Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Het doel van dit protocol is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren die endogene fusie-eiwitten tot expressie brengen die gefuseerd zijn met endframe N of C-terminaal fluorescente tags. Om de gewenste knock-in te bereiken, gebruiken we het CRISPR-Cas9 systeem en een ribonucleoproteïne-gebaseerde aanpak met behulp van wildtype S.pyogenes Cas9-eiwit en een synthetisch tweedelig CRSPR RNA en tracrRNA. Dit RNP wordt samen met de gewenste fluorescente tag-sequentie als een donorplasmide via elektroporatie geleverd.

Putatief bewerkte cellen die het gefluorescereerd gelabelde eiwit tot expressie brengen, worden verrijkt door FACS. Clonale lijnen worden vervolgens gegenereerd voor analyse van nauwkeurige bewerkingsresultaten. Dit genbewerkingsprotocol heeft veel voordelen ten opzichte van traditionele overexpressieconstructen.

Omdat een fluorescente tag in het genoom wordt geïntroduceerd, kunnen de subcellulaire lokalisatie en dynamica van het resulterende fusie-eiwit worden bestudeerd onder endogene regulerende controle. Hier gebruiken we geïnduceerde pluripotente stamcellen als modelsysteem omdat het ons toestaat om de gelabelde eiwitten in diploïde niet-getransformeerde cellen te bestuderen. Bovendien, omdat de cellen kunnen worden gedifferentieerd in meerdere celtypen, zoals de hier getoonde cardiomyocytcellen, biedt deze aanpak de mogelijkheid om gelabelde eiwitten te creëren en te bestuderen in een verscheidenheid van isogene cellulaire contexten.

Met zorgvuldige optimalisatie zou dit protocol echter kunnen worden aangepast voor het bewerken van de genomen van andere zoogdierceltypen. Hoi, ik ben Amanda Haupt, ik maak deel uit van het team voor stamcellen en genbewerking hier bij het Allen Institute for Cell Science. Vandaag hebben we deze aanpak gebruikt om meer dan 35 verschillende cellijnen te genereren die endogene fusie-eiwitten tot expressie brengen.

We gebruiken deze om een breed scala aan unieke cellulaire structuren en processen te bestuderen. Deze aanpak is tot nu toe voor 95%van de loci die onze groep heeft geprobeerd succesvol geweest. Deze methode zal vooral nuttig zijn voor celbiologen die geïnteresseerd zijn in een beter begrip van de dynamica van een eiwit in levende cellen.

Maar zodra de bewerkte clonale lijnen zijn gegenereerd, zijn de mogelijkheden voor studie eindeloos. Met deze methode zijn we in staat om consistent klonen te identificeren die monoallelische fluorescente eiwittags hebben zonder enige andere verstoringen in de genomische sequentie. We zijn ook af en toe in staat om biallelisch bewerkte klonen te verkrijgen.

In deze video zullen we enkele van de belangrijkste stappen in het transfecteren, FACS verrijken en isoleren van clonale cellijnen die endogene gereguleerd fluorescente fusie-eiwitten tot expressie brengen laten zien. Behandel de hiPSC's twee tot drie uur vóór transfectie met tien micromolar ROCK-remmer gesupplementeerd in groeimedia. Dit zal de overleving na elektroporatie bevorderen.

Cellen zullen een stekelige uiterlijk hebben na deze behandeling. Cellen moeten worden verwijderd van de weefselsluitingsplaat met behulp van een enkelcellig dissociatiegebied en de celluspensie wordt verzameld in een conische buis vóór transfectie. Bereid een aliquot van 1,84 keer 10 tot de zes cellen voor voor elke experimentele conditie die getransfecteerd moet worden.

Bereid ribonucleoproteïnecomplexbuizen voor elke transfectie door 2,88 microliters van 10 micromolar geleid RNA en 2,88 microliters van 10 micromolar Cas9 toe te voegen aan een 1,5 mil buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende minimaal 10 minuten, maximaal een uur. Pellet het celaliquot dat in de vorige stap is bereid bij 211 keer G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Aspergeer vervolgens het supernatant en draai snel het cellenpellet in 220 microliters elektroporeringsbuffer. Voeg 220 microliters van hervat cellen toe aan de eerder bereide 1,5 mil RNP complexbuis. Voeg 4,6 microliters van één microgram per microliter donorplasmide toe.

Gebruik de nucleofectietip en pipet om de twee inhoud twee tot drie keer te mengen en breng vervolgens honderd microliters van de suspensie over naar het voorbereide elektroporeringsapparaat. Vermijd het introduceren van luchtbellen in de tip. Breng dertienhonderd volt aan gedurende één puls van dertig milliseconden.

Breng de suspensie voorzichtig over in een voorbereide zeswelplaat met een draaiende beweging. Verspreid de cellen door de plaat voorzichtig heen en weer en van voor naar achter te bewegen. Na herhaling voor alle experimentele omstandigheden en controles, incubeer getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 24 uur, waarbij het medium wordt vervangen door regulier groeimedium zonder ROCK-remmer bij 24 uur.

Ga vervolgens door met het voeden van de hiPSC's elke 24 uur gedurende 72 tot 96 uur terwijl hun confluency wordt gemonitord. Wanneer hiPSC's 68 tot 80%confluency bereiken, gaat u door naar de FACS-verrijking. Twee tot drie uur vóór transfectie behandelen hiPSC's met 10 micromolar ROCK-remmer gesupplementeerd in het groeimedium om de overleving na FACS-verrijking te bevorderen.

Om cellen te sorteren, verwijder ze van de plaat met behulp van het enkelcellig dissociatiereagens en filter de hiPSC-suspensie vervolgens door een 35 micron meshfilter in polystyreen ronde bodembuizen. Sorteer cellen met behulp van voorwaartse verstrooiing en zijdelingse verstrooiing, inclusief: hoogte versus breedte, triplets puin en doublets. Gebruik alleen live buffercontrolecellen om de FP-positieve poort in te stellen zodat minder dan 1,1%van de buffer alleen cellen binnen de poort valt.

Wanneer stamcellen worden gesorteerd, pas de instrumentinstellingen aan om de overleving van cellen te bevorderen zoals aanbevolen in de discussiesectie. Typische knock-in-efficiënties zoals bepaald door het percentage FP-positieve cellen door FACS kunnen variëren van 0,1%tot 5%Sorteer cellen in een 1,5 tot 15 mil polypropyleenbuis bevattende 0,5 tot 2 mils van kamertemperatuur groeimedia gesupplementeerd met 10 micromolar ROCK-remmer. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 211