Name: In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer de in vitro reconstructie van zelf-organiserende MinDE-eiwitpatronen op ondersteunde lipide bilayers in PDMS-microcompartimenten. Deze methode biedt precieze controle over patroonvorming en imiteert in vivo omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Michael Heymann en Frank Siedler voor productie van silicium wafers, Core faciliteit MPI-B voor bijstandsverlening in EiwitReiniging en Simon Kretschmer en Leon Harrington voor opmerkingen over het manuscript.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben een protocol beschreven voor de in vitro reconstitutie van zelforganisatie van het MinCDE op vlakke lipide bilayers ondersteunde en in de lipide dubbelgelaagde vallen 3D structuren, met behulp van het voorbeeld van staafvormig PDMS microstructuren. Waardevol om gegevens te verkrijgen van deze testen, zijn de belangrijkste factoren om te bepalen kwaliteit eiwit en membraan.
Om kwaliteit eiwit, eiwit massa moet worden bevestigd met behulp van SDS-pagina en massaspectrometrie. Voorts dient te worden geverifieerd dat eiwitten zijn oplosbaar en niet geaggregeerde, met behulp van analytische gel filtratie of Dynamische lichtverstrooiing. Gel filtratie kan worden gebruikt om te verwijderen waarbij het geaggregeerde gedeelte van eiwitten. Zorgvuldige pH-waarde en de kwaliteit van toegevoegde nucleotiden is van cruciaal belang, als de toevoeging van niet-gecorrigeerde of gedeeltelijk aangetaste nucleotide aan proteïne voorraden of zelf-organiserende testen is voldoende om te elimineren eiwit activiteit, dus afschaffen zelf-organisatie.
Naast eiwitten de kwaliteit, membraan kwaliteit is meest kritische en onjuiste membraan vorming is meestal de oorzaak van de defecte zelforganisatie en de oorsprong van artefactual oppervlakte structuren.
Bij het uitvoeren van het protocol voor de eerste keer, is het nuttig om het label van de ondersteunde lipide-bilayers door gelabelde lipiden zoals Atto-655-DOPE of DiI lage molaire percentages (0.05%). Waardoor kunnen de eigenschappen en de kwaliteit van het membraan worden beoordeeld direct. FRAP gebruikt, kan de vloeibaarheid van het membraan worden beoordeeld. Bovendien kan een direct beoordelen de kwaliteit van het wassen van de SLB, als er zal ofwel te veel blaasjes, geen vloeistof membraan of geen membraan helemaal niet, als het is afgewassen. De open kamer aanpak maakt het mogelijk om strikt wassen het membraan, en dus ook voor het verwijderen van blaasjes die op het oppervlak van de SLB steken. De meest cruciale factoren voor het verkrijgen van vloeistof en homogene ondersteunde lipide, bilayers zijn de reinigings- en hydrophilicity van het oppervlak van de steun en de juiste grootte en de homogeniteit van de SUVs. kunnen het nuttig om te controleren SUV grootte en het gebruik van de distributie van de grootte Dynamische lichtverstrooiing. Voor smalle grootte distributies raden we de blaasjes diepte in plaats van het sonicating hen. Andere methoden van reiniging coverslips, bijvoorbeeld, behandelingen met sterke basen, fundamentele detergentia of coverslips te gebruiken direct na het spoelen met water, kunnen goede resultaten opleveren, afhankelijk van de toepassing en lipide mengsel.
De eerste helft van het protocol gepresenteerd hier, in vitro reconstitutie op vlakke ondersteunde lipide bilayers in open kamers, heeft het voordeel van destructie van het oppervlak toegankelijk voor optische microscopies, zoals TIRF microscopie30, FRAP analyse6, single-deeltje bijhouden34, evenals oppervlakte sonde technieken zoals atomaire kracht microscopie26. De grote homogene omgeving zorgt voor betere statistieken bij gedefinieerde concentraties. Bovendien kan de open kamer aanpak nauwkeurig bepalen eiwitconcentratie en een snelle en eenvoudige toevoeging van andere onderdelen, vandaar het toelaat om Titreer eiwitconcentratie in een enkele kamer20. De bepaling kan ook worden uitgebreid door de toevoeging van andere onderdelen van de bacteriële divisome zoals FtsZ22,35, ZipA22 of de chimeer eiwit FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andere groepen hebben een soortgelijke aanpak genomen om de krachten de Min systeem in vitro, maar gebruik een stroom-cel in plaats van een open kamer17,18,19. Stroom-cellen hebben bepaalde voordelen, met name wanneer een volledig gesloten 3D-omgeving nodig18, de invloed van stroom17,19,23 is of membraan samenstelling23 op MinCDE patronen onderzocht, of als eiwit patronen worden waargenomen onder eiwit voorwaarden19te beperken. Lokaal beheer van moleculaire concentraties is echter moeilijker. Eiwit onderdelen, vooral gedachten, sterk binden aan het membraan ze eerste ontmoeting18,19. In onze ervaring vertonen de eiwitten vaak niet-specifieke binding aan buizen, inhammen, spuiten en andere delen van de microfluidic. Vandaar, lokale eiwit concentratie verschillen van input concentraties18 en ook variëren over de lengte van de stroom-cel, wat resulteert in een verscheidenheid van verschillende eiwitten patronen op de membraan tussen de inlaat en uitlaat, zoals waargenomen door anderen19.
De tweede helft van het protocol gepresenteerd hier, de reconstitutie in vitro in staafvormig microstructuren opnieuw met behulp van de open kamer aanpak op een patroon drager lipide vallende bilayers voorziet in een eenvoudige nabootsen van in vivo eiwit gedrag Hoewel nauwkeurige controle over eiwit concentraties is verloren als gevolg van de verwijdering van de buffer. Merk op dat omdat de golflengte van MinDE is ongeveer één orde van grootte groter in vitro dan in vivo de staafvormig microcompartments zijn ook over één orde van grootte groter (10 x 30 µm) dan een staafvormig E. coli cel.
Globaal, dit protocol voorziet in de nauwkeurige controle van alle voorwaarden, met inbegrip van de eiwitconcentratie, buffer samenstelling en eigenschappen van het membraan. Het gebruik van 3D gestructureerde ondersteunt kan de reactie worden bestudeerd onder ruimtelijke opsluiting, het nabootsen van in vivo gedrag zonder de noodzaak voor complexe microfluidics apparatuur.

Spatio patronen zijn essentieel in de natuur, reguleren beide complexe taken op meercellige en cellulaire niveau van voedselproductie aan gereglementeerde celdeling1,2. Reactie-diffusie systemen spelen een belangrijke rol bij de vaststelling van deze patronen, maar zijn nog steeds niet goed begrepen. Een schoolvoorbeeld van een reactie-verspreiding en het beste gekarakteriseerd biologische systeem is tot nu toe de Escherichia coli MinCDE systeem3,4,5,6,7. Het MinCDE systeem oscilleert vanaf pole van cel naar cel pool in E. coli om te bepalen van het midden van de cel als de toekomstige indeling site. Dit systeem is gebaseerd op de ATPase-geest, het activeren van eiwit, MinE, en het membraan als een ruimtelijke reactie matrix8ATPase. MinC maakt geen deel uit van het mechanisme voor de vorming van patroon, maar is de werkelijke functionele agent: een inhibitor van de omwenteling van het voornaamste divisome eiwit FtsZ5,6. MinC bindt aan gedachten en daarom volgt de oscillaties, resulterend in een tijd-gemiddeld eiwit concentratie verloop dat is aan de Polen van de cel maximale en minimale op het midden van de cel, waardoor alleen FtsZ te polymeriseren in midcell9,10 . Het MinCDE-systeem maakt deel uit van de grotere familie van Walker A ATPases die zijn de sleutel tot de spatio organisatie in bacteriën2, voor positioneren en transporteren van eiwitten complexen11 en plasmiden12 en voor het reguleren van de cel afdeling13 en chromosoom segregatie14. Vandaar, de MinCDE reactie-diffusie systeem niet alleen vertegenwoordigt een archetypische reactie-diffusie-systeem, maar ook de aandacht getrokken vanwege de relevantie ervan voor de spatio organisatie bij bacteriën.
Gedetailleerde functionele studies van het MinCDE systeem in vivo zijn ingewikkeld, aangezien manipulatie van eiwitten en gene verwijdering meestal resulteren in defecten van de celdeling. Bovendien verandert de samenstelling van het membraan of de eigenschappen van het cytosol in vivo is zeer uitdagend15,16. Wijzigingen in het systeem en het beïnvloeden van de factoren zijn moeilijk te interpreteren in de complexe omgeving van de cel, nog meer als het wordt verstoord in deze een wezenlijke functie als celdeling. Wij en anderen hebben daarom wendde zich tot een in vitro reconstitutie aanpak, vermindering van het systeem tot de kernonderdelen: MinD, mijne, ATP als energiebron en de ondersteunde lipide dubbelgelaagde als een reactie matrix6,17, 18. deze bottom-up benadering maakt het mogelijk om de sonde van het mechanisme van zelforganisatie in detail zonder de complexiteit van een levende cel. De eiwitten vorm reizen oppervlak golven6 en andere soorten patronen17,19 onder deze omstandigheden, zij het met een golflengte dat is meestal over een omvang die groter is dan in vivo. Het gebruik van een open kamer vergemakkelijkt precieze controle over alle aspecten beïnvloeden patroonformatie: eiwit concentraties6, eiwit eigenschappen20membraan samenstelling10, buffer samenstelling en ATP concentratie 6, evenals toevoeging van andere factoren, zoals verdringing agenten21 en andere divisome eiwitten22. Ter vergelijking: de reconstitutie in vitro van het systeem van de MinCDE in een flow-cel18,19,23 kan worden gebruikt om de sonde van de invloed van stroom17,23, eiwit beperking van voorwaarden19, membraan samenstelling19 en volledige 3D opsluiting18 op eiwit patronen, maar maakt een exacte controle van eiwit/component concentratie en sequentiële component toevoeging veel meer ingewikkeld.
Met behulp van dit open huis, we ook het patroon van de steun van de bilayers van de vlakke lipide waaraan kan een sonde hoe geometrische grenzen invloed patroon formatie21, een fenomeen dat onlangs heeft ook al onderzocht in vivo met behulp van bacteriën gegoten in microstructuren7. Wij ook gebruikt deze test om te onderzoeken hoe gedefinieerde mutaties in de mijne patroonformatie van de invloed van het systeem20. Bovendien, dezelfde fundamentele assay indeling heeft gewerkt om te onderzoeken hoe patroonformatie kan worden gecontroleerd door het licht, invoering van een azobenzeen-kruisverwijzende MinE peptide in de test en imaging met TIRF microscopie24.
We vonden dat, om te repliceren de MinDE patroon formatie waargenomen in vivo in een systeem, in vitro opsluiting was sleutel. Met behulp van staafvormig microcompartments, met de afmetingen aangepast aan de grotere golflengte van MinDE in vitro (10 x 30 µm), bekleed met een ondersteunde lipide dubbelgelaagde toegestaan de reconstitutie van MinDE paal-aan-polig oscillaties en eiwit kleurovergang vorming 10,25. In deze test, zijn de ondersteunde lipide-bilayers gestort op een patroon PDMS substraat waarin verschillende honderd replica's van staafvormig microcompartments dat aan de bovenkant open blijven. De reactie kan worden ingesteld in een open zaal door dit, en vervolgens de buffer is verlaagd tot de rand van de microcompartments, waardoor de reactie op een klein volume beperken. Hoewel deze compartimenten beschikt over een lucht-buffer-interface aan de ene kant en vandaar niet een volledige 3D opsluiting door membraan vertegenwoordigen, deed de dynamiek van de eiwitten in vivo oscillaties10,25. Vergeleken met volledige 3D opsluiting, waaruit blijkt zeer vergelijkbaar18resultaten, de open microstructuren assay is relatief eenvoudig en gemakkelijk te verwerken en kunnen ook worden uitgevoerd door laboratoria die niet zijn uitgerust met apparatuur van de gespecialiseerde microfluidics en schoon-kamervoorzieningen.
Hier presenteren we een experimenteel protocol voor de bijenpopulatie patroonformatie op ondersteund lipide bilayers in vitro met behulp van een open kamer die voor controle van alle onderdelen en gemakkelijke toegang door optische microscopie en, met minderjarige zorgt MinCDE wijzigingen, is ook geschikt voor oppervlakte-sonde technieken26. Naast vlakke ondersteunde lipide bilayers, we laten ook zien hoe eiwitten opsluiting kan worden verkregen met behulp van eenvoudige patroon ondersteunde lipide bilayers op staafvormig PDMS microstructuren. Deze testen, kunnen hoewel geoptimaliseerd voor het MinCDE-systeem, ook worden overgedragen aan andere eiwit-systemen die op een soortgelijke manier met het membraan, zoals FtsZ27 of een minimale actine cortex28 werken.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Veel aspecten van de fundamentele Spatio organisatie van cellen worden beheerst door reactie-diffusie type systemen. In vitro reconstitutie van dergelijke systemen voorziet in gedetailleerde studies van hun onderliggende mechanismen die zou niet haalbaar in vivo. Wij bieden hier, een protocol voor het in vitro reconstitutie van het MinCDE systeem van Escherichia coli, die de posities van de celdeling tussenschot in het midden van de cel. De bepaling is ontworpen voor het leveren van alleen de benodigde onderdelen voor zelf-organisatie, namelijk een membraan, de twee eiwitten geest en mijne en energie in de vorm van ATP. Wij fabriceren daarom een kamer open reactie op een dekglaasje aan, waarop een ondersteunde lipide dubbelgelaagde wordt gevormd. Het open ontwerp van de kamer zorgt voor optimale voorbereiding van het lipide dubbelgelaagde en gecontroleerde manipulatie van de inhoud van de bulk. De twee eiwitten, gedachten en mij, evenals ATP, worden vervolgens toegevoegd in de bulk-volume boven het membraan. Beeldvorming is mogelijk door het vele optische microscopies, als de ontwerp ondersteunt confocal, breed-gebied en TIRF microscopie gelijk. In een variatie van het protocol, wordt de lipide dubbelgelaagde gevormd op een patroon ondersteuning, op cel-vormige PDMS microstructuren, in plaats van glas. Het verlagen van de bulk oplossing aan de rand van deze compartimenten omsluit de reactie in een kleinere compartiment en biedt grenzen waarmee het nabootsen van in vivo oscillerende gedrag. Tezamen, beschrijven we protocollen om te reconstrueren van het MinCDE systeem zowel met als zonder ruimtelijke opsluiting, waardoor onderzoekers precies alle aspecten patroonformatie, zoals concentratie bereiken en toevoeging van andere factoren beïnvloeden beheren of eiwitten, en systematisch toe de complexiteit van het systeem in een relatief eenvoudige experimentele opzet.

Eiwitreiniging volgens onze protocol moet Min proteïnen van voldoende zuiverheid opleveren. Als referentie geeft Figuur 1 een beeld van de SDS-pagina van geest, fluorescently geëtiketteerd geest, MinE en MinC. De afzonderlijke stappen van de procedure voor het uitvoeren van een MinDE zelforganisatie assay op niet-patroon ondersteunde lipide bilayers worden beschreven in Figuur 2. Met behulp van dit protocol, kan regelmatige MinDE reizen oppervlakte golven worden waargenomen in de kamer (Figuur 3). De golflengte binnen de kamer kan verschillen, maar in het algemeen lijken er patronen. De randen van de kamer moeten niet worden gebruikt voor de kwantitatieve vergelijkingen, zoals membranen dat formulier op de UV lijm lijken te hebben verschillende eigenschappen dan op het glas oppervlak (Zie Figuur 3 c). De reizende oppervlakte golven kunnen worden geanalyseerd door het uitzetten van de intensiteit in de richting van de voortplanting (figuur 3B). Terwijl de geest fluorescentie randplateau nogal snel uit de voorrand van de Golf en vervolgens sterk afneemt bij de afvallende flank, mijn fluorescentie verhoogt bijna lineair vanaf het begin van de geest-Golf en bereikt zijn maximum na gedachten bij de afvallende flank, waar het aanzienlijk6eraf.
Naast eiwitten de kwaliteit is de kwaliteit van de ondersteunde lipide-bilayers meest kritische voor een regelmatige zelforganisatie van MinCDE. Aan de ene kant als het membraan ook overdreven gewassen wordt of het onderliggende oppervlak heeft zijn gereinigd en dus te sterk belast, gaten kunnen vormen in het membraan (figuur 6A, top). Aan de andere kant het membraan wordt niet goed gewassen of het onderliggende oppervlak niet schoongemaakt/hydrophilized, blaasjes zal vasthouden aan het membraan of de vloeibaarheid membraan zal worden aangetast (figuur 6A, beneden). Hoewel niet zo duidelijk als bij het observeren van het membraan rechtstreeks via gelabelde lipiden, deze problemen kunnen ook worden gedetecteerd van het achterhoofd fluorescentie signaal, zoals patronen niet regelmatig zijn en de fluorescentie in de maxima is niet homogeen, maar bevat "gaten" of heldere vlekken zoals weergegeven in het middelste deelvenster van figuur 6A.
De procedure is voor de MinDE zelforganisatie in staafvormig PDMS microstructuren samengevat in Figuur 4. Verschillende stappen van het protocol hoeft niet te worden herhaald, zoals eiwitten en lipiden kunnen worden hergebruikt. Als op niet-patroon ondergronden, de ondergrond wordt gereinigd en hydrophilized (door plasma-reiniging), een ondersteunde lipide dubbelgelaagde wordt gevormd op het PDMS en de bepaling van zelforganisatie in een volume van 200 µL is ingesteld. Om te controleren dat er een juiste membraan heeft gevormd en MinDE zelf op het membraan organiseert, zijn de kamers beeld. Wanneer een juiste membraan heeft gevormd, MinDE formulieren regular oppervlaktegolven reizen op het oppervlak van het PDMS tussen de individuele microstructuren en zelf ook aan de onderkant van de microstructuren organiseert als de golven vrijelijk kunnen verplaatsen over de hele membraan bedekte oppervlak (figuur 5A). Na verwijdering van de buffer, mag het oppervlak tussen de compartimenten geen eventuele teeltmateriaal MinDE patronen (figuur 5B), tonen als het moet volledig droog zijn. Als MinDE patronen nog steeds zijn, moet meer buffer worden verwijderd. De eiwitten zijn nu in de microcompartments staafvormig beperkt door de membraan beklede PDMS en door de lucht op de bovenste interface (figuur 5C), waarin ze zelf zal organiseren. Onder deze omstandigheden kunnen de twee eiwitten paal-aan-polig oscillaties uitvoeren zoals weergegeven in figuur 5D. Als een fractie van de geest en de mijne altijd membraan-gebonden is, ook zijn tijdens het verwijderen van de buffer, de concentraties na verwijdering van de buffer niet vergelijkbaar is met ingang van concentraties. Als gevolg van dit effect variëren de concentraties ook tussen individuele microstructuren op de dezelfde dekglaasje aan zoals zij zijn afhankelijk van de positie van de patronen voordat zij zijn afgehaald van de buffer. Silicium wafer productie of PDMS molding van het silicium wafer kan leiden tot onvolledige microstructuren die niet kunnen worden gebruikt voor analyse (figuur 6B). Anderzijds te wijten aan de buffer verwijdering microstructuren tijdens het proces kunnen uitdrogen, en dus moeten worden uitgesloten van verdere analyse (figuur 6B). Als gevolg hiervan toont slechts een fractie van de microstructuren in één kamer de gewenste paal-aan-polig oscillaties. Om de dynamiek van de eiwitten in de microstructuren te analyseren, kan een Kymograaf worden verkregen door een selectie te trekken over de gehele structuur (figuur 5E). Wanneer MinCDE oscilleren vanaf pole-naar-pole, zal MinC en geest tonen een gradiënt van de concentratie tijd-gemiddeld met maximumconcentratie aan de Polen compartiment en minimale concentratie in het midden van het compartiment (figuur 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figuur 1: SDS-pagina met de eindproducten van eiwit zuivering. Zijn-geest (33.3 kDa), zijne-eGFP-MinD (60,1 kDa), zijne-mRuby3-MinD (59,9 kDa), zijne-MinE (13.9 kDa) en zijn-MinC (28.3 kDa) worden weergegeven in volgorde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figuur 2: proces flow diagram toont de verschillende stappen en de timing van het protocol voor een zelf-organisatie op ondersteunde lipide niet-patroon bilayers (stappen 1-6). Gestippelde vakken geven aan dat een van deze twee opties kan worden gebruikt voor het reinigen. Pijlen gemarkeerd door cirkels geven aan waar het protocol kan worden onderbroken en later hervat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figuur 3: Imaging van MinDE assay door confocale microscopie. A) regelmatige Min spiraal, welke Golfvoortplantingssnelheid, de plot van de intensiteit en de snelheid metingen kunnen worden verkregen. Gebruikte concentraties: 0,6 µM MinD (30% eGFP-MinD), 1.8 µM zijn-MinE (30% zijn-MinE-Alexa647) B) voorbeeld genormaliseerde intensiteit perceel voor de regio gemarkeerd in de A. C) overzicht van hele assay kamer (schaal bar: 1 mm, hetzelfde eiwit concentraties als hierboven). Spiralen draaien beide richtingen evengoed als doel patronen kunnen worden waargenomen. Het vergrote gebied toont hoe golfpatronen verschillen op de UV-lijm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figuur 4: proces flow diagram toont de verschillende stappen en de timing van het protocol voor zelf-organisatie in staafvormig microstructuren (stappen 1-5, 7, 8). Grijze vakjes geven aan stappen waar producten kunnen worden hergebruikt uit het protocol op niet-patroon ondersteunde lipide bilayers. Pijlen gemarkeerd door cirkels geven aan waar het protocol kan worden onderbroken en later hervat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figuur 5: representatieve resultaten voor MinDE patroon formatie in staafvormig PDMS microcompartments. A) MinDE zelf organiseren op het oppervlak van het PDMS vormen reizen oppervlakte golven (1 µM MinD (30% EGFP-MinD), 2 µM mijne en 2,5 mM ATP). B) nadat de buffer is verlaagd tot de hoogte van de microstructuren, de zelforganisatie van eiwit stopt op het vlakke oppervlak tussen de microcompartments. C) schematische van een staafvormig microcompartment. D) representatieve beelden van MinDE paal-aan-polig oscillaties na verwijdering van de buffer. E) Kymograaf van de oscillaties langs de gemarkeerde lijn weergegeven in D). F) beeld en profiel van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de tijdreeks weergegeven in D) waaruit duidelijk blijkt het eiwit verloop thats op microcompartment Polen maximale en minimale op compartiment midden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figuur 6: voorbeelden van negatieve experimentele resultaten. A) te veel gewassen membranen accumuleren gaten, terwijl suboptimaal vesikel preparaten en lipide composities leiden tot vasthouden van de blaasjes. De twee center-panelen tonen een combinatie van problemen en hoe ze worden zichtbaar wanneer observeren Min oscillaties. Membranen zijn geëtiketteerd met 0,05% Atto655-DOPE. (schaal bars: 50 µm) B) BOVENPANEEL: uitgedroogd microcompartments kan worden veroorzaakt door teveel buffer verwijdering of wanneer de buffer na verloop van tijd verdampt. Onderste paneel: onvolledige compartimenten kunnen worden gevormd tijdens wafer productie of PDMS molding. (schaal bars: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende bestand 1: De kaart van de plasmide voor zijn-geest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 2: De kaart van de plasmide voor zijn-EGFP-MinD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 3: De kaart van de plasmide voor zijn-mRuby3-MinD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 4: De kaart van de plasmide voor zijn-MinE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 5: De kaart van de plasmide voor zijn-MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 6: CAD-bestand voor silicium wafer van staafvormig microcompartments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de organisatie en membranen van cellen, bijvoorbeeld welke rol geometrische aanwijzingen spelen in het proces. Het grote voordeel van deze techniek is dat het precieze controle mogelijk maakt over alle aspecten die van invloed zijn op patroonvorming, zoals eiwitconcentraties. Om te beginnen, genereer multilamellaire vesikels zoals beschreven in het tekstprotocol.Bevriest nu de lipiden gedurende zeven tot 10 cycli, door eerst een beker met water op 70 tot 99 graden Celsius op een heet plaatje voor te bereiden, evenals een container met vloeibare stikstof. Houd de fles in vloeibare stikstof met grote pincetten totdat de stikstof stopt met koken. Breng vervolgens de fles over in heet water totdat de oplossing volledig is ontdooid.Herhaal deze stappen totdat de lipidenmixtuur helder lijkt voor het oog, afhankelijk van de mixtuur. Monteer vervolgens een lipide-extruder en spoel het systeem voor met Min-buffer. Extrudeer de lipidenmixtuur 35 tot 41 keer door een membraan met poriën van 50 nanometer groot.Zorg ervoor dat je eindigt op een oneven aantal passen om aggregaten te voorkomen die de membraan nooit hebben doorkruist. Verdeel glazen dekglasjes op een omgekeerde glazen petrischaal of een andere inerte oppervlakte. Voeg met een glazen pipet zeven druppels geconcentreerd zwavelzuur toe aan het midden van elk dekglas.Voeg vervolgens twee druppels 50% waterstofperoxide toe aan het midden van de zuurdruppels. Bedek de reactie en incubeer gedurende ten minste 45 minuten. Neem nu de dekglasjes afzonderlijk op met pincetten en spoel het zuur af met ultrapuur water.Plaats de gewassen dekglasjes in antiaanbaklaaghouders of een soortgelijk transportapparaat. Spoel nu elk dekglas uitgebreid met ultrapuur water en droog het oppervlak af met geperst gas. Markeer de schone kant van het dekglas met een permanente marker.Om de kamer te assembleren, snijd eerst het deksel en het conische gedeelte van een reactiebuis van 0,5 milliliter af en gooi ze weg met scherpe schaar. Breng vervolgens UV-lijm aan op de bovenrand van de buis en verdeel de lijm gelijkmatig door een pipettip te gebruiken. Lijm de buis op zijn kop aan de schone kant van het dekglas.Harden ten slotte de UV-lijm door meerdere kamers vijf tot 15 minuten onder een 360 nanometer lamp of LED te plaatsen. Voor de vorming van ondersteunde lipide dubbellagen, verwarm een verwarmingsblok voor tot 37 graden Celsius en incubeer twee milliliter reactiebuizen met Min- of SLB-buffer bij één buis per kamer. Blaas stikstof in de geassembleerde en uitgeharde kamers om eventueel stof of andere deeltjes te verwijderen die zich tijdens het UV-harden en de montage hebben kunnen nestelen.Plaats vervolgens de kamers op het verwarmingsblok. Verdun een 20 microliter aliquot van heldere lipiden met 130 microliter Min-buffer, waardoor een werkconcentratie van 0,53 milligram per milliliter ontstaat. Voeg 75 microliter van de lipidenmixtuur toe aan elke kamer.Stel nu een timer in op drie minuten. Tijdens de incubatietijd barsten de vesikels op het hydrofiele glazen oppervlak en versmelten ze tot een samenhangende SLB. Zodra 60 seconden zijn verstreken, voegt u 150 microliter Min-buffer toe aan elke kamer.Na de resterende 120 seconden, was elke kamer door 200 microliter Min- of SLB-buffer toe te voegen, zorgvuldig een paar keer op en neer te pipetten, te verwijderen en nog eens 200 microliter toe te voegen. Zodra elke kamer eenmaal is gewassen, gaat u verder met het grondig wassen van de eerste kamer totdat de twee milliliter buffer is opgebruikt. Het wassen van ondersteunde lipide dubbellagen vereist enige ervaring om de mate van bewegingen in de kamer te perfectioneren en de juiste wasintensiteit te vinden.Om PDMS-microstructuren uit gepatroneerde siliciumwafels te produceren, gebruik eerst een plastic beker om 10 gram PDMS-basis en één gram PDMS-crosslinker te wegen. Gebruik een mengapparaat om de PDMS-mix te mengen en te ontgassen. Gebruik nu een pipettip om een kleine hoeveelheid PDMS rechtstreeks op de structuur op de siliciumwafel te druppelen.Plaats onmiddellijk een 1 dekglas op de PDMS-druppel en neem het bovenste uiteinde van een schone pipettip om het dekglas voorzichtig op de siliciumwafel te drukken. De PDMS moet zich dun verspreiden tussen het dekglas en de siliciumwafel. Plaats de wafel met de dekglasjes in een oven en hard de PDMS gedurende drie tot vier uur, of een nacht, bij 75 graden Celsius.Verwijder vervolgens de wafel uit de oven en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder met een scheermesje voorzichtig het dekglas met het aangehechte PDMS van de siliciumwafel. Bevestig nu een plastic kamer aan het PDMS zoals eerder beschreven voor glas.Neem de dekglasjes met aangehecht kamer en plaats in plasmareiniger met zuurstof als het procesgas. Reinig de dekglasjes met plasma. In dit werk werd 30% vermogen en 0,3 millibar zuurstofdruk gedurende één minuut gebruikt.Bereid nu een SLB in de kamer zoals eerder beschreven op glas. Om de zelforganisatie-assay uit te voeren, pas het buffervolume in de kamer aan op 200 microliter Min-buffer, minus de hoeveelheid eiwit en ATP-oplossing. Voeg vervolgens MinD, gelabelde MinD, MinE en indien gewenst MinC toe en meng de componenten voorzichtig door te pipetten.Voeg nu 2,5 millimolair ATP toe om de zelforganisatie van MinDE te starten. Controleer gedurende de volgende 10 tot 30 minuten op regelmatige MinDE-patroonvorming en goed gevormde microstructuren op een fluorescentiemicroscoop. Wanneer regelmatige MinDE-patronen zijn gevormd, pipet omhoog en omlaag twee keer om de componenten te mengen.Verwijder het grootste deel van de buffer met een pipet van 100 microliter en verwijder ver

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates an in vitro technique to study immune synapse formation between primary human T cells and supported lipid bilayers (SLB). T cell surface proteins interact with respective ligands immobilized on SLB to form an immune synapse, followed by the movement of lytic granules towards the synapse, which is visualized using fluorescence microscopy.

An In Vitro Technique to Study T Cell Interaction with Supported Planar Lipid Bilayers

Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Hier wordt een protocol beschreven voor het genereren van lichtgereguleerde en omkeerbare eiwitpatronen met hoge spatiotemporele precisie bij kunstmatige lipidemembranen. De methode bestaat uit de gelokaliseerde fotoactivering van het eiwit iLID (verbeterd lichtinduceerbaar dimeer) geïmmobiliseerd op modelmembranen dat, onder blauw licht, bindt aan zijn partnereiwit Nano (wildtype SspB).

Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

Leer de in vitro reconstructie van zelf-organiserende MinDE-eiwitpatronen op ondersteunde lipide bilayers in PDMS-microcompartimenten. Deze methode biedt precieze controle over patroonvorming en imiteert in vivo omstandigheden.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Meer video's verkennen