Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de organisatie van astrocytische netwerken in hersenstructuren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een onbevooroordeelde methode voorstelt om labelcellen te tellen en hun anatomische organisatie binnen een gedefinieerde structuur te documenteren. Open ImageJFIJI, selecteer het gewenste bestand en klik op OK in het venster importopties van de bio-indeling.

Als u een Z-stack wilt herdefiniëren die alleen de optische segmenten bevat die nodig zijn voor de uiteindelijke Z-stack, selecteert u eerst STK- en Z-project en klikt u vervolgens op de stapelknop op de gereedschapsbalk. Selecteer maximale intensiteit in de instelling van het projectietype. Sla het bestand op en geef het stapelbestand een naam.

Als het beeldvormingsbestand meerdere kanalen bevat, gebruikt u afbeeldingskleur en gesplitste kanalen om alleen het kanaal weer te geven met de afbeelding van het astrocytische netwerk. Controleer de pixelinstellingen van de afbeelding door afbeelding, eigenschappen, pixel, met een afbeelding voor pixeldimensie te selecteren. Gebruik vervolgens het achtergrondgereedschap aftrekken door het proces te openen en de achtergrond af te trekken om biocytinelabeling op de achtergrond te verwijderen.

Gebruik de voorbeeldfunctie om de straal van de rollende bal in te stellen, die over het algemeen is ingesteld op 50 pixels. Als verdere ruisonderdrukking nodig is na de aftrekkende achtergrondstap, selecteert u proces, ruis en verwijdert u uitschieters. Selecteer helder in de instelling welke uitschieters en gebruik de voorbeeldfunctie om de straal en drempelwaarde in te stellen.

Wees voorzichtig met het gereedschap Uitschieter verwijderen, omdat deze de gegevens kan vervagen, zoals hier wordt weergegeven. Pas de drempelwaarde aan met afbeelding, aanpassing, drempelwaarde. Selecteer de standaard- en B- en W-modus.

Klik op solliciteren. Converteer de afbeelding in een binaire afbeelding met het binaire procesgereedschap door proces, binair en binair te selecteren. Sla het bestand op als een tiff-bestand en geef het binaire bestand een naam.

Als u cellen wilt tellen, stelt u eerst het meettype in door op analyseren te klikken en metingen in te stellen. Selecteer vervolgens de centroid-optie. Zorg ervoor dat het binaire bestand op het scherm wordt geopend.

Open nogmaals het analysemenu en selecteer deze keer analyseren van deeltjes. Selecteer vervolgens toon en overzichten. Hiermee wordt een nieuw bestand gegenereerd dat het resultaat van de detectie weergeeft.

Optimaliseer de parameters om de detectie te verfijnen. Als u alleen cellen wilt detecteren, gebruikt u een groottewaarde tussen 30 en 6000 en circulariteit tussen nul tot één, waarbij men een perfecte cirkel en nul een willekeurige vorm definieert. Voer de detectie uit door op OK te klikken. Er worden twee tabellen weergegeven, een tabel met de titel samenvatting met de titel samenvatting met de titel van het aantal gedetecteerde cellen en een tabel met de titel resultaten die de X- en Y-coördinaten van elke cel biedt.

Kopieer de waarden en plak ze in een spreadsheettoepassing. Sla deze tabel op onder de tabel met naamdetectie. Er verschijnt ook een bestand met een plot gedetecteerde cellen.

Sla dit bestand op als een tiff-bestand onder het bestand voor naamdetectie. Als een groep van twee of meer gelabelde cellen wordt gedetecteerd als één cel met het gereedschap Deeltjes analyseren, gebruikt u het waterscheidingsgereedschap op de binaire afbeelding door proces-, binaire en waterscheidings- en waterscheiding te selecteren voordat u het gereedschap Analysedeeltjes toepast. Als u het oppervlak van de netwerken wilt meten, gebruikt u het detectiebestand in ImageJ.

Klik links op de muis om het gereedschap veelhoekselectie op de werkbalk te selecteren. Klik nogmaals om te beginnen met het traceren van een interessegebied of ROI die alle cellen in de externe periferie van het netwerk verbindt. Klik met de rechtermuisknop om de veelhoek te sluiten.

Open het ingestelde meetvenster en selecteer de optie gebied. Open vervolgens de ROI-manager en voeg de getraceerde veelhoek toe in de ROI-manager door op toevoegen te klikken. Voer de meting uit door op meting te klikken in de ROI-manager.

De gebiedsmeting wordt in een tabel weergegeven en wordt uitgedrukt in pixels. Vergeet niet om deze waarde om te zetten met een conversiefactor voor de microscoop die wordt gebruikt om de waarde in vierkante micrometers te verkrijgen. Open het stackbestand in ImageJFIJI en identificeer de gepatchte cel met zijn sterkere labelintensiteit.

Open vervolgens de detectietabel met de naam van het bestand in een spreadsheettoepassing en zoek het getal dat is gekoppeld aan de gepatchte cel en de bijbehorende coördinaten. Als u de gepatchte cel niet nauwkeurig bepalen, gebruikt u het veelhoekgereedschap om het gebied te omringen waar de afzetting van biocytine dichter is, en verwijzen naar deze positie als die van de gepatchte cel. Gebruik de ROI-manager als voorheen om een ROI te trekken op de gepatchte cellocatie en deze toe te voegen aan de ROI-manager.

Stel vervolgens de meting in en selecteer de centroidoptie. Klik in de RIO-manager op maat om de coördinaten van de centroid van het getraceerde gebied te verkrijgen. Gebruik deze coördinaten als referentiepunt voor dit specifieke netwerk.

Gebruik deze formule om de coördinaten van elke cel te berekenen met verwijzing naar de gepatchte astrocyt. Het uitdrukken van de coördinaten van elke cel in verwijzing naar de gepatchte astrocyte is een belangrijke stap om vector te berekenen van de gepatchte astrocyten. Gebruik deze formule om de coördinaten van de belangrijkste vector van preferentiële oriëntatie te berekenen.

De belangrijkste vector van de preferentiële oriëntatie van het netwerk is de som van alle eerder berekende vectoren voor elke cel die in het netwerk bestaat. Verdeel de lengte van de hoofdvector door het aantal cellen in het netwerk, minus één om de gepatchte cel uit te sluiten, om de waarden te normaliseren en vergelijkingen tussen netwerken mogelijk te maken. Als u de positie van elk netwerk in de kern van belang wilt bepalen, opent u eerst de vier x-afbeelding met een vectorafbeeldingseditor.

Vermenigvuldig de afmetingen in het dimensievenster met vijf om de grootte van de afbeelding van vier x te vergroten. Hier werd de afbeelding bemonsterd bij 800 bij 800 pixels, en dus wordt de samplingresolutie gewijzigd in 4000 bij 4000 pixels. Exporteer het bestand in tiff-indeling en geef het de grootte van vier x.

Lijn de linkerbovenhoek van de vier x-afbeelding uit met de linkerbenedenhoek van het Adobe Illustrator-document. De software biedt coördinaten van een linkerbenedenhoek referentiepunt. Open de afbeelding van 20 x van het netwerk.

Gebruik het binaire bestand of detectiebestand omdat ze gemakkelijker kunnen worden uitgelijnd. Speel vervolgens met het hulpprogramma dekking op het binaire bestand van de 20 x-afbeelding om deze uit te lijnen met de grootte van vier x afbeelding. Wanneer de uitlijning is uitgevoerd, selecteert u het pipetgereedschap selecteren en vasthouden zodat het gereedschap meten wordt weergegeven en selecteert u deze op de linkerwerkbalk.

Gebruik het meetgereedschap om op de linkerbovenhoek van de 20 x-afbeelding te klikken om de coördinaten van het referentiepunt van 20 x op de grootte van vier x afbeelding te krijgen. Deze 20 x referentiële coördinaten zijn handig voor het uitdrukken van de positie van elk netwerk op een schematische tekening van de kern. Om de gegevens samen te vatten, wordt de normalisatie van de kern als rechthoek gebruikt.

Gebruik hiervoor het gereedschap veelhoek om de kern te omringen in de grootte van vier x afbeelding. Open vervolgens de ROI-manager en voeg de getrokken ROI toe. Gebruik afbeelding met transparante lichten als de randen van de kern niet kunnen worden gezien, in welk geval niet vergeten om het formaat van het eerst.

Selecteer in de ingestelde meting de optie omsluitende rechthoeken te berekenen om de kleinste rechthoek binnen de getekende kern te berekenen. Klik tot slot op meten en volg vervolgens de stappen in het geschreven protocol om de gelabelde celcoördinaten uit te drukken in een genormaliseerde kern die wordt vertegenwoordigd door de omsluitende rechthoek. Een enkele astrocyt in het dorsale deel van de trigeminus belangrijkste sensorische kern, gelabeld door SR101, was gericht voor hele cel opname en gevuld met 0,2%biocytine.

Elektrische stimulatie van het vijfde kanaal verhoogde biocytine etikettering in het dorsale deel van de trigeminus belangrijkste sensorische kern, wat neerkomt op een toename van het aantal gekoppelde cellen. Astrocytische netwerken blijven beperkt in het dorsale deel van de trigeminus belangrijkste zintuiglijke kern en hun belangrijkste oriëntatie. Deze techniek is ontwikkeld om astrocytische netwerken te positioneren binnen een gedefinieerde structuur, maar kan worden gebruikt om de positie van de populatie van gelabelde cel in elke structuur uit te drukken.