Name: Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Ontdek hematopoëtische stamceltransplantatie om het maligne potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoëtische cellen te evalueren. Deze methode helpt bij het identificeren van ziekte-initiërende cellen in myelodysplastisch syndroom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health (verlenen nummers ZIA SC 010378 en BC 010983).

De dieren in dit artikel beschreven procedures door het National Cancer Institute in Bethesda Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd, en voldoen aan het beleid deel uitmaakt van het beleid op volksgezondheidsgebied Service op Humane zorg en gebruik van proefdieren, de Dierenwelzijn Act, en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. cel voorbereiding
<ol><li>Oogsten beenmerg genucleëerde cel (BMNC)<ol>
<li>Gebruik alleen steriele materialen. Herbruikbare instrumenten met behulp van een stoom-autoclaaf steriliseren. Aankoop naalden, spuiten, en plastic consumptieaardappelen in steriele recipiënten eenpersoonsgebruik. Alle dieren en cel manipulaties uitvoeren in een klasse II, Type A2 biologische veiligheid kabinet.</li>
		<li>BMNCs bereiden in een 14 mL ronde onderkant buis met 3 mL HF2 (Henks uitgebalanceerd zout oplossing aangevuld met 2% foetale runderserum).</li>
		<li>Euthanaseren C57Bl6 donor muizen (positief voor CD45-allel CD45.2), leeftijd meestal 2-6 maanden, met behulp van een CO2 -kamer.</li>
		<li>Steriliseren de muis karkas in 70% ethanol over het hele lichaam te spuiten met een spray fles. Schil de huid van de benen, uit het bekken naar de enkel.</li>
		<li>Verwijder de dijbenen en tibiae van het karkas met behulp van steriele schaar (rechte, scherp/sharp, 11,5 cm) en pincet (Graefe, gekarteld, 0.8 mm tip breedte). Trim bijgevoegde spieren duidelijk.</li>
		<li>Snij de proximale en distale uiteinden van de tibia met de schaar. Houd het onderbeen met een tang en plaats een 27-gauge 3 mL injectiespuit met 2,5 mL HF2 in de holte van de tibiale beenmerg DISTAAL eind van de tibia (enkel). Spoel de beenmergcellen van de tibia met zachte druk in de 14 mL ronde onderkant buis.<ol>
<li>Herhaal voor de andere tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Snijd de proximale en distale uiteinden van het dijbeen met een schaar. Flush de dijbeen beenmerg holte door het invoegen van een 20-gauge-naald gekoppeld aan een 3 mL spuit die 2,5 mL HF2 in het distale einde van de dijbeen beenmerg Holte en zachte druk uit te oefenen op de spuit.<ol>
<li>Herhaal voor de andere dijbeen, verzamelen van alle beenmerg van beide tibiae en dijbenen in de dezelfde 14 mL ronde onderkant buis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>De massa van het beenmerg verspreiden door zuigen op en neer meerdere malen met de dezelfde 20-gauge-naald, gekoppeld aan de 3 mL spuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antilichaam kleuring van BMNC<ol>
<li>Graaf BMNC. Voeg toe 20 µL van een azijnzuur-oplossing van 3% aan 20 µL van de ophanging van de BMNC gegenereerd in stap 1.1.8. Dan rekenen met behulp van een hemocytometer en een omgekeerde Microscoop.</li>
		<li>De BMNC pellet door zachte centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met HF2 met behulp van 90 µL per 107 cellen en voeg 10 µL van biotinyleerd anti-bloedlijn antilichaam cocktail aan de celsuspensie.</li>
		<li>Wassen na incubatie gedurende 20 minuten bij 4 ° C, de gekleurde cellen met 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Resuspendeer de BMNC met 100 µL van HF2 per 107 cellen. Voeg 2 µL van allophycocyanin (APC) geconjugeerd anti-Biotine antilichaam aan de celsuspensie, gevolgd door incubatie bij 4 ° C gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Spoel de gekleurde BMNC met 3 mL PBS en resuspendeer de BMNC met HF2 aangevuld met 0,2 µg/mL propidium jodide (PI) voor het sorteren van stroom cytometry cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stroom cytometry cel sorteren van BMNC<ol>
<li>Stroom cytometry cel sorter kalibreren. Optimaliseer alle fotomultiplicator buizen (PMTs), spreidings- en fluorescentie parameters onbevlekt cuvetten en ingesteld binnen het lineaire bereik van elke detector.</li>
		<li>Bereiden onbevlekt, PI-gekleurd en APC Label lineage cocktail cellen parallel geschakeld vanaf stap 1.2. Analyseren spectrale schadevergoeding.</li>
		<li>Doublet cellen discrimineren door sequentiële gating van FSC-H vs. SSC-H 640-WS-A vs. 640-WS-H en 640-WS-S vs. 640-WS-W.</li>
		<li>Nonviable cellen met behulp van PI opgewonden op 561 nm en emissie verzameld met een 614/20 band pass filter uit te sluiten. Excite lineage APC cellen op 640 nm en verzamelen emissie aangeduid met een 671/30 band pass filter.</li>
		<li>Fluorescentie waarden als spanning hoogte registreren en verzamelen van ten minste 100.000 gebeurtenissen in lijst modus gegevensbestanden te visualiseren van de bevolking moeten worden gesorteerd.</li>
		<li>Berekenen van de spectrale compensatie na het verwerven van drie monsters van 10.000 cellen voor het volgende: ongelabelde cellen, PI label cellen en anti-bloedlijn antilichaam cocktail geconjugeerd met APC label cellen.</li>
		<li>Drie regio's te sorteren Lineage negatieve (LN), Lineage positief (LP) met dim fluorescentie intensiteit (LP1) en LP bevolking met heldere fluorescentie (LP2) in 5 mL buisjes met 0,5 mL 10% FBS media instellen</li>
		<li>Soort cellen een één druppel omhullen en zuiveren afbreken modus.</li>
		<li>Post sorteren analyses uitvoeren met 1.000 totaal aantal cellen op elk gesorteerde monster te bevestigen de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen.</li>
		<li>Gesorteerde cellen verzamelen door centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet van de cel met 0,5 mL HF2.</li>
		<li>Bevestigen gesorteerde cel nummer met hemocytometer en Trypan blauw. Aanpassen van het aantal cellen met HF2 voor transplantatie. Opmerking: Een breed spectrum van BMNC bevolking kan worden geïsoleerd voor transplantatie met behulp van extra combinaties van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen in stap 1.2.2 hierboven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ontvangende muizen voorbereiding en hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT)
<ol><li>Voorbereiding van transplantatie ontvangers<ol>
<li>Diergeneeskunde en veehouderij verzorging congenisch ontvangende muizen (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een specifieke pathogene vrije (SPF) dier faciliteit handhaven.</li>
		<li>Verstrekken van steriel water met 100 mg/L ciprofloxacine naar de geadresseerden voor 7 dagen vóór de letale dosis (9 Gy) bestraling voor profylactische saneren van de gastro-intestinale track, en gedurende 14 dagen na bestraling.</li>
		<li>Bieden een dodelijke dosis (9 Gy) bestraling van een Cs-bron als volgt. Een opgeleide, gecertificeerde Cs-operator gebruiken. Stel het Cs source instrument te leveren 70 cGy/min totale lichaam gamma bestraling. 10 muizen plaats in een speciaal ontworpen houder en de houder aansluit op de irradiator-zaal. Leveren van bestraling van de gehele lichaam 9 Gy in 13 minuten en de muizen terug te keren naar hun kooien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hematopoietische stamceltransplantatie<ol>
<li>Meng wild type (WT) BMNC van een congenisch ontvanger muis (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een dosis van de cel van 2 x 10,5 cellen per muis met 2 tot 5 x 104 cellen van gezuiverde detest die BMNC bereid met stroom cytometry sorteren als beschreven in 1.3 hierboven. Meng cellen in dezelfde spuit. Opmerking: De WT-BMNC bieden een straling sparen-effect aan de ontvangende muis en ondersteuning voor het voortbestaan van de ontvangende muis als de test cellen ondersteunen geen Haematopoiese. De WT-BMNC gebruikt in dit type experiment uitdrukkelijke de CD45.1-allel, en dus kan worden onderscheiden van de cellen van de test met behulp van antilichamen die onderscheid tussen CD45.1 en CD45.2 maken. De WT BM cellen worden aangeduid als "helper cellen", "straling-sparend cellen" of "concurrent cellen".</li>
		<li>Stel het volume mengsel cel naar 200 µL per geadresseerde met steriele HF2 voor het vergemakkelijken van de injectie.</li>
		<li>Overplanten de mengsels van de cel aan de dodelijk bestraalde ontvangende muizen via intraveneuze staart veneuze injectie met 1 mL spuit en naald 28-gauge, binnen de 24u van bestraling. Plaats de muis staart onder een warmte lamp, zoals warmte leidt tot staart veneuze dilatatie. Opmerking: Euthanaseren van alle de ontvangende muizen aan het einde van de studie en de progressie van de ziekte door necropsie, histologie en stroom cytometry te evalueren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. engraftment-Assay met behulp van Stroom Cytometry
<ol><li>Verzamelen om te beoordelen donor cel engraftment, perifeer bloed (PB) van de ontvangende muizen op 6de week, 12e week en 16e week na de transplantatie.</li>
	<li>Warm de geadresseerden in de kooi met warmte lamp voor ongeveer 1 minuut en plaats van de muis in een afdekking.</li>
	<li>Snijd de ader van de staart met een scalpel (mes 10, #3 scalpel handvat) en het verzamelen van 100 µL van PB per geadresseerde met een microcapillary-buis met EDTA als een antistollingsmiddel.</li>
	<li>De verzamelde PB in twee gelijke aliquots verdelen door het plaatsen van 50 µL in een steriele microcentrifuge buis. Gebruik één aliquot voor een geautomatiseerde complete blood count (CBC) (uitgevoerd de NCI histopathologie kern) en gebruik het tweede monster voor antilichaam kleuring en stroom cytometry.</li>
	<li>U wilt opsporen donor engraftment door stroom cytometry, lyse de rode bloedcellen (RBC) door toevoeging van 1 mL hypotone RBC lysis-buffermengsel (8.29 g/L van NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0.037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) aan 50 µL van de verzamelde PB. Vortex het monster te mengen en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Centrifugeer het lysed PB bij 4.600 x g voor 1,5 min. zorgvuldig gecombineerd het supernatant en gooi deze weg.</li>
	<li>Gedeeltelijk de cel pellet te verstoren door zachtjes te tikken of "flicking" de onderkant van de buis. Voeg in de pellet 1.3 mL PBS gelegen in buis en centrifugeer bij 4.600 x g gedurende 1,5 min. zorgvuldig aspirate en gooi het supernatant.</li>
	<li>De cel pellet te verstoren door te tikken of flicking, en voeg 200 µL van HF2 aangevuld met 5% rat serum om de cel-pellet.</li>
	<li>Toevoegen van anti-CD45.2 antistof (1 µL) geconjugeerd met allophycocyanin (APC) naar de celsuspensie. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten, en kort vortex het mengsel.</li>
	<li>Na de kleuring, wassen van de cellen tweemaal zoals hierboven beschreven en resuspendeer met 400 µL van HF2 aangevuld met 1 µg/mL PI.</li>
	<li>Engraftment met behulp van een 4-kleurige stroom cytometer detecteren. Het verkrijgen van aanvullende informatie over de soorten van de cellen in het perifere bloed door toevoeging van extra antilichamen op te sporen specifieke celtypen, zoals B of T-lymfocyten.</li>
	<li>Seriële engraftment gegevens met behulp van een spreadsheet voor verdere analyse van de gegevens.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

MDS weliswaar een stoornis klonale hematopoietische stamcellen, de MDS "stammen" of initiatiefnemende cellen, hebben nog niet gekenmerkt. Wij eerder aangetoond dat MDS kunt transplanteerbaar aan WT muizen met behulp van het beenmerg van NHD13 muizen door HSCT, gekenmerkt door macrocytische anemie, leukopenie, neutropenie en morfologische bewijs van dysplasie15. Bovendien, concurrerende herbevolking tests geïdentificeerd een voordeel van de groei van cellen uit het beenmerg van NHD13 MDS. Deze bevi...

Myelodysplastic syndromes (MDS) vertegenwoordigen een gevarieerde set van klonen bloed stoornissen, gekenmerkt door ineffectieve Haematopoiese, morfologische bewijs van dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute myeloïde leukemie (AML)1,2 ,3,4. Ineffectieve Haematopoiese is erkend als een arrestatie van de rijping in het beenmerg en resultaten in perifeer bloed cytopenias ondanks een hypercellular beenmerg1,3. De incidentie van MDS meermalen heeft geraamd als 2-12 gevallen per 100.000 personen per jaar in de Verenigde Staten, en de incidentie van MDS toeneemt met de leeftijd, waardoor dit een belangrijke voorwaarde om te begrijpen gezien de veroudering van de Amerikaanse bevolking3, 5. Hoewel de meeste gevallen van MDS geen duidelijke etiologie hebben, worden sommige gevallen van MDS verondersteld te wijten aan de blootstelling aan bekende genotoxische agentia, met inbegrip van oplosmiddelen, zoals benzeen, en kanker chemotherapie6.
MDS-patiënten kunnen mutaties in de MDS cellen7meestal hebben verworven. Hoewel relatief zeldzaam, hebben een aantal MDS-patiënten verworven evenwichtige chromosomale translocaties waarbij genen zoals NUP98, EVI1, RUNX1 en MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Ons laboratorium heeft een jarenlange interesse in chromosoom translocaties, waarbij de NUP98 gen8. Transgene muizen dat uitdrukkelijk een transgenic NUP98-HOXD13 (NHD13) geregeld door de promotor van de Vav1 en enhancer elementen alle van de belangrijkste functies van MDS, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, morfologische bewijs van dysplasie en transformatie naar AML9 tonen .
Hoewel MDS voor meer dan 60 jaar10zijn bekroond, en worden beschouwd als een stoornis van de cel van de stam van de klonen, inspanningen om de engraft van menselijke MDS cel in immunodeficiëntie muizen geweest grotendeels mislukte, omdat de MDS cellen slecht11, engraft 12,13,14 en de muizen niet klinische ziekte ontwikkelen. In een poging om te identificeren welke hematopoietische cellen kunnen overbrengen MDS, we wendde zich tot het NHD13-model, en toonde dat we MDS als een ziekte-entiteit die alle kardinaal functies van menselijke MDS engraft konden toonde, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, heupdysplasie, en transformatie naar AML15. In dit rapport presenteren we de technische details van deze experimenten, alsmede risicobeheersingsmethoden naar verdere fractionate van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPC), in een poging om de MDS-initiëren cellen opsporen.

<table><tbody><tr><td>14 mL rondbodembuisje</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's gebalanceerde zout oplossing</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 antilichaam</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL Spuit</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>27-G naald</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>20-G naald</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anti-Biotin antilichamen</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL Spuit</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Insulinspuit</td></tr><tr><td>Verwarmingslamp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACS-apparaat</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 lasers, 5 kleurendetectoren</td></tr><tr><td>FACS-sorteerapparaat</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 lasers, 23 parameters, 6 populaties sorteren gelijktijdig</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gammastralingsinstallatie</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Bloedopvangbuis</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Ontvangermuizen</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 muizen</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Colonie gehandhaafd bij NIH</td></tr><tr><td>5 mL rondbodembuisje</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) zijn een diverse groep van hematopoietische stamcellen aandoeningen die zijn gedefinieerd door ineffectieve Haematopoiese, perifeer bloed cytopenias dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute leukemie. NUP98-HOXD13 (NHD13)-transgene muizen recapituleren menselijke MDS in termen van perifeer bloed cytopenias, dysplasie en transformatie naar acute leukemie. Wij zijn het er eerder blijk gegeven dat MDS kunnen worden overgebracht van een genetisch gemanipuleerde muis met MDS naar wild-type ontvangers door het transplanteren van MDS nucleated beenmergcellen (BMNC). Om meer duidelijk te begrijpen de MDS-cel van oorsprong, hebben we benaderingen transplantatie specifieke, immunophenotypically gedefinieerd hematopoietische deelverzamelingen. In dit artikel beschrijven we het proces van isoleren en verplanten specifieke populaties van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen. Na transplantatie beschrijven we benaderingen om de efficiëntie van transplantatie en persistentie van de cellen van de MDS donor te beoordelen.

Wij tonen de representatieve cijfers voor resultaten van verschillende experimenten. Figuur 1 toont een representatieve stroom cytometry sorteren experiment. Tijdens normale hematopoietische differentiatie, cellen naarmate zet zich in voor een specifieke hematopoietische bloedlijn, ze verwerven lineage-definiëren cel oppervlakte markeringen en verliezen van de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing. Daarom, in wild-type muizen, zelf-vernieuwing van stamcellen is...

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een paar vragen in de methode van maligniteit veld over karakterisering van een cel die een maligniteit initiëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een basis biedt voor de functionele analyse van deze kankercellen. De implicaties van deze techniek gaan naar waar de therapie van myelodysplastische syndromen of MDS, omdat het kan helpen bij de identificatie van de ziekte initiërende cellen.Ter voorbereiding van de ontvangers op adoptieoverdracht, levert een week voor de transplantatie steriel water dat wordt aangevuld met 100 milligram per liter ciprofloxatine gedurende zeven dagen aan congene ontvangende DIEREN gedurende zeven dagen in een specifieke, ziekteverwekkervrije dierenvoorziening. Op de zevende dag, hebben een getrainde, gecertificeerde cesium 17 operator stel het cesium bron instrument om 70 centigrays van de totale body gamma bestraling per minuut te leveren. Plaats 10 muizen in een op maat ontworpen houder.Steek de houder in de bestralingskamer, lever 9 grijstinten totale lichaamstraling in 13 minuten. Breng de dieren dan terug naar hun kooien. De volgende ochtend, spray 70 procent ethanol over een hele twee tot zes mot oude C57 zwarte zes muis en gebruik schaar om de huid te verwijderen van het bekken naar de enkels.Gebruik tangen met de schaar om de femora en tibiae te verwijderen. Netjes trim de spieren van de botten. Snijd de proximale en distale uiteinden voor de tibiae en pak een scheenbeen met tangen.Steek een drie milliliter spuit uitgerust met een 27 gage naald in de beenmergholte en spoel het beenmerg in een 14 milliliter ronde bodembuis met 2,5 milliliter Hanks gebufferde zoutoplossing aangevuld met 2%foetale runderserum of HF2. Wanneer al het merg is verzameld, aspirate het weefsel meerdere malen door de 20 gage naald tip om de merg massa te verspreiden in een enkele suspensie voor het tellen. Om de beenmergkerncellen, of BMNC, te etiketteren voor het sorteren van de stroom, verzamelt u de cellen door centrifugalisatie en schorten u de pellet één keer tien tot de zevende BMNC per 90 microliter van HF2-concentratie op.Voeg vervolgens tien microliters van een biotinylated, anti-lijn antilichaam cocktail toe aan de celsuspensie gedurende 20 minuten incubatie bij 4 graden Celsius. Gevolgd door een centrifuge wassen in drie milliliter PBS. Stel de pellet opnieuw op in 100 microliter HF2 per een keer tien tot de zevende cellen.Ten tweede labelen de cellen met twee microliters van APC geconjugeerd anti biotine antilichaam. Na 20 minuets op vier graden Celsius, beschermd tegen licht, was de cellen in drie milliliter verse PBS. Stel de pellet in HF2 opnieuw op, aangevuld met 0,2 microgram per milliliter propidiumjodide op ijs.Kalibreer nu de stroomcytometriecelsorteerder met behulp van niet-gekleurde cellen om alle fotomultiplierbuizen, verstrooiings- en fluorescentieparameters binnen het lineaire bereik van elke detector te optimaliseren. Verkrijg drie monsters van 10.000 cellen voor de niet-gelabelde, PI-gelabelde en anti-lijn APC-gelabelde cellen. Analyseer aan het einde van het soort 1.000 cellen van elk monster om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen te bevestigen.Draai de monsters in de centrifuge. Dan opnieuw opschorten de pellets in 0,5 milliliter HF2 voor het tellen. Voor adoptieoverdracht van de gesorteerde cellen, meng 100 microliter van twee keer de naar de vijfde wilde-type BMNC van een con geniale ontvanger dier in steriele HF2.Met 100 microliter van twee tot vijf keer tien tot de vierde de gesorteerde donor BMNC van belang in steriele HF2 in een microcentrifuge buis per ontvanger dier. Laad een een milliliter spuit, uitgerust met een 28 gage per ontvanger met 200 microliter cellen. Plaats vervolgens de ontvangende muizen onder een warmtelamp om staartaderdilatatie te induceren.Lever de celmengsels aan elk dodelijk bestraald ontvangend dier via de staartader. Aangezien stamcel zelfvernieuwing is beperkt tot afstamming negatieve wild-type BMNC, afstamming negatieve, lage lijn positieve, en hoge lijn positieve cellen worden gesorteerd en getransplanteerd in wild-type ontvangers om de zelfvernieuwing capaciteit van elke cel populatie te bepalen. Adoptief getransplanteerde donortrans genetische BMNC van MDS modeldieren kunnen ex vivo onderscheiden door hun CD45.2 cel oppervlak marker expressie.Door 16 weken na transplantatie van afstamming negatieve BNMC, of ongesorteerde BMNC van transgene MDS donordieren, de transgene cellen uit concurreren met de wild-type cellen zoals blijkt uit een toenemend percentage van CD45.2 positieve donorcellen, waargenomen in het perifere bloed van de dodelijk bestraalde ontvangende dieren. Hier worden cellen van een leukemische transformatie van een muis die met transgene cellen MDS wordt getransplanteerd getoond. Let op de aanwezigheid van talrijke ontploffingen en onvolwassen vormen.Tijdens een poging tot de procedure, is het belangrijk om te onthouden om de tijd van ex vivo manipulatie te beperken, omdat het onnodige stress op de cellen kan plaatsen, wat resulteert in celdood of functioneel verlies. Na de ontwikkeling van deze techniek effent de weg voor de onderzoekers in het veld programma, voor het aanbrengen van maligniteit om de bron van de ziekte in genetisch gemanipuleerde muizen te verkennen.

use-hematopoietic-stem-cell-transplantation-to-assess-origin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Ontdek hematopoëtische stamceltransplantatie om het maligne potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoëtische cellen te evalueren. Deze methode helpt bij het identificeren van ziekte-initiërende cellen in myelodysplastisch syndroom.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Meer video's verkennen