Name: Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Leer decellularisatie van menselijke harten met een geperst hydrofoor tasje in omgekeerde richting. Deze methode minimaliseert matrixverstoring en maakt real-time monitoring van stromingsdynamica mogelijk voor weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de Houston Endowment grant en de Texas Emerging Technology Fund. De auteurs erkennen de overheidsopdrachten orgel LifeGift, Inc. en van de donor gezinnen om dit onderzoek mogelijk te maken.

Alle experimenten vasthouden aan de richtsnoeren van de Commissie ethiek van de Texas Heart Institute.
1. orgel voorbereiding
Opmerking: In samenwerking met LifeGift, een non-profitorganisatie orgel procurement organisatie in Texas (http://www.lifegift.org), schonk menselijke harten niet geschikt is voor transplantatie werden gebruikt voor onderzoek met goedgekeurde toestemming.
<ol><li>Om het hart aanschaffen, intraveneus infuus 30.000 U heparine aan het hart. Veilig hechtdraad cardioplegia canule in de aorta en hechten een geklemd perfusie-lijn. Perforate de inferior vena cava (IVC) om te ventileren van het rechterdeel van het hart. Snijd de linker superieure longader of de linker atriale aanhangsel om te ventileren van de linker kamers van het hart.</li>
	<li>Infundeer 1 L cardioplegia of EDTA zoutoplossing. Ontleden aortaboog takken, superieure vena cava (SVC) en andere pulmonary aders om het hart van elke bijlage vasculaire of omliggende weefsel vrij te geven. Het goed heparinized hart in iced zoutoplossing dompelen.</li>
	<li>Inspecteren van het gedoneerde menselijke hart (anteriorly zowel posteriorly, Figuur 1). Het hart op een ontleden lade plaatsen en te inspecteren op structurele schade of anatomische misvormingen. Als de lever-en/of longen werden aangeschaft voor transplantatie, kan het hart met een korte vena cava inferior en/of afwezigheid van links atriale achterste muur presenteren.</li>
	<li>Interne inspectie voor eventuele gebreken - atriale septal defect (ASD), ventriculaire septal defect (VSD) of misvorming van de klep (aorta, pulmonale, mitralisklep, tricuspidalis) uitvoeren.</li>
	<li>Als een septal defect aanwezig is, moet u deze corrigeren met passende hechtingen (figuur 2A, 2B). De correctie van septal gebreken is nodig om de voortgang van de decellularization via de longslagader (PA) uitstroom troebelheid meting. Correctie van het septal defect verwijdert links naar juiste shunt, vandaar de uitstroom uit PA vertegenwoordigt de uitstroom van de coronaire circulatie via de coronaire sinus.</li>
	<li>Afbinden superior en inferior vena cava met 2-0 zijde hechtdraad (figuur 2C).</li>
	<li>Het ontleden van de aorta (Ao) uit de buurt van de belangrijkste PA (figuur 2D) voor de latere cannulation.</li>
	<li>Plaats verbindingslijnen, gebaseerd op de diameter van het vaartuig, de (Figuur 3) naar Ao en PA en hen veilig met 2-0 zijde hechtingen (figuur 4A).</li>
	<li>Plaats een buis lijn via de linkerboezem (figuur 4B) en naar de linker ventrikel (LV) (Figuur 3), met behulp van een van de longader lichaamsopeningen.</li>
	<li>Sluit een infusie-lijn aan de connector geplaatst in de Ao en de uitstroom lijn in de PA (Figuur 3).</li>
	<li>Plaats het bereid hart in een polyester zak in omgekeerde richting (ondersteboven).</li>
	<li>Plaats het zakje met hart verpakkingsgasssen perfusie en sluit het deksel (figuur 4C).</li>
	<li>Elk van de lijnen verbinden met de respectieve poorten in de rubberstop (gebaseerd op de diameter van de container) en plaats deze op het deksel van de container van de perfusie te verzegelen het polyester zakje (figuur 4C en figuur 5B).</li>
	<li>Perfuse 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4 in gedistilleerd water, pH 7.4) via de poort van de infusie van de rubberstop om te controleren of de uitstroom van de PA en aan de lijn ingevoegd in LV.</li>
	<li>Gebruik deze stroom te reinigen van het orgaan van eventuele resterende sporen van bloed in de therapieën. Als stroom niet waargenomen wordt, scherpen de verbindingslijnen als ze misschien wel los.</li>
</ol>2. de systeeminstellingen en orgel Decellularization Procedure
<ol><li>Monteren van de bioreactor en plaats in een staande afdrukstand (Figuur 5). De perfusie-systeem omvat een personal computer (PC), evenredige-integraal-afgeleide (PID) controller, een peristaltische pomp voor Ao infusie, een bioreactor perfusie, een druk hoofd container voor LV perfusaat retentie (2L aspirator fles met bodem pistool), en een peristaltische pomp voor afvoer overtollige vocht uit de druk hoofd container en voor het verzamelen van de uitstroom van PA.</li>
	<li>In het rubber septum, verbinden met de lijn van de infusie, druk-hoofd lijn, PA-uitstroom lijn en bioreactor zuig lijn de rubber dop oppervlakte poorten geplaatst op de top van de perfusie bioreactor (figuur 5A).</li>
	<li>Decellularize hart onder constante druk van 120 mmHg gemeten aan de aorta wortel. Gemiddelde druk van de LV moet binnen de 14-18 mmHg gedurende het hele decellularization proces.</li>
	<li>Decellularize harten als volgt: 4 h van hypertonic oplossing (500 mM NaCl), 2 h van hypotone oplossing (20 mM NaCl), 120 h van het natrium dodecyl sulfaat (SDS 1%) oplossing, en een laatste wassen met 120 L 1 X PBS (figuur 6A).</li>
	<li>Decellularize de harten onder constante druk controle (120 mmHg). Infusie debiet in Ao is afhankelijk van de hart en bedraagt gemiddeld, 98.06±16.22 mL/min voor hypertonic oplossing, 76.14±7.90 mL/min voor hypotone oplossing, 151.50±5.76 mL/min voor SDS en 185.24±7.10 mL/min voor PBS. De totale verbruikte hoeveelheid elk reagens gemiddelden 23.36±5.70 L voor hypertonic oplossing en 9.13±1.26 L voor hypotone oplossing gebracht.</li>
	<li>Recirculate de laatste 60 L van 1% SDS (1 L per gram gewicht van het hart) tot het einde van SDS perfusie. Figuur 6A toont een tijdlijn voor het proces van decellularization, aanleiding kunnen geven tot eindpunten voor gegevensverzameling: tarief toezicht (Ao en PA) en uitstroom collectie (PA en niet-PA) van druk hoofd tijdens decellularization stromen.</li>
	<li>Aangezien de SVC en IVC als ligatuur zijn verbonden, is het redelijk te veronderstellen dat alle vloeistof verzameld van de PA is het resultaat van werkelijke coronaire perfusie (figuur 5B). Het debiet van perfusaat uit de PA door het debiet van geïnfundeerd oplossing direct te verdelen in Ao om coronaire perfusie efficiëntie te bepalen: Coronaire perfusie efficiëntie = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58123/58123eq1.jpg"> (%).</li>
	<li>Vergelijkende analyse van het perfusaat verkregen uit de PA en de LV en de geïnfundeerd oplossingen in tweevoud laden 200 μl per putje in een duidelijke bodemplaat 96-Wells en het lezen van de absorptie bij 280 nm. De waarde van de absorptie, empirisch geselecteerd na het uitproberen van verschillende waarden, werd gevonden om het beste genormaliseerde waarden.</li>
	<li>De troebelheid van schone geïnfundeerd reagens als het besturingselement gebruiken. De troebelheid van het perfusaat uitstroom wegspoeling van cel vuil vertegenwoordigt en direct tijdens decellularization als een hulpprogramma voor het bijhouden van het proces kan worden gekwantificeerd.</li>
	<li>Voeg tijdens de laatste wash met 10 L 1 X PBS, 500 mL steriele geneutraliseerde 2,1% Perazijnzuur zuuroplossing, geneutraliseerd met 10N NaOH, wat leidt tot een 0,1% Perazijnzuur zure oplossing (v/v) in PBS. Gebruik deze oplossing om de steiger te steriliseren.</li>
</ol>3. evaluatie van Decellularized hart
Opmerking: Na decellularization, representatieve harten zal worden gebruikt voor coronair angiogram beeldvorming en biochemische tests.
<ol><li>Uitvoeren van Coronaire Angiografie van de representatieve decellularized menselijk hart te onderzoeken de intactheid van de coronaire therapieën. Kortom, met behulp van een fluoroscope, afbeelding decellularized menselijk hart na injectie van contrast agent door coronaire ostial canule in de belangrijkste rechter en linker kransslagaders.</li>
	<li>Het ontleden van het decellularized hart om monsters uit 19 gebieden de resterende deoxyribonucleic acid (DNA), glycosaminoglycaan (GAG) en SDS niveaus in decellularized weefsels te evalueren. Neem de voet van het hart van de ventrikels en ontleden de ventrikels in 4 gelijke delen (Figuur 6 c). Verdeel elke sectie in de voorste en achterste rechterventrikel (RV), de voorste en achterste LV en het hart septum (IVS). Het weefsel bevattende de apex is ontleed in de LV en RV voor bemonstering.</li>
	<li>Gesneden weefselmonsters voor DNA, GAG en SDS assays (~ 15 mg van versgewicht).</li>
	<li>Double-stranded DNA (dsDNA) te halen door het verteren van monsters in 1 M NaOH gedurende 3 uur bij 65 ° C en breng pH op 7 met behulp van 10 x Tris-EDTA (TE) buffer en 1 M zoutzuur (HCl).</li>
	<li>Kwantificeren van dsDNA een dsDNA Assay kit met een kalf thymus standaard (Zie Tabel van materialen). Lees monsters in tweevoud fluorescentie microplate lezer gebruikt (excitatie bij 480 nm en emissie bij de 520 nm). Bereken het percentage van de resterende dsDNA in de decellularized harten door het vergelijken van dsDNA concentratie in elk weefsel dat in dode foetussen (% dode foetussen).</li>
	<li>Krijgen sulfated GAGs in oplossing door het verteren van weefselmonsters een extractievloeistof papaïne (0,2 M natriumfosfaat buffer met EDTA Dinatrium zout, cysteïne HCl, natriumacetaat en papaïne) bij 65 ° C gedurende 3 uur. GAG inhoud (in tweevoud) meten met behulp van een glycosaminoglycaan Assay Kit.</li>
	<li>Lyophilize monsters voor SDS assay in een verwarmde vacuüm en maatregel drooggewicht. 200 µL ultrazuiver water toevoegen aan elk gedroogde monster en homogeniseren om uit te pakken van de resterende SDS in oplossing. Meng deze SDS-oplossing met chloroform en een methyleenblauwoplossing (12 mg methyleenblauw in 1 L 0,01 M HCl). De SDS zal in de organische laag door binding aan de kleurstof methyleenblauw scheiden.</li>
	<li>Met behulp van een fluorescentie microplate lezer, lees de extinctie (655 nm) van het standards and monsters in tweevoud voor de berekening van de residuele SDS. Normaliseren deze SDS waarde aan weefsel drooggewicht.</li>
	<li>Foto's van dikke regio's (dat wil zeggen, LV, RV en septum) van menselijk hart met niet-lineaire optische microscopie (NLOM), cellulaire verwijdering na decellularization te bevestigen. Het NLOM-setup wordt gedetailleerd beschreven in onze eerdere publicaties18,19,20. NLOM ons in staat stelt aan beeld cel elastine, collageen en myosin vezels via haar twee-foton fluorescentie (TPF) en de tweede-harmonische generatie (SHG) zenders zonder gebruik te maken van een exogene vlek of kleurstof21.</li>
</ol>

<ol><li>Writing Group Members. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26811276">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).</li>
<li>Zia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearts+beating+through+decellularized+scaffolds%3A+whole-organ+engineering+for+cardiac+regeneration+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strip+and+Dress+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Strip and Dress the Human Heart.</a> Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+Using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+human+heart+matrix%3A+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li>
<li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+perspectives+in+whole-organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6, 107(2015).</li>
<li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularization+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li>
<li>Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+Processes+to+Decellularize+and+Cellularize+Hearts+to+Generate+Functional+Organs+and+Reduce+the+Risk+of+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B-Reviews%22%5BJournal%5D)">Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis.</a> Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).</li>
<li>Lee, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+orientation+improves+decellularization+of+whole+porcine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts.</a> Acta Biomaterialia. , (2016).</li>
<li>Momtahan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+Pressure+Control+Improves+Whole+Porcine+Heart+Decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Perfusion+Decellularization+Porcine+Heart+Model+-+Generation+of+3-Dimensional+Myocardial+Neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds.</a> Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioartificial+heart%3A+A+human-sized+porcine+model--the+way+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead.</a> PLoS One. 9 (11), e111591(2014).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e50059(2012).</li>
<li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li>
<li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+from+acellular+human+heart+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Data from acellular human heart matrix.</a> Data Brief. 8, 211-219 (2016).</li>
<li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+Rapid+production+of+human+heart+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts.</a> Biomaterials. 98, 64-78 (2016).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cardiac+Extracellular+Matrix+from+an+Intact+Porcine+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).</li>
<li>Larson, A. M., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+of+sub-10-fs+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses.</a> Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).</li>
<li>Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy+reveals+invading+endothelial+cells+anisotropically+alter+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices.</a> Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).</li>
<li>Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+responses+are+enhanced+in+mechanically+and+microscopically+characterized%2C+microbial+transglutaminase+crosslinked+collagen+matrices+with+increased+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Ramanathan, T., Skinner, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bjaed/article/5/2/61/422091">Coronary blood flow.</a> Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).</li>
<li>Murthy, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Quantification+of+Myocardial+Blood+Flow+Using+PET%3A+Joint+Position+Paper+of+the+SNMMI+Cardiovascular+Council+and+the+ASNC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC.</a> Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).</li>
<li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+organ+weights+in+men%3A+Part+I-the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Forensic+Medicine+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal organ weights in men: Part I-the heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).</li>
<li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Organ+Weights+in+Women%3A+Part+I-The+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Forensic+Medicine+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).</li>
<li>Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0090406">Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix.</a> PLoS One. 9 (2), e90406(2014).</li>
<li>Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29377912">Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology.</a> PLoS One. 13 (1), e0191892(2018).</li>
<li>Baghalishahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+extracellular+matrix+hydrogel+together+with+or+without+inducer+cocktail+improves+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+differentiation+into+cardiomyocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cardiac+extracellular+matrix+hydrogels+for+cultivation+of+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).</li>
<li>Oberwallner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li>
</ol>

Dr. Taylor is de oprichter en aandeelhouder van Miromatrix Medical, Inc. Deze relatie wordt beheerd overeenkomstig het beleid van belangenconflict door de Universiteit van Minnesota en Texas Heart Institute; de andere auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Om onze kennis is dit de eerste studie verslag omgekeerde decellularization van menselijke harten binnen een hydrofoor etui met time-lapse toezicht op stroom tarief en cel puin verwijderen. Het pericard-achtige zakje houdt de richting van het hart stabiel gedurende de hele procedure decellularization. Inlaten en omkeren van de hele hart binnen een zakje voorkomt uitdroging en minimaliseert overmatige krachten op de aorta (van hart gewicht) wanneer vergeleken met de conventionele rechtop Langendorff perfusie decellulariza...

Hartfalen leidt tot een hoge mortaliteit bij patiënten. De ultieme behandelingsoptie voor einde-fase hartfalen is allo-transplantatie. Echter, er is een lange wachtlijst voor transplantatie als gevolg van de tekort van donor-organen, en patiënten gezicht na transplantatie horden variërend van levenslang bij immuunsuppressie tot chronische orgel afwijzing1,2. Bioengineering functionele harten door repopulatie decellularized mens en middelgrote hart met een patiënt eigen cellen kunnen omzeilen deze horden3.
Een belangrijke stap in "engineering" een hart is de oprichting van een steiger met passende vasculaire en parenchymal structuur, de samenstelling en de functie voor het begeleiden van de uitlijning en de organisatie van geleverde cellen. In aanwezigheid van het geschikte kader, moeten cellen uitgezaaid op het schavot herkennen van het milieu en de verwachte functie uitvoeren als onderdeel van dat orgaan. Volgens ons omvat decellularized orgel extracellulaire matrix (dECM) de nodige kenmerken van het ideale schavot.
Door gebruik te maken van intrinsieke therapieën, kan complexe geheel-orgel-decellularization worden bereikt via antegrade of retrograde perfusie4 om te verwijderen van cellulaire componenten met behoud van de gevoelige 3D extracellulaire matrix en therapieën2, 5,6,7. Een functionele therapieën is belangrijk in bioengineering hele organen gewoon zoals het is in vivo, voor nutriënten distributie en afval verwijdering8. Coronaire perfusie decellularization heeft bewezen effectief te zijn in het creëren van decellularized harten van ratten4of varkens4,7,9,10,11 ,12,13, en mensen5,7,14,15,16. Integriteit van de kleppen, atria en andere "thin" regio's kan echter nadelig beïnvloeden.
Mens-grootte decellularized hart steigers kunnen worden verkregen van varkens met behulp van druk control7,9,10,11,12 of infusie flow rate control13, 17 encontrole van menselijke donoren druk met5,7,14,15. Decellularization van menselijke donor hart doet zich voor meer dan 4-8 dagen onder druk gecontroleerd op 80-100 mmHg in staande oriëntatie5,15,16 of meer dan 16 dagen onder druk gecontroleerd op 60 mmHg14 . Onder antegrade, druk-gecontroleerde decellularization, speelt de bekwaamheid van de aortaklep een cruciale rol bij het handhaven van de efficiëntie van de coronaire perfusie en stabiele druk in de aorta hoofdmap. Onze vorige werk is gebleken dat de richting van het hart invloed op de efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens de procedure decellularization en dus de integriteit van de steiger in het einde9.
Als een voortzetting van onze eerdere werk9introduceren we een nieuw concept waarin een hartzakje-achtige zakje is toegevoegd ter verbetering van de gehele-hart decellularization. We beschrijven de decellularization van menselijke harten geplaatst binnen hydrofoor zakjes, omgekeerd georiënteerd, en onder druk gecontroleerd op 120 mmHg bij de aorta wortel. Dit protocol omvat het toezicht op het profiel van de stroom en de verzameling uitstroom media gedurende de decellularization procedure voor de evaluatie van de efficiëntie van de coronaire perfusie en cel puin verwijderen. Biochemische tests worden vervolgens uitgevoerd om te testen van de effectiviteit van de methode.

```html
<table><tbody><tr><td>2-0 zijden hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>SA85H</td><td>Hechtdraad gebruikt om superieure en inferieure vena cava te binden</td></tr><tr><td>1/4" x 3/8" connector met luer</td><td>NovoSci</td><td>332023-000</td><td>Verbindt aorta en longslagader</td></tr><tr><td>Masterflex platina-gehard siliconen slang</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96410-16</td><td>Slang om hartkamers/aders te verbinden</td></tr><tr><td>Infusie- en uitstroomlijn</td><td>Smiths Medical</td><td>MX452FL</td><td>Voor het doorstromen van oplossingen door het vaatstelsel</td></tr><tr><td>Polyester zakje (Ampak 400 Series SealPAK Zakjes)</td><td>Fisher scientific</td><td>01-812-17</td><td>Pericard-achtig zakje om het hart te bevatten tijdens decellularisatie</td></tr><tr><td>Snapware Square-Grip Canister</td><td>Snapware</td><td>1022</td><td>1-liter container gebruikt voor het perfunderen van het hart</td></tr><tr><td>Zwarte rubberen stoppen</td><td>VWR</td><td>59586-162</td><td>Om de perfusiecontainer te verzegelen</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>881003</td><td>Om vloeistof door de instroomlijnen te pompen en vloeistoffen af te tappen</td></tr><tr><td>2 L aspiratiefles met zijarm</td><td>VWR</td><td>89001-532</td><td>Voor het bewaren van oplossingen/perfusiemiddel</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td>Voor het kwantificeren van dsDNA</td></tr><tr><td>Calf thymus standaard</td><td>Sigma</td><td>D4522</td><td>DNA standaard</td></tr><tr><td>Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit</td><td>Biocolor Ltd</td><td>Blyscan #B1000</td><td>GAG-assaykit</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 Pro</td><td>Voor analytische tests</td></tr><tr><td>GE fluoroscopie</td><td>General Electric</td><td>OEC 9900 Elite</td><td>Angiogram</td></tr><tr><td>Visipaque</td><td>GE</td><td>13233575</td><td>Contrastmiddel</td></tr></tbody></table>
```

decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

De ultieme oplossing voor patiënten met hartfalen einde-fase is orgaantransplantatie. Maar bij immuunsuppressie is vereist, donor harten zijn beperkt en uiteindelijk afwijzing kan optreden. Het maken van een functioneel, kon autologe bio-kunsthart deze uitdagingen oplossen. Biofabrication van een hart dat bestaat uit de steiger en cellen is een optie. Een natuurlijke steiger met weefsel-specifieke samenstelling evenals micro - en macro-architectuur kan worden verkregen door decellularizing harten van mensen of grote dieren zoals varkens. Decellularization omvat cellulaire puin terwijl behoud 3D extracellulaire matrix en therapieën en "cellularization" waardoor op een later timepoint spoelen. Inspelend op onze roman vinden dat decellularization perfusie van complexe organen is mogelijk, wij een meer "fysiologisch" methode ontwikkeld om niet-transplanteerbaar menselijke harten door ze te plaatsen binnen een hydrofoor etui, in een omgekeerde decellularize oriëntatie, onder gecontroleerde druk. Het doel van het gebruik van een hydrofoor zakje is druk om kleurovergangen te maken over de aortaklep het gesloten houden en verbeteren van myocardiale perfusie. Gelijktijdige beoordeling van de dynamiek van de stroom en cellulaire puin verwijdering tijdens decellularization konden we ten aanzien van zowel vloeistof instroom en uitstroom van puin, waardoor het genereren van een steiger die kan worden gebruikt voor eenvoudige cardiale reparatie (bijvoorbeeld als een patch of ventiel steiger) of als een geheel-orgel-steiger.

Na een 7-daagse decellularization met antegrade aorta perfusie onder constante druk van 120 mmHg draaide het menselijk hart doorschijnend (figuur 6B). Het hart was Grove ontleed in 19 secties voor biochemische (DNA, GAG en SDS) analyse (Figuur 6 c) voor de evaluatie van het eindproduct van de decellularized.
Tijdens het proces van decellularization, was de infusie debie...

Deze methode kan decellularization voor een complexe solide orgel met behulp van een eenvoudig protocol gebaseerd op osmotische schok en perfusie van Ionische detergent met minimale orgel matrix verstoring. Het bestaat uit een roman decellularization-techniek voor menselijke harten binnen een hydrofoor etui met real-time bewaking van flow dynamics en cellulaire puin uitstroom.

Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het genereren van gevasculariseerde steigers, die echt de heilige graal van het weefsel engineering veld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een onder druk gestelde zak in een omgekeerde oriëntatie de decellularisatie van niet-transplanteerbare menselijke organen verbetert en ons dat op een steriele manier over een geschikt tijdsbestek laat doen. Om het hart voor te bereiden op decellularisatie, voert u eerst een interne inspectie uit op mogelijke defecten.Als er een septumdefect aanwezig is, corrigeer dan het defect met de juiste hechtingen. Vervolgens ligate de superieure en inferieure vena cavas met 2-0 zijde hechting. Hecht de rechter atriumwand met 5-0 PROLENE en ontleed de aorta uit de buurt van de belangrijkste longslagader voor de volgende cannulation.Plaats de connectoren, afhankelijk van de diameter van het vat, in de aorta en de longslagader en zet de connectoren vast met 2-0 zijden hechtingen. Met behulp van een van de longaderopeningen, steek een buizenlijn door het linkeratrium naar de linkerventrikel, en sluit een infuuslijn aan op de connector in de aorta en een uitstroomlijn n

decellularization-whole-human-heart-inside-pressurized-pouch-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven de isolatie van neonatale cardiomyocyten en de voorbereiding van de cellen voor inkapseling in fibrine hydrogel constructen voor tissue engineering. We beschrijven methoden voor het analyseren van de weefselmanipulatieproducten myocard na de cultuur periode met inbegrip van actieve kracht die op elektrische stimulatie en levensvatbaarheid van de cellen en immunohistologische vlekken.

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

This video demonstrates a method of producing decellularized extracellular matrix or ECM scaffolds by applying antegrade perfusion of detergents through the vasculature. The structural ECM scaffolds can then be used to analyze ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

Cardiopulmonary Complex Decellularization: A Technique for Decellularizing Heart and Lungs from Murine Model

Een methode om snel en volledig cellulaire componenten uit een intact varkens hart door retrograde perfusie beschreven. Deze methode levert een plaatsspecifieke cardiale extracellulaire matrix scaffold die het potentieel voor gebruik in verscheidene klinische toepassingen.

Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie

In deze studies geven we nieuwe methodologie voor neonatale muizen cardiale scaffolds voor gebruik in regeneratieve studies.

Neonatale Cardiac Steigers: Novel Matrices voor Regenerative Studies

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

De cardiale extracellulaire matrix (ECM) is een complex netwerk van moleculen die orkestreren van belangrijke processen in weefsels en organen terwijl blijvende fysiologische remodelleren gedurende het hele leven. Gestandaardiseerde decellularization van foetale en volwassen hart toelaat vergelijkende experimentele studies van beide weefsels in een 3D-kader door het vastleggen van inheemse architectuur en biomechanische eigenschappen.

Vergelijkbare Decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel explantaten als 3D-achtige platformen voor In Vitro Studies

Dit protocol heeft tot doel het hart en de longen van muizen te decellulariseren. De resulterende extracellulaire matrix (ECM) steigers kunnen immunos gekleurd en afgebeeld worden om de locatie en topologie van hun componenten in kaart te brengen.

Decellularisatie van het Murine Cardiopulmonaal Complex

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Dit protocol presenteert een uitgebreide pijplijn voor het analyseren van monsters die zijn verkregen uit menselijke harten die de microscopische en macroscopische schaal overspannen.

Pijplijn voor driedimensionale anatomische studie op meerdere schaal van het menselijk hart

Leer decellularisatie van menselijke harten met een geperst hydrofoor tasje in omgekeerde richting. Deze methode minimaliseert matrixverstoring en maakt real-time monitoring van stromingsdynamica mogelijk voor weefselengineering.

Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting

Meer video's verkennen