Name: Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer HPLC-analyse van kynurenine en kynureenzuur in rattenhersenen en plasma. Deze methode meet betrouwbaar metabolieten van het kynureninepad om inzicht te geven in cognitieve en slaapstoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De huidige studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 NS102209) en een donatie van de Clare E. Forbes Trust.

<ol><li>Leklem, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+aspects+of+tryptophan+metabolism+in+humans+and+other+species%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).</li>
<li>Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128009819000250">Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior</a>. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).</li>
<li>Hilmas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+metabolite+kynurenic+acid+inhibits+alpha7+nicotinic+receptor+activity+and+increases+non-alpha7+nicotinic+receptor+expression%3A+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications.</a> Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).</li>
<li>Perkins, M. N., Stone, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iontophoretic+investigation+of+the+actions+of+convulsant+kynurenines+and+their+interaction+with+the+endogenous+excitant+quinolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid.</a> Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).</li>
<li>DiNatale, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+is+a+potent+endogenous+aryl+hydrocarbon+receptor+ligand+that+synergistically+induces+interleukin-6+in+the+presence+of+inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling.</a> Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+as+a+ligand+for+orphan+G+protein-coupled+receptor+GPR35%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).</li>
<li>Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+elevations+of+brain+kynurenic+acid+impair+cognitive+flexibility%3A+normalization+by+the+alpha7+positive+modulator+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine.</a> Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).</li>
<li>Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-kynurenine+treatment+alters+contextual+fear+conditioning+and+context+discrimination+but+not+cue-specific+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning.</a> Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).</li>
<li>Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+of+endogenous+kynurenic+acid+produce+spatial+working+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits.</a> Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).</li>
<li>Pocivavsek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+endogenous+kynurenic+acid+control+hippocampal+glutamate+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).</li>
<li>Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kynurenine+Challenge+Disrupts+Sleep-Wake+Architecture+and+Impairs+Contextual+Memory+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats.</a> Sleep. 40 (11), (2017).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+sleep+homeostasis+and+cognitive+consequences+of+sleep+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss.</a> Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Erhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+levels+are+elevated+in+the+cerebrospinal+fluid+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia.</a> Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).</li>
<li>Linderholm, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+kynurenine+and+kynurenic+acid+in+the+CSF+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+kynurenine+pathway+metabolism+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).</li>
<li>Schwarcz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cortical+kynurenate+content+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased cortical kynurenate content in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).</li>
<li>Pocivavsek, A., Rowland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Neuroscience+Illuminates+Causal+Relationship+Between+Sleep+and+Memory%3A+Translating+to+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).</li>
<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+consolidation+during+sleep%3A+a+neurophysiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective.</a> Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).</li>
<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
<li>Yamashita, M., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+circuit+in+fatigue%3A+From+blood+to+brain+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition.</a> Brain Research. 1675, 116-126 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor een betrouwbare beoordeling van KYNA in de hersenen na de toediening van een perifere kynurenine is het essentieel om te combineren en interpreteren van biochemische en functionele experimenten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee nieuwe gebruikers om te voorzien in doeltreffende methoden voor het meten van het plasma kynurenine en de hersenen KYNA van ratten. De meting van kynurenine in het plasma bevestigd de nauwkeurige injectie en de meting van de metaboliet KYNA bevestigt de DOVO syn...

De KP is verantwoordelijk voor bijna 95% van het essentiële aminozuur tryptofaan1vernederende. In de hersenen van zoogdieren, wordt kynurenine astrocyten rekening gemetaboliseerd in de neuroactive klein molecuul KYNA voornamelijk door het enzym kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungeert als een antagonist op NMDA en de α7nACh-receptoren in de hersenen2,3,4, en ook doelstellingen signalering receptoren met inbegrip van de aryl koolwaterstof receptor (AHR) en het G-eiwit gekoppelde receptor 35 (GPR35)5 ,6. Bij proefdieren, is waterstand in hersenen KYNA gebleken dat schade kunnen toebrengen aan hun cognitieve prestaties in een array van gedrags assays2,7,8,9,10 . Een opkomende hypothese suggereert dat KYNA een integrale rol bij het moduleren van cognitieve functies door de invloed van slaap-waak gedrag11 speelt, dus verder ter ondersteuning van de rol van Astrocyt-afgeleide moleculen bij het moduleren van de neurobiologie van slaap en cognitie12.
Klinisch, waterstand in KYNA gevonden in cerebrospinaal vocht en Postmortem hersenweefsel van patiënten met schizofrenie13,14,15,16, een invaliderende psychiatrische stoornis gekenmerkt door cognitieve beperkingen. Patiënten met schizofrenie worden ook vaak geplaagd door slaapstoornissen die de ziekte17 verergeren kunnen. Het begrip van de rol van KP metabolisme en KYNA bij het moduleren van een relatie tussen slaap en cognitie, met name tussen leren en geheugen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van deze slechte resultaten in schizofrenie en andere psychiatrische ziekten.
Een betrouwbare en consistente methode voor het meten van KP metabolieten is belangrijk om ervoor te zorgen dat het onderzoek die uit verschillende instellingen kan worden geïntegreerd in het wetenschappelijk begrip van KP biologie. Op dit moment beschrijven we de methode voor het meten van kynurenine in rat plasma en KYNA in de rat hersenen door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Het huidige protocol, dat maakt gebruik van een fluorimetrische detectie in aanwezigheid van Zn2 +, werd eerst ontwikkeld door Shibata18 en meer onlangs aangepast en geoptimaliseerd voor het derivatize met 500 mM zink acetaat als het na kolom reagens, waardoor het opsporen van endogene, nanomolar hoeveelheid KYNA in de hersenen-11.
Om te stimuleren de productie van DOVO endogene KYNA zoals beschreven in het huidige protocol, de directe bioprecursor kynurenine intraperitoneally wordt geïnjecteerd (i.p.) bij ratten. In combinatie met biochemische analyses om te bepalen van de mate van KYNA productie, de gevolgen van een kynurenine uitdaging op het hippocampal-afhankelijke geheugen (passieve vermijden paradigma) en het slaap-waak-architectuur (EEG en EMG signalen) is ook onderzochte11. Een combinatie van deze technieken zorgt voor de studie van de biochemische en functionele gevolgen van een kynurenine uitdaging in vivo bij ratten.

```html
<table><tbody><tr><td>Wistar ratten</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>volwassen mannetje, 250-350 g</td></tr><tr><td>L-kynureninesulfaat</td><td>Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 kolom (4 mm x 150 mm)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>Montagematerialen schroeven</td><td>PlasticsOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Niet-absorbeerbare hechtdraden</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid Black Nylon Hechtdraden, 4-0, P-3, 18", DOOS VAN 12</td></tr><tr><td>Absorbeerbare hechtdraden</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 Gecoat Vicryl Violet 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>Tandcement</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Boortje</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0,45 mm</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Alliance HPLC-systeem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695 scheidingsmodule</td><td>Waters</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>2475 fluorescentiedetector</td><td>Waters</td><td>186247500</td><td></td></tr><tr><td>post-kolom reagent manager</td><td>Waters</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>Lenovo-computer</td><td>Waters</td><td>668000249</td><td></td></tr><tr><td>Empower-software</td><td>Waters</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Passieve vermijdingsbox voor rat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra hoge MDF geluidsdempingscabine</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>Interieur: 22" (B) x 22" (H) x 16" (D)</td></tr><tr><td>Middenkanaal modulator shuttlebox kamer</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrij stalen roostervloer voor rat</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>Automatische guillotinedeur</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>Snelle ontkoppelingsharnas voor shuttlebox roostervloer voor rat</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>Stimuluslicht, 1" witte lens, gemonteerd op modulair paneel</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>Sonalert-module met volumeregeling voor ratkamer</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>SmartCtrl 8 invoer/16 uitvoer pakket</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>8-kanaals IR-besturing voor shuttleboxen</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>Infraroodbron en detectiearraystrips</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>Tabelinterfacekast, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>Dual range constant current aversieve stimulatiemodule</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>Solid state roostervloer scrambler module</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>Dual A/B shockbesturingsmodule</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2' 3-Pin mini-molex verlengkabel</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>10' Shockuitgangskabel, DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>Shuttleshockbesturingskabel 15', 6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>Kleine tafelkast en voeding, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td>PCI-interfacepakket</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>Shuttlebox vermijdbaarheidsutilitypakket</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Slaap-waakmonitoringapparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah-software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Source Acquisition interface</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>Dell-computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>Dell 19" computermonitor</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>Ontvangers voor plastic kooien, 8x</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Cisco RV130 VPN-router</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>Netwerkswitch</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Neuroscore-software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Twee biopotentiaalkanaalzendontvanger, model TL11M2-F40-EET</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>
```

een high-performance liquid chromatography-meting van kynurenine en kynurenic zuur: biochemie voor cognitie en slaap in ratten

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

De kynurenine traject (KP) van de afbraak van tryptofaan heeft betrokken bij psychiatrische stoornissen. In het bijzonder de Astrocyt afkomstige metaboliet kynurenic zuur (KYNA), een antagonist bij beide N-methyl-d-aspartaat (NMDA) en α7 nicotinerge acetylcholine (α7nACh) receptoren, heeft betrokken bij cognitieve processen bij gezondheid en ziekte. Als KYNA niveaus zijn verhoogde in de hersenen van patiënten met schizofrenie, wordt een storing bij de glutamaterge en cholinerge receptoren verondersteld om het causaal verband kunnen houden met cognitieve dysfunctie, een domein van de kern van de psychopathologie van de ziekte. KYNA kan een pathophysiologically belangrijke rol bij personen met schizofrenie. Het is mogelijk om te verheffen van endogene KYNA in de knaagdier hersenen door de behandeling van dieren met de directe bioprecursor kynurenine en preklinische studies bij ratten hebben aangetoond dat acute waterstand in KYNA mogelijk van invloed op hun processen voor leren en geheugen. Het huidige protocol beschrijft deze experimentele aanpak in detail en combineert een) een biochemische analyse van bloedspiegels kynurenine en hersenen KYNA vorming (met behulp van krachtige vloeibare chromatografie), b) gedrags testen om de sonde de hippocampal-afhankelijke contextuele geheugen (passieve vermijden paradigma), en c) een evaluatie van het slaap-waak gedrag [telemetrische opnamen combineren electroencephalogram (EEG) en electromyogram (EMG) signalen] bij ratten. Tezamen, een relatie tussen verhoogde KYNA, slaap en cognitie wordt bestudeerd, en dit protocol beschrijft in detail een experimentele aanpak voor het begrip van de functie resultaten van kynurenine hoogte en KYNA vorming in vivo bij ratten. Resultaten die zijn verkregen door middel van variaties van dit protocol zal het testen van de hypothese dat de KP en KYNA dienen een cruciale rol bij het moduleren van de slaap en cognitie in gezondheid en ziekte staten.

Voor het valideren van het gebruik van een intraperitoneaal kynurenine injectie als een methode om de hersenen KYNA verheffen, werd een HPLC analyse van weefsel uitgevoerd. Standaard curven (Figuur 1) werden geconstrueerd met behulp van de bijbehorende software en voor de kwantificering van de weefselmonsters toegestaan. Representatieve chromatogrammen voor kynurenine en KYNA worden weergegeven in Figuur 2. Kynurenine werd waarge...

Wijzigingen in de kynurenine traject (KP) neuroactive metabolieten zijn betrokken bij de psychiatrische ziekten. Onderzoek naar de functionele uitkomsten van een gewijzigde kynurenine traject metabolisme in vivo bij knaagdieren kan helpen nieuwe therapeutische benaderingen toelichten. Het huidige protocol combineert biochemische en gedragsmatige benaderingen voor het onderzoek naar de gevolgen van een acute kynurenine uitdaging bij ratten.

Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

Deze methode combineert biochemische en gedragsbenaderingen om sleutelvragen in de neurowetenschappen te beantwoorden over de impact van een acute kynurenine-uitdaging bij ratten. Het grote voordeel van de techniek is dat het een betrouwbare en consistente methode biedt voor de meting van kynurenine-routemetabolieten in rattenhersenen en -plasma. De procedure zal worden gedemonstreerd door Carly Fabian, een student-onderzoeksassistent uit mijn laboratorium.Op het juiste experimentele eindpunt na intraperitoneale kynurenine-toediening, ontdooi het ingevroren verzamelde plasma op nat ijs en verdun de ontdooide monsters met ultrapuur water. Breng 100 microliter verdund monster over in individuele containers van 25 microliter 6% perchloorzuur en vortex in centrifugeer de monsters. Breng vervolgens 100 microliter supernatant van elk buisje over in individuele 250 microliter microcentrifugebuisjes voor kynurenine- en kynureninezuurbepaling.Voor kynureninezuurmeting uit hersenmonsters, ontdooi de ingevroren verzamelde hersenmonsters op droog ijs en weeg elk monster afzonderlijk op een nauwkeurige analytische weegschaal. Nadat alle monsters gewogen zijn, verplaats de buisjes naar nat ijs en verdun elk weefselmonster in een gewichtsverhouding van één tot 10 met ultrapuur water, gevolgd door homogenisatie met een sonicator. Pipetteer 100 microliter van elk monsterslurry naar een nieuw buisje en voeg vervolgens 25 microliter 25% perchloorzuur toe voor vortexen en centrifugeren.Breng vervolgens 100 microliter supernatant over in individuele 250 microliter microcentrifugebuisjes voor kynureninezuurbepaling. Om de hoge prestatie vloeistof chromatografie-, of HPLC-, machine voor kynurenine-analyse voor te bereiden, plaats eerst de individuele HPLC-opnamebuisjes in de mobiele fase, ultrapuur water en 100% acetonitril containers. Programmeer vervolgens het instrument om 5% acetonitril en 95% ultrapuur water te laten lopen met een snelheid van 0,5 milliliter per minuut en laat het HPLC-apparaat gedurende 20 tot 30 minuten lopen.Wanneer een stabiele druk en basislijn zijn bereikt, verander de oplossingssamenstelling in een mobiele fase van 5% acetonitril en 95% natriumacetaat en breng het instrument nog eens 30 minuten in evenwicht. Terwijl het instrument in evenwicht komt, zet de lamp in de fluorescentiedetector aan. Vóór de afleiding, pomp de zinkacetaatoplossing afzonderlijk door een peristaltische pomp die zich combineert met de mobiele fase na de kolom en zet de na-kolom pomp aan op een stroomsnelheid van 0,1 milliliter per minuut gedurende ongeveer 20 minuten, totdat deze een stabiele druk van ongeveer 500 psi bereikt.Wanneer het instrument klaar is voor de analyse, stel de systeemmsoftware in om de monstersequentieparamters te controleren en om de automatische injectie van meerdere monsters toe te staan. Klik in het scherm'Sample Run'op'File'en sleep naar'New Sample Set Maken'en selecteer'Empty'in het nieuwe venster. Vermeld individueel alle standaarden en monsters in de volgorde waarin ze moeten worden uitgevoerd, met de standaarden aan het begin en einde van de sequentie.In de functiekolom, wijs de standaarden en monsters aan en stel het programma in om water tussen elke vijf monsters te injecteren. Stel de looptijd voor elk monster in op 15 minuten en injecteer 20 microliter van de standaarden, gevolgd door 20 microliter van de plasmamonsters en 30 microliter van de hersenhomogenaatmonsters, zoals experimenteel gepast. Stel vervolgens de excitatie- en emissiegolflengten in op basis van de gemeten verbinding en voer de sequentie uit.Om de gegevens te kwantificeren, open het'Browse Project'scherm en dubbelklik onder het tabblad'Sample Sets'op de te kwantificeren monsterserie. Markeer vanuit de lijst met injecties alle standaarden en klik met de rechtermuisknop om'Process'te selecteren in het nieuwe venster. Gebruik vervolgens het vervolgkeuzemenu om'Calibrate and Quantitate'te selecteren. Markeer vervolgens alle standaarden opnieuw, klik met de rechtermuisknop en selecteer'Review'. Wanneer de chromatogrammen openen, integreer en calibreer elke standaard om de standaardcurve te genereren.Keer vervolgens terug naar het tabblad'Sample Sets'en dubbelklik op de monsterserie om te kwantificeren en te beoordelen zoals gedemonstreerd, waarbij elk monster wordt geïntegreerd en gekwantificeerd om de concentratie van elk monster te verkrijgen op basis van de eerder gemaakte standaardcurve. HPLC-analyse van weefselmonsters verzameld van met kynurenine behandelde dieren toont een kynurenine-retentietijd van ongeveer zes minuten en een kynureninezuur-retentietijd van ongeveer 11 minuten. De kwantificering van plasma-kynurenine en hippocampale kynureninezuur onthult dat acute kynurenine-injectie de hersen-kynureninezuurniveaus verhoogt met een piek die wordt bereikt bij twee uur na injectie en die bij vier uur na injectie weer terugkeert naar het uitgangsniveau.Hoewel er geen groepsverschillen worden waargenomen tijdens passieve vermijdingsparadigma-trainingsproeven, vertoont controle-dieren een significante toename van de latentie om de donkere kant te betreden tijdens testproeven, wat contextueel leren aangeeft, terwijl dieren die 24 uur eerder met kynurenine zijn geïnjecteerd dezelfde toename van latentie niet vertonen, wat een tekort aan leren aantoont. Verder wijst de beoordeling van de impact van een acute kynurenine-verhoging tijdens de lichtfase op de slaap-waakritme-architectuur op een vermindering van de totale slaapduur met snelle oogbewegingen gedurende de eerste twee uur na kynurenine-injectie. Deze gegevens worden weerspiegeld door een toename van de waakduur gedurende deze tijdsperioden en een lichte vermindering van niet-slaap met snelle oogbewegingen, wat aantoont dat een acute kynurenine-verhoging ook storingen in de slaap-waakdynamiek veroorzaakt.Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals gedragsanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol van verhoogde kynureninezuurvorming bij het moduleren van cognitie en slaap.

a-high-performance-liquid-chromatography-measurement-kynurenine

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Een procedure beschreven voor het manipuleren van de activiteit van cerebrale corticale piramidale neuronen optogenetically terwijl de elektro, elektromyogram en cerebrale lactaatconcentratie bewaakt. Experimentele opnamen worden uitgevoerd op kabel-tethered muizen, terwijl ze ondergaan spontane slaap / waak cyclus. Optogenetic apparatuur geassembleerd in ons laboratorium controleapparaat handel verkrijgbaar.

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

This video demonstrates a protocol for implanting an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) electrode assembly in an anesthetized mouse. The process involves securing the mouse on a stereotaxic frame, making a midline incision in the skull, drilling holes for the electrodes, and fixing the electrode unit for signal recording. After recovery, the mouse's sleep-wake behavior is analyzed using the recorded signals.

Analyzing Sleep Behavior in Mice through Electroencephalogram and Electromyogram Recordings

De registratie van elektro-encefalogram (EEG) en elektromyogram (EMG) bij muizen die zich vrij kunnen bewegen, is een cruciale stap om gedrag en fysiologie te correleren met slaap en waakzaamheid. Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven, biedt een kabelgebaseerd systeem voor het verkrijgen van EEG- en EMG-opnamen bij muizen.

Huisstijlen Opname Procedure voor het meten van de Slaap in Muizen

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Beschrijven we een hoge-doorvoer-methode voor het meten van de slaap door middel van activiteiten gebaseerde home-kooi bewaking. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele EEG gebaseerde methoden. Het kan is goed gevalideerd voor de bepaling van de totale slaap duur en een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van de slaap in knaagdier modellen van ziekten bij de mens.

Noninvasive, High-throughput bepaling van de duur van de slaap in knaagdieren

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Slaap verlies en circadiane misuitlijning dragen bij aan tal van operationele ongevallen en incidenten. De effectiviteit van tegenmaatregelen en werkplanningontwerpen gericht op het verzachten van vermoeidheid kan een uitdaging zijn om te evalueren in operationele omgevingen. Dit manuscript vat een benadering samen voor het verzamelen van slaap-, circadiane-, Vermoeidheids-en prestatiegegevens in complexe operationele omgevingen.

Het verzamelen van slaap-, circadiane-, vermoeidheid-en prestatiegegevens in complexe operationele omgevingen

Hier presenteren we een methode om dagritmes in prestaties te onderzoeken na nauwkeurige categorisering van deelnemers in circadiane fenotypegroepen op basis van de München ChronoType Questionnaire, gouden standaard circadiane fase biomarkers en actigrafische metingen.

Human Circadian Phenotyping en Diurnal Performance Testing in de echte wereld

Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.

Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

Leer HPLC-analyse van kynurenine en kynureenzuur in rattenhersenen en plasma. Deze methode meet betrouwbaar metabolieten van het kynureninepad om inzicht te geven in cognitieve en slaapstoornissen.

Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten

Meer video's verkennen