammation and remodeling.
- Enterprise Reuse: The core isolation and labeling strategy is adaptable to other organs and disease areas, promoting cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling confident identification of rare immune subsets that drive cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation through defined enzymatic digestion, vascular labeling, and flow cytometry gating strategies.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by providing immune-mediated mechanism data that informs combination therapy and patient stratification strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making through reproducible quantification of immune cell changes in preclinical efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, tail vein injection techniques, and aseptic tissue dissection to ensure sample quality.
- Dependent on access to flow cytometry equipment, fluorescence-conjugated antibodies, and enzymatic reagents (collagenase, hyaluronidase, DNAse).
- Necessitates standardization of perfusion, digestion, and lysis timing across operators to minimize variability in immune cell yield and viability.
- Requires optimization of enzyme concentration and incubation time based on heart size, age, and disease state to preserve epitope integrity.
- Limited by the need for immediate processing post-excision to prevent surface antigen internalization and maintain staining fidelity.
