In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de organisatie en membranen van cellen, bijvoorbeeld welke rol geometrische aanwijzingen spelen in het proces. Het grote voordeel van deze techniek is dat het precieze controle mogelijk maakt over alle aspecten die van invloed zijn op patroonvorming, zoals eiwitconcentraties. Om te beginnen, genereer multilamellaire vesikels zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bevriest nu de lipiden gedurende zeven tot 10 cycli, door eerst een beker met water op 70 tot 99 graden Celsius op een heet plaatje voor te bereiden, evenals een container met vloeibare stikstof. Houd de fles in vloeibare stikstof met grote pincetten totdat de stikstof stopt met koken. Breng vervolgens de fles over in heet water totdat de oplossing volledig is ontdooid.

Herhaal deze stappen totdat de lipidenmixtuur helder lijkt voor het oog, afhankelijk van de mixtuur. Monteer vervolgens een lipide-extruder en spoel het systeem voor met Min-buffer. Extrudeer de lipidenmixtuur 35 tot 41 keer door een membraan met poriën van 50 nanometer groot.

Zorg ervoor dat je eindigt op een oneven aantal passen om aggregaten te voorkomen die de membraan nooit hebben doorkruist. Verdeel glazen dekglasjes op een omgekeerde glazen petrischaal of een andere inerte oppervlakte. Voeg met een glazen pipet zeven druppels geconcentreerd zwavelzuur toe aan het midden van elk dekglas.

Voeg vervolgens twee druppels 50% waterstofperoxide toe aan het midden van de zuurdruppels. Bedek de reactie en incubeer gedurende ten minste 45 minuten. Neem nu de dekglasjes afzonderlijk op met pincetten en spoel het zuur af met ultrapuur water.

Plaats de gewassen dekglasjes in antiaanbaklaaghouders of een soortgelijk transportapparaat. Spoel nu elk dekglas uitgebreid met ultrapuur water en droog het oppervlak af met geperst gas. Markeer de schone kant van het dekglas met een permanente marker.

Om de kamer te assembleren, snijd eerst het deksel en het conische gedeelte van een reactiebuis van 0,5 milliliter af en gooi ze weg met scherpe schaar. Breng vervolgens UV-lijm aan op de bovenrand van de buis en verdeel de lijm gelijkmatig door een pipettip te gebruiken. Lijm de buis op zijn kop aan de schone kant van het dekglas.

Harden ten slotte de UV-lijm door meerdere kamers vijf tot 15 minuten onder een 360 nanometer lamp of LED te plaatsen. Voor de vorming van ondersteunde lipide dubbellagen, verwarm een verwarmingsblok voor tot 37 graden Celsius en incubeer twee milliliter reactiebuizen met Min- of SLB-buffer bij één buis per kamer. Blaas stikstof in de geassembleerde en uitgeharde kamers om eventueel stof of andere deeltjes te verwijderen die zich tijdens het UV-harden en de montage hebben kunnen nestelen.

Plaats vervolgens de kamers op het verwarmingsblok. Verdun een 20 microliter aliquot van heldere lipiden met 130 microliter Min-buffer, waardoor een werkconcentratie van 0,53 milligram per milliliter ontstaat. Voeg 75 microliter van de lipidenmixtuur toe aan elke kamer.

Stel nu een timer in op drie minuten. Tijdens de incubatietijd barsten de vesikels op het hydrofiele glazen oppervlak en versmelten ze tot een samenhangende SLB. Zodra 60 seconden zijn verstreken, voegt u 150 microliter Min-buffer toe aan elke kamer.

Na de resterende 120 seconden, was elke kamer door 200 microliter Min- of SLB-buffer toe te voegen, zorgvuldig een paar keer op en neer te pipetten, te verwijderen en nog eens 200 microliter toe te voegen. Zodra elke kamer eenmaal is gewassen, gaat u verder met het grondig wassen van de eerste kamer totdat de twee milliliter buffer is opgebruikt. Het wassen van ondersteunde lipide dubbellagen vereist enige ervaring om de mate van bewegingen in de kamer te perfectioneren en de juiste wasintensiteit te vinden.

Om PDMS-microstructuren uit gepatroneerde siliciumwafels te produceren, gebruik eerst een plastic beker om 10 gram PDMS-basis en één gram PDMS-crosslinker te wegen. Gebruik een mengapparaat om de PDMS-mix te mengen en te ontgassen. Gebruik nu een pipettip om een kleine hoeveelheid PDMS rechtstreeks op de structuur op de siliciumwafel te druppelen.

Plaats onmiddellijk een 1 dekglas op de PDMS-druppel en neem het bovenste uiteinde van een schone pipettip om het dekglas voorzichtig op de siliciumwafel te drukken. De PDMS moet zich dun verspreiden tussen het dekglas en de siliciumwafel. Plaats de wafel met de dekglasjes in een oven en hard de PDMS gedurende drie tot vier uur, of een nacht, bij 75 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de wafel uit de oven en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder met een scheermesje voorzichtig het dekglas met het aangehechte PDMS van de siliciumwafel. Bevestig nu een plastic kamer aan het PDMS zoals eerder beschreven voor glas.

Neem de dekglasjes met aangehecht kamer en plaats in plasmareiniger met zuurstof als het procesgas. Reinig de dekglasjes met plasma. In dit werk werd 30% vermogen en 0,3 millibar zuurstofdruk gedurende één minuut gebruikt.

Bereid nu een SLB in de kamer zoals eerder beschreven op glas. Om de zelforganisatie-assay uit te voeren, pas het buffervolume in de kamer aan op 200 microliter Min-buffer, minus de hoeveelheid eiwit en ATP-oplossing. Voeg vervolgens MinD, gelabelde MinD, MinE en indien gewenst MinC toe en meng de componenten voorzichtig door te pipetten.

Voeg nu 2,5 millimolair ATP toe om de zelforganisatie van MinDE te starten. Controleer gedurende de volgende 10 tot 30 minuten op regelmatige MinDE-patroonvorming en goed gevormde microstructuren op een fluorescentiemicroscoop. Wanneer regelmatige MinDE-patronen zijn gevormd, pipet omhoog en omlaag twee keer om de componenten te mengen.

Verwijder het grootste deel van de buffer met een pipet van 100 microliter en verwijder ver