Name: Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Leer endogeen eiwit-tagging in menselijke iPSC's met CRISPR/Cas9 en fluorescentie-tags. Deze methode maakt het bestuderen van proteïnedynamiek onder endogene regulatie mogelijk met hoge knock-in efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Daphne Dambournet voor vele inzichtelijke discussies en advies over gene bewerken, Thao ter illustratie, Angelique Nelson voor de kritische lezing van het manuscript, en Andrew Tucker voor het genereren van de mEGFP-gelabeld triplex B1 cellijn. Wij willen erkennen van de stamcellen en Gene Editing en Assay ontwikkelteams bij het Allen-Instituut voor de wetenschap van de cel voor hun bijdragen aan de gene bewerken en kwaliteitscontrole proces. De WTC-lijn die we gebruikt voor het maken van onze gen-bewerkt cellijn werd verstrekt door het Bruce R. Conklin Laboratory van de Gladstone instituten en UCSF. Wij danken het Allen Instituut voor cel wetenschap oprichter, Paul G. Allen, voor zijn visie, aanmoediging en steun.

<ol><li>Wood, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+across+species+using+ZFNs+and+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs.</a> Science. 333 (6040), 307(2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+endogenous+loci+for+live-cell+fluorescence+imaging+and+molecule+counting+using+ZFNs%2C+TALENs%2C+and+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9.</a> Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).</li>
<li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Sci Rep. 5, 9592(2015).</li>
<li>Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Approaches%2C+Pitfalls%2C+and+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Doyon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+fluorescently+labeled%2C+endogenous+RNA+Polymerase+II+in+living+cells+with+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Sci Rep. 6, 35949(2016).</li>
<li>White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+nanoBRET+and+CRISPR%2FCas9+to+monitor+proximity+to+a+genome-edited+protein+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time.</a> Sci Rep. 7 (1), 3187(2017).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gene+tagging+using+CRISPR%2FCas9+in+human+stem+cells+to+illuminate+cell+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization.</a> Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Young, J. E., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+in+a+dish%3A+promises+and+challenges+of+human+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models.</a> Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gene%2C+NCBI-+National+Center+for+Biotechnology+Information%22">Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information</a>. , U.S. National Library of Medicine. 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gene%2C+NCBI-+National+Center+for+Biotechnology+Information%22">Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information</a>. , UCSC Genome Browser. 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Allen+Cell+Methods%3A+Single+cell+passaging+human+iPS+cells%22">Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc">https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Allen+Cell+Explorer%22">Allen Cell Explorer</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.allencell.org/">http://www.allencell.org/</a> (2017).</li>
<li>Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Purified+CasRNPs+for+Efficacious+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing.</a> Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Michael+Davidson+Fluorescent+Protein+Collection%22">Michael Davidson Fluorescent Protein Collection</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/</a> (2017).</li>
<li>Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+genome+editing%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic genome editing: prospects and challenges.</a> Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).</li>
<li>Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+genome+editing+with+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Hamostaseologie%22%5BJournal%5D)">Therapeutic genome editing with engineered nucleases.</a> Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).</li>
<li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).</li>
<li>Orlando, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-finger+nuclease-driven+targeted+integration+into+mammalian+genomes+using+donors+with+limited+chromosomal+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), e152(2010).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. 121-122, 9-15 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22+CRISPOR+V4.3%22"> CRISPOR V4.3</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://crispor.tefor.net/">http://crispor.tefor.net/</a> (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+non-canonical+PAMs+for+CRISPR%2FCas9-mediated+DNA+cleavage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells.</a> Sci Rep. 4, 5405(2014).</li>
<li>Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+linkers%3A+property%2C+design+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Fusion protein linkers: property, design and functionality.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Baker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Genetic+Mosaicism+in+Cultures+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die hier gepresenteerd voor het genereren van endogeen geregeld fluorescent proteïne fusies in hiPSCs is een veelzijdige en krachtige aanpak voor het genereren van gene bewerkt cellijnen met toepassingen variërend van levende cellen imaging tot verschillende functionele studies en " ziekte in een schotel"modellen met behulp van de patiënt-afgeleide hiPSC lijnen13,14,15. Terwijl deze methode heeft gebruikt om grote FP tags aan de N - of C-terminus van endogene eiwitten, zou het kunnen worden gebruikt om andere tags of kleine genetische veranderingen kennismaken met model of juiste ziekte-veroorzakende mutaties22,23 . Voor kleinere inzetstukken, de grootte van de homologie-arm kan worden verminderd, maar de algemene benadering voor het bewerken van gepresenteerd in deze methode gelden nog steeds24,25. Terwijl het gebruik van hiPSCs sterk aangemoedigd voor hun enorme nut, met zorgvuldige optimalisatie wordt, kan dit protocol worden aangepast om het bewerken van het genoom van andere zoogdieren cellijnen.
Bij het bepalen van een gen van belang voor FP tagging, transcript overvloed schat (van microarray of RNA-Seq gegevens) zijn een goed uitgangspunt voor de beoordeling of een gen of isovorm van belang is uitgedrukt, hoewel transcript niveaus niet altijd met correleren doen eiwitniveaus. De hier beschreven FACS-verrijking-strategie het beste werkt voor genen die minstens matig goed worden uitgedrukt in het celtype van belang. Deze strategie ook succesvol geweest bij de keuze voor fusies die punctate en/of discrete lokalisatie patronen zoals centrin, desmoplakin en paxillin laten zien waar het signaal naar verhouding van de achtergrond is zeer laag12,19. Genen die zijn niet sterk uitgedrukt of alleen worden uitgedrukt in afgeleide celtypes mogelijk aanvullende selectie strategieën.
Het uitgangspunt voor crRNA en donor sjabloon plasmide ontwerpen gebruikt in menselijke cellijnen moet de referentie van de menselijke genoom (GRCh38). Omdat het genoom van verschillende cellijnen kunnen variëren binnen dezelfde soort, en CRISPR/Cas9 volgorde-specifieke, is het zeer nuttig om te identificeren cel lijn-specifieke varianten (één nucleotidepolymorfisme of ingevoegde/verwijderde (microdeleties)) dat verschilt van het genoom van de verwijzing en deze in het ontwerp opnemen. Dit zorgt ervoor dat crRNAs verenigbaar met het genoom van de host zijn zal en dat de donor sjabloon plasmide homologie armen cellijn specifieke varianten zal behouden. Een voorgestelde strategie is homozygoot varianten geïntegreerd in crRNAs en donor sjabloon plasmide homologie wapens tijdens het ontwerpproces. Opnemen van heterozygoot varianten is optioneel. De specifieke reagentia gebruikt voor grote knock-in experimenten en andere belangrijke overwegingen voor dit protocol worden hieronder besproken.
Cas9 eiwit
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van Cas9 eiwit is dat de invoering van de Cas9 en gRNA als een complexe RNP is aangetoond dat resulteren in een beperkte duur van de nuclease activiteit t.o.v. plasmide-gebaseerde benaderingen waar de uitdrukking van de Cas9 en de gRNA kan blijven voor dagen en leiden bij grotere op - en af-streefpad activiteit26,27. Een bijkomend voordeel van het gebruik van Cas9 eiwit is dat het gemakkelijk verkrijgbaar zijn voor eenmaal in de cellen klieven. Dit staat in contrast met de meer conventionele methodes van het gebruik van Cas9 mRNA of Cas9/gRNA plasmide die vereisen transcriptie, vertaling en eiwit verwerking26,28. Wildtype S. pyogenes Cas9 eiwit is nu beschikbaar via vele commerciële bronnen.
Gids RNA
Er zijn vele algemeen beschikbare hulpmiddelen voor het vinden van de doelstellingen van de crRNA in de buurt van de gewenste FP invoeging site met nul of paar voorspelde af-doelen in de host genoom29,30,31,32. Efficiëntie in HDR en de precisie van de HDR resultaten lopen sterk uiteen tussen crRNA doelen gebruikt op een bepaald locus12. Om deze reden, het testen van verschillende crRNAs (2-4, en bij voorkeur binnen 50 bp van de gewenste invoegpositie site) per locus wordt aanbevolen, omdat dit de kans op een succesvolle bewerken experiment verhogen kan. Huidige mogelijkheden voor het leveren van gRNA zijn synthetische 2-delige crRNA en tracrRNA, synthetische één gRNAs (sgRNAs), in vitro sgRNAs, of het leveren van een plasmide naar de cellen die uiting geven aan de sgRNA van de promotor van een U6 getranscribeerd. Dit protocol is niet geoptimaliseerd voor hoge decollete activiteit. Ongewijzigde 2-delige crRNA en tracrRNA (Zie Tabel van materialen) werden gebruikt met als doel het genereren van mono-allèlique FP-gelabeld cellijnen terwijl veroorzaakt de minste potentiële verstoring naar de cellen.
Donor sjabloon plasmide
Omdat sommige van de homologie arm reeks voorwaarde bij de donor sjabloon plasmide zullen worden opgenomen in het genoom van de gastheer tijdens het evenement HDR, moeten puntmutaties naar de crRNA erkenning sites worden ingevoerd om te voorkomen dat verdere decolleté door Cas9 na HDR. Vaak is de eenvoudigste storend verandering om muteren van de PAM-reeks. Omdat sommige niet-canonieke PAM sequenties kunnen nog steeds worden herkend door wild type S. pyogenes Cas9, is het beste gebruik van NGG, NAG of NGA33te vermijden. Wanneer muteert de homologie-arm, te voorkomen dat niet-synoniem mutaties en de invoering van zeldzame codonen. Als een synoniem wijziging in de volgorde van de PAM niet mogelijk is, overwegen drie synoniem puntmutaties in de zaad-regio (10 bp proximale aan PAM) van de crRNA binding site. Uiterste zorg moet worden genomen bij het maken van deze veranderingen in de 5ʹ niet-vertaalde regio (UTR), aangezien deze regio's kunnen belangrijke regulerende sequenties bevatten. Raadplegen van een genetische behoud database zoals de UCSC Genome Browser vergelijkende genomica tracks kunnen begeleiden in deze gevallen, zoals wijzigingen in grondslagen niet-geconserveerd kunnen beter worden getolereerd, dan verandert in zeer geconserveerde honken17. Soms is de loutere invoeging van de FP opeenvolging genoeg te verstoren de crRNA binding site (zoals in Figuur 1); echter, de nieuw toegevoegde volgorde moet worden gecontroleerd op de persistentie van crRNA-bindende en PAM-sequenties.
Aminozuur linkers tussen de FP en de inheemse proteïne worden aanbevolen voor de instandhouding van de functie van de fusie-eiwit34. Vaak is een aminozuur linker kan worden gekozen voor de specifieke lading of de grootte. Als een cDNA fusie met een ontwerp dat vergelijkbaar is met de gerichte endogene is fusieproteïne goed onderzocht, dat dezelfde linker kan gebruikt worden voor de CRISPR/Cas9 knock-in experiment12,19. Als deze informatie niet beschikbaar is, een korte linker zoals GTSGGS ook al met succes12gebruikt. Andere studies hebben aangetoond dat succes met een opeenvolging van de generieke kleine 3-amino acid linker voor allerlei doelen35.
Transfectie en FACS verrijking
Vele verkrijgbare transfectie reagentia zijn geformuleerd voor levering van bepaalde soorten moleculen aan cellen, overwegende dat een electroporation systeem kan worden gebruikt voor het leveren van reagentia met een breed scala van samenstelling, grootte en kosten. Naast het feit dat een gemeenschappelijke methode van de transfectie voor hard-aan-transfect cellen zoals hiPSCs, draagt electroporation ook het voordeel van het leveren van alle drie de componenten voor CRISPR/Cas9-gemedieerde FP knock-in, zoals wordt beschreven in deze methode. Electroporation bleek te produceren de beste resultaten in vergelijking met andere verkrijgbare reagentia bij de ontwikkeling van deze methode (gegevens niet worden weergegeven), en is ook door anderen gebruikt voor RNP levering26,28,36 .
Wanneer dit protocol wordt gebruikt voor het bewerken van hiPSCs, moet speciale zorg worden getroffen om zachte behandeling van de cellen vóór en na het gen proces voor de overleving van de cel van de optimale en minimale spontane differentiatie bewerken. In het bijzonder de FACS verrijking methoden moeten worden aangepast om stamcellen te sorteren met behulp van de grootste mondstuk mogelijk (130 µm), een laag debiet (≤ 24 µL/min), conserveermiddel-vrije schede vloeistof (zoals zoutoplossing, Zie Tabel of Materials), en de lage monster Druk (10 psi). In plaats van één cel sorteren, wat in suboptimaal levensvatbaarheid in de cellen van de stam resulteert, de hiPSCs FACS verrijkte gesorteerd in bulk en uitgebreid als een populatie te optimaliseren cel levensvatbaarheid en stamcel integriteit. Eencellige sorteren kan evenwel geschikt is voor minder gevoelige celtypes. Ter bevordering van de overleving van de cel, cellen geretourneerd naar cultuur niet langer dan één uur na de oogst voor de FACS verrijking en bewaard bij kamertemperatuur gedurende het sorteren proces. Voor sommige celtypen, kan overleving van de cel ook verbeterd worden door drachtige cellen op ijs (4° C) tijdens het sorteren proces.
De uitbreiding van de bulk van de FP-positieve cellen biedt een kans om de populatie evalueren door imaging analyse voor fusion eiwit lokalisatie voorafgaand aan klonale krommen. Terwijl de resulterende verrijkt bevolking van cellen voldoende voor sommige studies zijn kan, tonen deze populaties vaak FP signaal van wisselende intensiteit. De geïsoleerde klonale lijnen hebben uniforme signaal (Figuur 3), waardoor ze geschikter voor functionele experimenten12.
Cel klonale lijn generatie
Tijdens het bewerken en klonale lijn generatie proces is het belangrijk om te controleren van de morfologie van de cel. hiPSC kolonies gegroeid in feeder-vrij voorwaarden moeten vertonen, gladde randen en een zelfs, goed verpakt centrum12,18,19. Gedifferentieerde cellen moeten worden geobserveerd in minder dan 5% van de cultuur. Bij het afhalen van afzonderlijke kolonies, kies degenen die goede morfologie van de tentoonstelling. Tijdens de 96-wells-plaat passaging gebeurtenissen, Controleer klonen voor morfologie en staken die begroeid zijn als dit kan tot differentiatie leiden dan een indicatie van genetische instabiliteit.
Generatie van klonen cellijnen zorgt voor genetische bevestiging van precieze editing, dat is belangrijk omdat Cas9-geïnduceerde dubbele streng breekt in het genoom zijn vaak gerepareerd vaag ondanks de opname van de tag op de gewenste plaats. Eerder beschreven PCR-gebaseerde testen is gebleken dat cumulatief over tien unieke genomic loci vele (45%) van de FP-uiten klonen leed van donor plasmide ruggengraat integratie bij de gerichte locus of (zelden) willekeurig in de genoom-12. Bovendien, 23% van GFP-positieve klonen (n = 177) over tien unieke loci bleken haven mutaties op of in de buurt van de verwachte crRNA snijden site in het niet-gelabelde allel, meest waarschijnlijk te wijten aan NHEJ12. Deze genetische analyse van vele klonen lijnen (~ 100 klonen/bewerken) onderstreept het belang van genetische validatie is niet mogelijk in een celpopulatie aangezien FP-expressie en verwachte fusion eiwit localisatie alleen bieden geen garantie voor precieze bewerken12 . Bovendien, kunnen niet deze PCR-gebaseerde testen worden uitgevoerd op een verrijkte bevolking van cellen met enige zekerheid, die rechtvaardigen de noodzaak voor klonale lijn generatie voordat zinvolle analyse kan worden voltooid. Genetische bevestiging van de ingevoegde FP-tag en verificatie van de genetische integriteit van het onbewerkte allel (in een mono-allèlique bewerkte kloon) zijn beide noodzakelijk zijn om de precieze bewerken op de gerichte locus buiten de labelexpressie.
Een laag tarief van bi-allèlique bewerkingen en gebrek aan af-target mutaties (zoals getest door Sanger en exome sequentiebepaling) geconstateerd tot nu toe met behulp van deze methode (niet-gepubliceerde gegevens)12. Dit is in overeenstemming met eerdere studies met een beschrijving van het gebruik van korte durende RNP voor CRISPR/Cas9 experimenten26,27. Het ontbreken van klonen cellijnen met bi-allèlique bewerkingen mogelijk ook specifieke locus of gelabeld als gevolg van het onvermogen van de cel te tolereren twee exemplaren van een essentieel eiwit zoals voorgesteld eerder gepubliceerde experimenten waar vermeende bi-allèlique bewerkte cellen waren waargenomen voor een locus (LMNB1), maar niet een andere (TUBA1B)12. Bi-allèlique volledig gevalideerde klonale cellijnen zijn gegenereerd met behulp van deze methode aan label ST6 bèta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), en lid van het RAB5A RAS oncogen familie (RAB5A) met mEGFP19.
Na bevestiging van precisie voor de edit in het genoom, er zijn een verscheidenheid van kwaliteitscontrole tests die kunnen worden gebruikt om verder te karakteriseren de klonale lijn en klonen die voldoen aan alle cel van de stam, genomic, identificeren en cel biologische criteria voor gebruik in de toekomst studies . Cel biologische en functionele testen kunnen worden gebruikt ter bevestiging van de juiste expressie, lokalisatie en functie van de fusie-eiwit12. De vergelijking met onbewerkte ouderlijk zal helpen evalueren de invloed van het bewerkingsproces op lokalisatie, dynamiek en functie. Andere testen bepalen, zoals analyse van de groei en tests voor genomic stabiliteit kunnen ook helpen of het gecodeerde eiwit storende naar de cel. Bij het gebruik van hiPSC in dit protocol, evaluatie van pluripotent markeringen en differentiatie mogelijkheden kan van doorslaggevend belang bij het bepalen van een kloon die is waardevol voor stroomafwaarts bestudeert12. Omdat cultuur van uitgebreid hiPSC heeft aangetoond dat leiden tot genetische instabiliteit, toezicht op de groei en karyotype van klonen cellijnen is ook belangrijk12,37. Echter bedoeld de finale gebruik van de bewerkte cellen zal uiteindelijk beslissen over het niveau en de breedte van de kwaliteitscontrole analyse en zijn afhankelijk van de toepassing.

Het gebruik van genoom-bewerken strategieën, met name CRISPR/Cas9, om cellulaire processen te bestuderen is steeds meer en meer toegankelijk en waardevolle1,2,3,4,5, 6 , 7. een van de vele toepassingen van CRISPR/Cas9 is de invoering (via homologie geregisseerd reparatie (HDR)) van grote exogene sequenties zoals GFP in specifieke genomic loci dat dan als verslaggevers voor de activiteit van een gen of eiwit product8 dienen . Deze techniek kan worden gebruikt om een opeenvolging van fluorescerende eiwit toevoegen aan een endogene open leesraam waar de resulterende endogeen gereglementeerde fusieproteïne kan worden gebruikt om te visualiseren de subcellular localisatie en de dynamiek van de proteïne van belang5 ,6,9,10,11. Terwijl endogeen tagged eiwitten vele voordelen ten opzichte van overexpressie systemen bieden, is invoegen van grote sequenties in het menselijk genoom een inefficiënt proces meestal eist een selectie of verrijking strategie te verkrijgen van een bevolking van cellen die kunnen worden gemakkelijk bestudeerde5,12.
Dit protocol beschrijft de invoeging van een DNA-sequentie een fluorescente proteïne (FP)-codering in een gewenste genomic locus. Het protocol bevat ontwerp en levering van de donor sjabloon plasmide, en de ribonucleoprotein (RNP) complexe (wild type S. pyogenes Cas9 eiwit gecombineerd met synthetische CRISPR RNA (crRNA) en activeren van trans crRNA (tracrRNA)). Ook beschreven is een verrijking van het vermeende bewerkte cellen via fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) en het klonen cel proces voor de generatie van de lijn. Tot op heden is deze methode gebruikt voor het genereren van hiPSC lijnen met monoallelic of (zelden) bi-allèlique groen fluorescente proteïne (GFP) tags labeling van vijfentwintig eiwitten vertegenwoordigen belangrijke cellulaire structuren. De resulterende bewerkte cellen van deze inspanningen hebben bevestigd te hebben van het verwachte genetische inbrengen, een correct lokaliseren fusieproteïne express en handhaven pluripotent en een stabiele karyotype12 (en niet-gepubliceerde gegevens). Deze methode is ook gebruikt voor het genereren van meerdere andere single en dual (twee verschillende eiwitten gelabeld in dezelfde cel) bewerkt populaties van hiPSCs (niet-gepubliceerde gegevens).
Menselijke iPSCs afgeleid van een gezonde donor werden gekozen voor deze inspanningen genoom-bewerken omdat, in tegenstelling tot veel conventionele cellijnen, ze zijn diploïde, karyotypisch stabiele, niet-getransformeerd en proliferatieve. Deze eigenschappen bieden een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de fundamentele celbiologie en modellering van de ziekte. Bovendien, het potentieel van de differentiatie van hiPSCs biedt de mogelijkheid te bestuderen van meerdere ontwikkelingsstadia parallel over verschillende geslachten en celtypes isogene cuvetten met inbegrip van organoids, weefsels en "ziekte in een schotel" modellen13 ,14,15. Terwijl dit protocol werd ontwikkeld voor hiPSCs (WTC-lijn), is het mogelijk dat het informatief voor de ontwikkeling van protocollen met behulp van andere zoogdieren cellijnen.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, of vergelijkbaar</td><td></td><td>bioinformatics software voor in silico donor plasmide ontwerp</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, of vergelijkbaar</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, of vergelijkbaar</td><td>ThermoFisher Scientific, of vergelijkbaar</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten (1000 &micro;L, 200 &micro;L, 20 &micro;L, 10 &micro;L, 2 &micro;L)</td><td>Rainin, of vergelijkbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettips (1000 &micro;L, 200 &micro;L, 20 &micro;L)</td><td>Rainin, of vergelijkbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals Pipet (200 &micro;L)</td><td>Rainin, of vergelijkbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar, of vergelijkbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND 8-kanaals Manifold voor Quiksip, Autoklaveerbaar</td><td>Millipore Sigma, of vergelijkbaar</td><td>BR704526-1EA</td><td>gebruik met niet-gefilterde pipettips, zoals Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, hieronder</td></tr><tr><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, of vergelijkbaar</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipetcontroller</td><td>Drummond, of vergelijkbaar</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef Pasteur Pipetten</td><td>VWR, of vergelijkbaar</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II, Type A2 Biologische Veiligheidskabinet</td><td>CELLGARD, of vergelijkbaar</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot getest vóór gebruik met hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-fenol rood)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>koud, voor het verdunnen van Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>aanbevolen groeimedium voor WTC hiPSC lijn</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC lijn</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>de hiPSC lijn gebruikt in dit protocol is verkrijgbaar via Coriell</td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-wells Celkweekschaal</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Fosfaat Gebufferdzoutvrij (DPBS) zonder calcium, zonder magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polystyreen kegelvormige</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetisch crRNA, ongewijzigd (aangepaste sequentie)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetisch tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS gezuiverd eiwit, 40 &micro;M</td><td>University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aangepaste donor plasmide (PriorityGENE)</td><td>Genewiz</td><td></td><td>donor insert ontwerp werd gesynthetiseerd en gekloond in pUC57 backbone door Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfectiesysteem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfectiesysteem, 100 &micro;L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyreen Ronde bodembuis met Celzeefdeksel</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Hooghelderheid Polypropyleen Kegelvormige buis</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versie 10.2</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Bloedbankzoutvrij</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>gebruikt als conserveermiddelvrije FACS Buffer</td></tr><tr><td>Olympus SZX7 Stereo Microscoop, of vergelijkbaar</td><td>Olympus, of vergelijkbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal, 96-wells</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 wells Celkweekschaal, V-Bodem</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>gebruikt als cryopreserveringsbuffer voor cellen in 96-wells schaal formaat</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24 wells Celkweekschaal</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

endogene eiwit tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Een protocol wordt voor het genereren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) dat uitdrukkelijke endogene eiwitten gesmolten om in-frame N - of C-terminaal fluorescerende labels gepresenteerd. De prokaryote CRISPR/Cas9-systeem (geclusterde regelmatig interspaced kort palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9) kan worden gebruikt om grote exogene opeenvolgingen in genomic loci via homologie geregisseerd reparatie (HDR). Om te bereiken de gewenste knock-in, dit protocol maakt gebruik van de ribonucleoprotein (RNP)-gebaseerde aanpak waar de wild type Streptococcus pyogenes Cas9 eiwit, synthetische 2-delige gids RNA (gRNA) en een donor sjabloon plasmide die aan de cellen via zijn geleverd Electroporation. Vermoedelijk bewerkte cellen uiten de fluorescently tagged eiwitten zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Klonen lijnen worden vervolgens gegenereerd en kunnen worden geanalyseerd voor precieze editing resultaten. Door de invoering van de fluorescerende code aan de genomic locus van een gen van belang, kan de resulterende subcellular localisatie en de dynamiek van het fusie-eiwit worden bestudeerd onder endogene regelgevende controle, een belangrijke verbetering ten opzichte van conventionele overexpressie systemen. Het gebruik van hiPSCs als een modelsysteem voor gene tagging biedt de mogelijkheid te bestuderen van de tagged eiwitten in diploïde, nontransformed cellen. Aangezien hiPSCs kunnen worden onderscheiden in meerdere celtypen, biedt deze aanpak de mogelijkheid om te maken en studeren tagged eiwitten in een verscheidenheid van isogene cellulaire contexten.

Het doel van dit experiment moest zekering mEGFP (monomeer verbeterde GFP) aan de nucleaire lamin B1 eiwit door de invoering van de volgorde van de mEGFP aan het einde van de 5ʹ van het LMNB1 gen (N-terminus van het eiwit). Een linker (aminozuur volgorde SGLRSRAQAS) werd gekozen op basis van eerdere cDNA constructies uit de Michael Davidson Fluorescent proteïne collectie21. Omdat de regio bindende crRNA in het plasmide sjabloon donor voor elke kandidaat-crRNA werd verstoord na het inbrengen in silico van mEGFP en de volgorde van de linker, geen puntmutaties moest worden gemaakt te verstoren potentiële crRNA erkenning en decolleté door Cas9 van de donor sequentie (Figuur 1). De volgorde van de donor bevatte 1 kb homologie wapens flankerende beide uiteinden van de mEGFP-linker-reeks. De resulterende 2,734 bp van DNA werd gekloond in een pUC57-backbone, volgorde gecontroleerd, en de resulterende donor sjabloon plasmide werd gezuiverd met behulp van een endotoxine-gratis maxi prep. De donor sjabloon plasmide en RNP complexe transfected waren, vermoedelijk bewerkte cellen werden verrijkt en de lokalisatie van de mEGFP-nucleaire lamin B1 fusieproteïne werd bevestigd door fluorescentie microscopie (Figuur 2). Alleen de resultaten van de transfectie crRNA1 zijn hier beschreven, hoewel beide reeksen crRNA geproduceerd vermeende bewerkte populaties12.
Vergeleken met de negatieve controle, die geen gRNA, Cas9 eiwit of donor sjabloon plasmide in de electroporation reactie (alleen buffer), de crRNA1 van de LMNB1 transfected cellen opgenomen 0,95% mEGFP-positieve cellen vertegenwoordigt de vermeende bewerkte mEGFP-nucleaire triplex B1 bevolking (Figuur 3a). Dit resultaat werd binnen het bereik van knock-in efficiencyverbeteringen waargenomen in vele genomic loci met behulp van deze methode als de eerder gemelde12.
De mEGFP-positieve cellen waren geïsoleerd door FACS en beeld door levende microscopie te bevestigen verwachte lokalisatie van de mEGFP-nucleaire lamin B1 fusieproteïne aan de nucleaire envelop. Na FACS-verrijking waren ongeveer 90% van de gesorteerde cellen uit de LMNB1 crRNA1 bevolking mEGFP-positieve (zoals bepaald door microscopie), wat suggereert dat sommige mEGFP-negatieve cellen gezuiverd samen met het GFP-positieve cellen tijdens de sorteer procedure. Dit was een aanvaardbaar niveau van verrijking die toegestaan voor picken van 96 klonen die vervolgens genetisch gescreend kan worden voor het bewerken van de succesvolle. In het algemeen een cut-off voor succesvolle verrijking is 50% GFP positief.
De meerderheid van de bevolking van de gesorteerde cel weergegeven fluorescentie bij de nucleaire envelop (nucleaire perifirie) in nondividing cellen en een uitgebreide nucleaire lamina binnen het cytoplasma tijdens de mitose bieden het vertrouwen in de juiste genomic bewerken op de LMNB1 Locus. De verrijkte bevolking bevatte cellen met ofwel helder of gedimd signaal. Dit verschil in de signaalsterkte kan duiden op een combinatie van juiste en onjuiste resultaten en hoogtepunten het nut van het genereren van een genetisch gevalideerde klonale lijn voor verdere studies (zie discussie) bewerken (Figuur 3b)12. Na klonale lijn generatie, gevalideerd genetisch cellen toonde uniforme GFP intensiteit in microscopie experimenten (Figuur 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figuur 1 . Strategie voor N-terminus GFP tagging van LMNB1 gen ontwerp. De tag GFP werd ontworpen voor N-terminal 5ʹ van het inbrengen van de eerste exon van LMNB1 gelegen op chromosoom 5. Zowel de 5ʹ als de 3ʹ-homologie wapens zijn 1 kb per stuk en meet tussen de start codon (ATG) en de tweede codon (homologie arms slechts gedeeltelijk weergegeven in figuur). Twee kandidaat-crRNAs werden ontworpen om het Cas9 te klieven zo dicht mogelijk bij de beoogde invoeging site mogelijk, terwijl nog steeds uniek in het genoom te begeleiden. Volgorde voor mEGFP en een aminozuur linker waren ingevoegde net 3ʹ van de start codon (mEGFP en linker volgorde niet op schaal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figuur 2 . Werkstroom voor het produceren van endogeen gelabeld hiPSC klonen lijnen. Transfectie componenten, met inbegrip van het complex van de Cas9/crRNA/tracrRNA RNP (weergegeven als een rode Cas9 eiwit met gouden crRNA en paarse tracrRNA), de donor sjabloon plasmide met de homologie armen (HAs, getoond in goud), en FP + linker sequentie (afgebeeld in groen), werden electroporated. Na 4 dagen, werden de FP-positieve vermeende bewerkt cellen verrijkt door FACS uitgebreid als een populatie door alle gesorteerde cellen zaaien in een enkel putje van een 96-wells-plaat (~ 1000 cellen) en vervolgens uitgebreid in cultuur tot een werkende bevolking van ettelijke miljoenen cellen kunnen worden bepaald als de "verrijkte bevolking" (Zie Protocol stap 3.8). De opbrengst van de FP-positieve cellen verschilt per experiment als gevolg van variabele tarieven van HDR12; een succesvolle verrijking kan omvatten ~ 300-5.000 cellen na de transfectie van ongeveer 1.6 x 106 heupen cellen. Imaging voorstudies bevestigd het signaal en de lokalisatie van de fusie-eiwit in de verrijkte bevolking. Kolonies werden handmatig geplukt in een 96-wells-plaat voor uitbreiding en cryopreservatie. Verdere genomic kwaliteitscontrole screening met druppel digitale PCR (ddPCR) en andere PCR-gebaseerde testen dan gewend was goed bewerkte klonen, als eerder beschreven12identificeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figuur 3 . Verrijking van vermeende bewerkte cel populaties. (A) stroom cytometry percelen van de LMNB1 cellen vier dagen na transfectie bewerkt. De y-as weergegeven GFP intensiteit en de x-as weergegeven voorwaartse scatter. Sorteer poorten waren ingesteld op basis van het besturingselement alleen-buffer. Aangezien hiPSCs gevoelig voor verstoring zijn, live/dode vlek werd weggelaten en een zeer conservatieve FSC/SSC-gate in plaats daarvan werd gebruikt. (B) na verrijking, de bevolking van LMNB1 Cr1 bewerkt cellen toonde ~ 90% van de cellen met het GFP lokaliseren aan de nucleaire envelop (verwachte LMNB1 lokalisatie). De bevolking bevatte cellen van verschillende GFP intensiteit evenals sommige cellen GFP-negatief. Schaal bars zijn 10 micron. (C) na klonale lijn generatie toonden de cellen een uniforme GFP-intensiteit, met enkele celcyclus afhankelijke verschillen. De bar van de schaal is 20 micron.

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Het doel van dit protocol is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren die endogene fusie-eiwitten tot expressie brengen die gefuseerd zijn met endframe N of C-terminaal fluorescente tags. Om de gewenste knock-in te bereiken, gebruiken we het CRISPR-Cas9 systeem en een ribonucleoproteïne-gebaseerde aanpak met behulp van wildtype S.pyogenes Cas9-eiwit en een synthetisch tweedelig CRSPR RNA en tracrRNA. Dit RNP wordt samen met de gewenste fluorescente tag-sequentie als een donorplasmide via elektroporatie geleverd.Putatief bewerkte cellen die het gefluorescereerd gelabelde eiwit tot expressie brengen, worden verrijkt door FACS. Clonale lijnen worden vervolgens gegenereerd voor analyse van nauwkeurige bewerkingsresultaten. Dit genbewerkingsprotocol heeft veel voordelen ten opzichte van traditionele overexpressieconstructen.Omdat een fluorescente tag in het genoom wordt geïntroduceerd, kunnen de subcellulaire lokalisatie en dynamica van het resulterende fusie-eiwit worden bestudeerd onder endogene regulerende controle. Hier gebruiken we geïnduceerde pluripotente stamcellen als modelsysteem omdat het ons toestaat om de gelabelde eiwitten in diploïde niet-getransformeerde cellen te bestuderen. Bovendien, omdat de cellen kunnen worden gedifferentieerd in meerdere celtypen, zoals de hier getoonde cardiomyocytcellen, biedt deze aanpak de mogelijkheid om gelabelde eiwitten te creëren en te bestuderen in een verscheidenheid van isogene cellulaire contexten.Met zorgvuldige optimalisatie zou dit protocol echter kunnen worden aangepast voor het bewerken van de genomen van andere zoogdierceltypen. Hoi, ik ben Amanda Haupt, ik maak deel uit van het team voor stamcellen en genbewerking hier bij het Allen Institute for Cell Science. Vandaag hebben we deze aanpak gebruikt om meer dan 35 verschillende cellijnen te genereren die endogene fusie-eiwitten tot expressie brengen.We gebruiken deze om een breed scala aan unieke cellulaire structuren en processen te bestuderen. Deze aanpak is tot nu toe voor 95%van de loci die onze groep heeft geprobeerd succesvol geweest. Deze methode zal vooral nuttig zijn voor celbiologen die geïnteresseerd zijn in een beter begrip van de dynamica van een eiwit in levende cellen.Maar zodra de bewerkte clonale lijnen zijn gegenereerd, zijn de mogelijkheden voor studie eindeloos. Met deze methode zijn we in staat om consistent klonen te identificeren die monoallelische fluorescente eiwittags hebben zonder enige andere verstoringen in de genomische sequentie. We zijn ook af en toe in staat om biallelisch bewerkte klonen te verkrijgen.In deze video zullen we enkele van de belangrijkste stappen in het transfecteren, FACS verrijken en isoleren van clonale cellijnen die endogene gereguleerd fluorescente fusie-eiwitten tot expressie brengen laten zien. Behandel de hiPSC's twee tot drie uur vóór transfectie met tien micromolar ROCK-remmer gesupplementeerd in groeimedia. Dit zal de overleving na elektroporatie bevorderen.Cellen zullen een stekelige uiterlijk hebben na deze behandeling. Cellen moeten worden verwijderd van de weefselsluitingsplaat met behulp van een enkelcellig dissociatiegebied en de celluspensie wordt verzameld in een conische buis vóór transfectie. Bereid een aliquot van 1,84 keer 10 tot de zes cellen voor voor elke experimentele conditie die getransfecteerd moet worden.Bereid ribonucleoproteïnecomplexbuizen voor elke transfectie door 2,88 microliters van 10 micromolar geleid RNA en 2,88 microliters van 10 micromolar Cas9 toe te voegen aan een 1,5 mil buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende minimaal 10 minuten, maximaal een uur. Pellet het celaliquot dat in de vorige stap is bereid bij 211 keer G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.Aspergeer vervolgens het supernatant en draai snel het cellenpellet in 220 microliters elektroporeringsbuffer. Voeg 220 microliters van hervat cellen toe aan de eerder bereide 1,5 mil RNP complexbuis. Voeg 4,6 microliters van één microgram per microliter donorplasmide toe.Gebruik de nucleofectietip en pipet om de twee inhoud twee tot drie keer te mengen en breng vervolgens honderd microliters van de suspensie over naar het voorbereide elektroporeringsapparaat. Vermijd het introduceren van luchtbellen in de tip. Breng dertienhonderd volt aan gedurende één puls van dertig milliseconden.Breng de suspensie voorzichtig over in een voorbereide zeswelplaat met een draaiende beweging. Verspreid de cellen door de plaat voorzichtig heen en weer en van voor naar achter te bewegen. Na herhaling voor alle experimentele omstandigheden en controles, incubeer getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 24 uur, waarbij het medium wordt vervangen door regulier groeimedium zonder ROCK-remmer bij 24 uur.Ga vervolgens door met het voeden van de hiPSC's elke 24 uur gedurende 72 tot 96 uur terwijl hun confluency wordt gemonitord. Wanneer hiPSC's 68 tot 80%confluency bereiken, gaat u door naar de FACS-verrijking. Twee tot drie uur vóór transfectie behandelen hiPSC's met 10 micromolar ROCK-remmer gesupplementeerd in het groeimedium om de overleving na FACS-verrijking te bevorderen.Om cellen te sorteren, verwijder ze van de plaat met behulp van het enkelcellig dissociatiereagens en filter de hiPSC-suspensie vervolgens door een 35 micron meshfilter in polystyreen ronde bodembuizen. Sorteer cellen met behulp van voorwaartse verstrooiing en zijdelingse verstrooiing, inclusief: hoogte versus breedte, triplets puin en doublets. Gebruik alleen live buffercontrolecellen om de FP-positieve poort in te stellen zodat minder dan 1,1%van de buffer alleen cellen binnen de poort valt.Wanneer stamcellen worden gesorteerd, pas de instrumentinstellingen aan om de overleving van cellen te bevorderen zoals aanbevolen in de discussiesectie. Typische knock-in-efficiënties zoals bepaald door het percentage FP-positieve cellen door FACS kunnen variëren van 0,1%tot 5%Sorteer cellen in een 1,5 tot 15 mil polypropyleenbuis bevattende 0,5 tot 2 mils van kamertemperatuur groeimedia gesupplementeerd met 10 micromolar ROCK-remmer. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 211

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.

CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende reporters en celsortering om knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen. Twee plasmiden worden gebruikt voor deze vereenvoudigde knock-in experimenten, namelijk een CRISPR/Cas9- en DsRed2-tot expressie brengend plasmide en een homoloog recombinatiedonorplasmide dat EBFP2 tot expressie brengt, dat permanent is geïntegreerd op de Rosa26-locus in immuuncellen.

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.

Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer endogeen eiwit-tagging in menselijke iPSC's met CRISPR/Cas9 en fluorescentie-tags. Deze methode maakt het bestuderen van proteïnedynamiek onder endogene regulatie mogelijk met hoge knock-in efficiëntie.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Meer video's verkennen