Name: Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer een proximale cultuurmethode om paracrine signalen tussen eierstokkankercellen en het tumor-micro-omgeving te bestuderen. Deze eenvoudige, reproduceerbare techniek isoleert paracrine effecten zonder direct celcontact.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dank verschuldigd aan de patiënten voor hun deelname aan de collectie van het weefsel voor deze experimenten. Dit onderzoek wordt ondersteund door een DoD OCRP ovariële kanker Academy Award (W81XWH-15-0253) en een pilot van Colleen de Dream Foundation naar Anirban K. Mitra.

Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele regelgevende bestuur van Indiana University.
1. cel voorbereiding
<ol><li>
Isolatie en cultuur van menselijke primaire mesothelial cellen
	<ol>
<li>Isoleren menselijke primaire mesothelial cellen (HPMCs) van menselijke majus zoals eerder beschreven17,18 en groeien ze in voltooien groeimedium [Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met de foetale runderserum 10%, 1% penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, en 1% vitamines] bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: De HPMCs worden meestal gekweekt tot 100% samenkomst (figuur 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groei omstandigheden van ovariële kankercellen
	<ol>
<li>Groeien HeyA8 ovariale kankercellen in volledige groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: Gebruik HeyA8 cellen gegroeid tot ongeveer 80% samenvloeiing (figuur 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de celkweek
<ol><li>
Proximale cultuur set-up
	<ol>
<li>Gebruik Transwell wordt ingevoegd voor 6-Wells-platen met een 10 μm dik weefsel-cultuur-testgroep polycarbonaat membraan met 0.4 μm poriën (108 poriën/cm2) en een 4,67 cm2 groei-gebied. Indien nodig, optimaliseren voor verschillende invoegen maten door schalen van het aantal cellen ontpit volgens de oppervlakte groei. Warme volledige groeimedium, trypsine en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 ° C vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de inserts
	<ol>
<li>Om het zaad van de cellen van de HeyA8 op het onderste oppervlak van het membraan van het invoegen, verwijderen de invoegen uit de verpakking met steriel pincet en plaats deze omgekeerd in een steriele 15 cm cultuur schotel.</li>
		<li>Gebruik een 15 cm schotel, zoals zij de diepte heeft tot aan de omgekeerde invoegen, of het vervangen van een willekeurige passend steriele container. Afhankelijk van het experiment, plaatst u het vereiste aantal inzetstukken in de 15 cm schotel.</li>
		<li>De drie besturingselementen en drie proefomstandigheden dienovereenkomstig label met een marker op de rand van de inserts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de kankercellen
	<ol>
<li>Trypsinize van de cellen van de HeyA8 geteeld op 80% samenvloeiing in een maatkolf van 25 cm2 (~ 2 x 106 cellen), voeg 1 mL trypsine (0,25%) voor 40-60-s en neutraliseren van de trypsine met 6 mL volledige groeimedium.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL volledige groeimedium. Tellen de levende cellen met behulp van de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zaaien van de kankercellen
	<ol>
<li>Schorten 100.000 cellen/mL van levende cellen van de HeyA8 in volledige groeimedium. Zorgvuldig zaad 80.000 HeyA8 cellen gesuspendeerd in 800 μL van volledige groeimedium op de bodem van de insert (waarmee nu wordt geconfronteerd, omdat het is omgekeerd).</li>
		<li>Het zaad van de cellen een koepelvormige vorm, zodat de cellen op de insert (Figuur 1 c blijven). Start vanaf het midden van het membraan en naar buiten gaan in concentrische cirkels terwijl langzaam pipetteren. Vermijd gaande van meer dan 3 mm van de rand om te voorkomen dat eventuele morsen van het medium. Opmerking: Het aantal cellen ontpit zal afhangen van de groei van de cellen en de duur van het experiment. Het aantal HeyA8 cellen zaadjes voor deze proximale cultuur werden geoptimaliseerd en de cellen zullen 80 – 90% heuvels aan het einde van de derde dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kanker cel bijlage
	<ol>
<li>Dekking van de 15 cm schotel en de schotel met de inserts voor de CO2 incubator zorgvuldig te verplaatsen. Het is van cruciaal belang niet te verstoren de druppel medium en cellen op de insert bij deze stap. Laat de cellen bij 37 ° C gedurende 4 uur om de kankercellen te hechten aan de invoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de mesothelial cellen
	<ol>
<li>Na ongeveer 4 uur, trypsinize de HPMCs geteeld op 100% samenvloeiing in een 75 cm2 kolf (~ 4 x 106 cellen) met 2 mL trypsine (0,25%) voor 1-2 min en neutraliseren van de trypsine met 12 mL volledige groeimedium.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij RT gedurende 3 minuten, resuspendeer de pellet cel in 10 mL volledige groeimedium, en tellen van de levende cellen met behulp van de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De mesothelial cellen zaaien
	<ol>
<li>Schorten 300.000 cellen/mL van levende HPMCs in volledige groeimedium. 2,5 mL verse volledige groei media toevoegen aan elk putje van de plaat van een 6-well. Breng zorgvuldig de 15 cm schotel met de inserts uit aan de kap van de bioveiligheid. Met behulp van steriele pincet, spiegelen het invoegen en plaats deze in de put van de 6-well plaat zodat het rechtop, met de cellen van de HeyA8 gekoppeld aan de lagere oppervlakte ondergedompeld in het volledige groeimedium (Figuur 1 c).</li>
		<li>Zaad 450.000 HPMCs geschorst in 1,5 mL groeimedium in de binnenkant van de inzetstukken met de cellen van de HeyA8 aan het oppervlak geconfronteerd met de bodem van de put (Figuur 1 c) of aan inzetstukken zonder alle cellen van de HeyA8 voor de besturingselementen HPMC gekoppeld. Voeg 1,5 mL groeimedium zonder cellen aan de controles van de HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groeien de proximale cultuur
	<ol>
<li>Laat de proximale cultuur groeien in de incubator van de CO-2 bij 37 ° C en 5% CO2 voor 72 uur. Indien nodig, kan het medium kan als volgt worden bijgevuld.<ol>
<li>Voor de binnenkant van het invoegen, verwijderen van 750 µL en voeg 750 µL van verse volledige groeimedium.</li>
			<li>Voor de buitenkant van de insert (de 6-well-plate), verwijderen van 1 mL en voeg 1 mL verse volledige groeimedium. De 1 mL werd gekozen voor het gemak van het wijzigen van het medium in één stap. Indien gewenst, kan 1,25 mL worden verwijderd en in plaats daarvan vervangen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het verzamelen van de cellen
	<ol>
<li>De cellen verzamelen na 72 uur van proximale cultuur. Wees extra voorzichtig bij deze stap ter voorkoming van kruisbesmetting van de HeyA8 cellen en HPMCs. Trypsinize de cellen, centrifugeer ze en lyse van de pellet in plaats van het lysing van cellen op het membraan om een cross-besmetting te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing van de cellen
	<ol>
<li>Spoel van beide zijden van de insert met 1 x PBS.</li>
		<li>De inserts overbrengen in een nieuwe put en trypsine toe te voegen. Voeg 0,5 mL trypsine aan de binnenkant van het donormateriaal en voeg 2 mL trypsine aan de 6-well plaat aan de trypsinize van de kankercellen die is gekoppeld aan het onderste oppervlak van het donormateriaal. Incubeer de plaat gedurende 2 minuten bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralisering van de trypsine
	<ol>
<li>Voeg 1 mL volledige groeimedium aan de binnenkant van de insert te neutraliseren de trypsine, Pipetteer op en neer, en vervolgens nemen de cellen en deze overbrengen naar een gelabelde collectie buis. Voeg een extra 2 mL volledige groeimedium voor een volledige neutralisatie. Niet te doorboren het membraan terwijl pipetteren om te voorkomen dat een kruisbesmetting van de cellen moet worden gezorgd.</li>
		<li>Pipetteer verzamelen de cellen op de bodem van de insert, de 2 mL trypsine die is toegevoegd in stap 12.2 op de onderkant 2 – 3 x zodat de cellen in de bodem van de 6-well-plaat vallen. Neutraliseren van de trypsine op de onderkant van de plaat met 6 mL groeimedium en overbrengen van de inhoud van de plaat naar een gelabelde collectie buis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzamelen en lysing van cellen
	<ol>
<li>Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 3 minuten en de media gecombineerd. Resuspendeer en lyse van de cel pellets met 0,7 mL van fenol en guanidine kaliumthiocyanaat-gebaseerde lysis reagens voor de extractie van RNA. Isoleren met behulp van een geschikte kit RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kwantitatieve Real-time polymerasekettingreactie
Opmerking: De volgende stappen beschrijven een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) om te studeren de gene expressies veranderingen als gevolg van de proximale cultuur.
<ol><li>CDNA van de RNA-monsters voorbereiden op qPCR. Gebruik geschikte reverse-transcriptase met een overeenkomstige buffer en willekeurige inleidingen om de omgekeerde transcriptie van alle mRNA (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Beoordeelt de wijzigingen in de mRNA niveaus van de expressie van fibronectine (FN1) en E-cadherine (CDH1) en transformeren groeifactor bèta 1 (TGFβ1) door qPCR met glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) als een interne controle. Het is mogelijk om het gebruik van gestandaardiseerde verkrijgbare gen expressie testen (Zie Tabel van materialen) of te ontwerpen van inleidingen.</li>
	<li>Vergelijk de HeyA8 cellen gekweekt in proximale cultuur met HPMCs met de controles van de HeyA8 en de HPMCs geteeld in proximale cultuur met de HPMC controles.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inzicht van het mechanisme van paracrine en juxtacrine signalen tussen cellen is essentieel voor de ontwikkeling van een betere kennis van de normale weefsel homeostase en ziekte voorwaarden7,8. De meeste paracrine signalering onderzoeken worden uitgevoerd door het verzamelen van geconditioneerd medium uit één celtype en het gebruik ervan voor de behandeling van het andere celtype. Deze methode heeft een voordeel in zijn inherente eenvoud. Echter, het is niet nau...

De rol van productieve wederzijdse interactie tussen kankercellen en de communicatie van de tumor in de tumor progressie is goed opgezet en is uitgegroeid tot een belangrijk aandachtspunt voor onderzoek naar kanker biologie1. Soortgelijke gevallen van bidirectionele signalering zijn van cruciaal belang tijdens wond genezing, immuunresponsen, angiogenese, stamcel niches, en tijdens ontwikkeling2,3,4,5,6 , 7 , 8. een gemeenschappelijk thema in al deze biologische processen is dat de cellen reageren op verschillende manieren te extracellulaire signalen van hun communicatie die bepalen het lot van de cel, weefsel fysiologie en progressie van de ziekte. Daarom heeft de focus steeds gedraaid naar het ontwikkelen van een beter inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke cel-cel communicatie. Een meerderheid van dergelijke interacties betrekken paracrine of juxtacrine signalen tussen cellen. Paracrine signalering impliceert de secretie van specifieke signalering factoren met één cel die worden waargenomen door de bijbehorende receptoren op een andere cel in de nabijheid, triggering van een reactie in het9,10, overwegende dat juxtacrine signalering vereist rechtstreeks contact tussen cellulaire componenten van de twee cellen betrokken11,12.
Dergelijke signalering is een essentieel onderdeel in de weefsel homeostase, evenals in de communicatie van de tumor. De kankercellen profiteren van paracrine en juxtacrine factoren van cellen in het stroma tumor, met inbegrip van kanker-geassocieerde fibroblasten (IGFA), immune cellen en adipocytes13,14,15,16. De paracrine signalering kan worden bemiddeld door groeifactoren cytokines, chemokines, enz., terwijl de juxtacrine signalering omvat naast elkaar geplaatste liganden en receptoren zoals in Notch signalering, of interacties tussen integrins en hun respectieve extracellulaire matrix eiwitten. We hebben aangetoond dat het belang van wederzijdse interactie tussen ovariale kankercellen en IGFA in tumor progressie en metastase14. Ook reguleren de interacties van metastaserende ovariale kankercellen met de mesothelial cellen die betrekking hebben op de site van metastase belangrijke microRNAs en transcriptiefactoren in de kankercellen die bevordering van metastatische kolonisatie17, 18.
De meeste studies over paracrine signalering betrekking hebben op het gebruik van een geconditioneerde medium verzameld uit één celtype voor de behandeling van de tweede celtype met. Terwijl deze aanpak wijd verbeid gebruikt is, het niet efficiënt gerepliceerd de gelokaliseerde high-concentratieniveaus van de secreted factor in de communicatie van de ontvangende cel. Ook er niet in slaagt te reproduceren de kinetiek van de continue stroom van de secreted factor wordt geproduceerd door één cel en ontvangen door de naburige cel. Paracrine signalering is effectief over korte afstanden, zoals de secreted factoren bij de vereiste concentraties alleen in de nabijheid van de broncel zijn en zijn meestal diffuus en Verdun uit als de afstand toeneemt. Deze gelokaliseerde hoge concentratie van de secreted factor is essentieel om te leiden tot een reactie in de cel receptor. Bovendien is de reactie in de ontvangende cellen ook afhankelijk van de balans tussen nieuw secreted factoren en hun continue uitputting door afbraak, binding en toerekening in de ontvangende cellen en de verspreiding van de broncel. Geconditioneerde medium kan worden geconcentreerd op de hogere gelokaliseerde concentraties aanwezig in de communicatie voor hun rekening, maar die niet nauwkeurig de exacte concentratie te repliceren. Bovendien, het kan niet bootsen de natuurlijke kinetiek van productie en uitputting van de factor betrokken. Om nauwkeuriger repliceren paracrine signalering en scheiden van juxtacrine signalering mechanismen, hebben we een nieuwe proximale cultuur-methode, waarbij de twee celtypes op beide oppervlak van een poreuze membraan groeiende bedacht. De poriën zijn klein genoeg om te voorkomen dat juxtacrine interacties en toch toe de uitwisseling van secreted factoren bij gelokaliseerde hoge concentraties. Op die manier behoudt dit systeem de kinetiek van de productie en de uitputting van de paracrine factoren.

<table><tbody><tr><td>24 mm Transwell permeabele ondersteuning met 0,4 &micro;m Pore Polycarbonaatmembraan Insert</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull; 10 &micro;m dikke transparante polycarbonaatmembraan &bull; Behandeld voor optimale celbevestiging &bull; Verpakt 6 inserts in een 6 wel plate, 4 platen per pakket &bull; Membraan moet worden gekleurd voor zichtbaarheid van cellen &bull; Gesteriliseerd door gammastraling</td></tr><tr><td>6 wel plate</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Vlakke bodem, TC-behandeld, steriel, met deksel</td></tr><tr><td>15 cm kweekbakje</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Steriele, TC-behandelde Celkweekbakje</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niet-essentiële aminozuren</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminen</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsine, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td></td><td></td><td>Elke merk is prima</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td></td><td></td><td>Elke merk is prima</td></tr><tr><td>Biosafety niveau II kast</td><td></td><td></td><td>Elke merk is prima</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Gen Expressie Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan Gen Expressie Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan Gen Expressie Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan Gen Expressie Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini RNA isolatie Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 ovariële kankercellen</td><td>Verkregen van Ernst Lengyel Lab, Universiteit van Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; Neutraliserend Antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

een proximale cultuur methode om te studeren paracrine signalen tussen cellen

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Paracrine of juxtacrine signalering bemiddelt dergelijke interacties. Het gebruik van een geconditioneerde medium en coculture studies zijn de meest voorkomende methoden te discrimineren tussen deze twee soorten interacties. Echter het effect van gelokaliseerde hoge concentraties van secreted factoren in de communicatie tijdens de paracrine interactie is niet nauwkeurig gerecapituleerd door geconditioneerde medium en, dus, kan leiden tot onnauwkeurige conclusies. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een proximale cultuur methode om te studeren paracrine signalering bedacht. De twee celtypes worden gekweekt op een oppervlak van een 10 µm dik polycarbonaat membraan met 0.4 µm poriën. De poriën kunnen de uitwisseling van secreted factoren en, tegelijkertijd, remmen juxtacrine signalering. De cellen kunnen worden verzameld en aan het eindpunt om de effecten van de paracrine signalering lysed. Deze methode is naast voor gelokaliseerde concentratie gradiënten van secreted factoren, vatbaar voor experimenten met langere periodes van cultuur, alsmede het gebruik van remmers. Terwijl wij deze methode gebruiken om te studeren van de interacties tussen ovariale kankercellen en de mesothelial cellen die ze op de site van metastase tegenkomen, kan het worden aangepast aan elke twee aanhangend celtypes voor onderzoekers te bestuderen paracrine signalering in verschillende gebieden, inclusief tumor communicatie, immunologie en ontwikkeling.

Metastaserende ovariale kankercellen tegenkomen mesothelial cellen op de site van metastase binnen de peritoneale holte19. Productieve paracrine en juxtacrine interacties met de hulp van de mesothelial cellen in inducerende adaptieve reacties in de ovariale kankercellen, die het mogelijk succesvol metastase17,18,20,21 maken . Om te testen...

Paracrine en juxtacrine cellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Hier, wordt een proximale cultuur-methode gebruikt om te studeren paracrine signalering waar de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren terwijl het voorkomen van rechtstreekse cellulaire contacten worden onderhouden.

Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van intercellulaire communicatie over wederzijdse paracriene versus juxtacriene interacties tussen twee soorten cellen. Het grote voordeel van deze methode is dat het een zeer eenvoudige en reproduceerbare techniek is die paracriene signalering nauwkeurig vastlegt onder typische kweekcondities, terwijl het tegelijkertijd effectieve juxtacriene signalering voorkomt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een beter begrip van het mechanisme van de crosstalk tussen de kankercellen en de tumormicro-omgeving.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de interacties tussen de kankercellen en het tumorstroma, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals wondgenezing en angiogenese. Begin met het losmaken van de eierstokkankercellen van een 80% confluent mengsel met één milliliter 0,25% trypsine gedurende 40 tot 60 seconden, gevolgd door neutralisatie van de reactie met zes milliliters compleet groeimedium. Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet in vijf milliliter vers compleet groeimedium.Na het tellen, verdun de cellen tot een concentratie van 100.000 eierstokkankercellen per milliliter compleet groeimedium en plaats drie omgekeerde 0,4 micrometer poreuze weefselkweekbehandelde polycarbonaatmembraan cellenkweek inserts per experimentele conditie in een passend gedimensioneerde steriele weefselkweek schaal. Label de inserts volgens de experimentele conditie en pipetteer voorzichtig de kankercellen in concentrische cirkels op de bodem van elke inzet, beginnend vanaf het midden van het membraan en naar buiten toe bewegend om een 800 microliter koepel te vormen. Wees uiterst voorzichtig bij het zaaien van de cellen op het onderoppervlak van de inzet, zodat de koepel van het medium dat cellen bevat niet tijdens de incubatie van de randen van de inzet afloopt.Wanneer alle inserts zijn gezaaid, bedek de schaal en plaats de inserts voorzichtig in de cellenkweek incubator. Na ongeveer vier uur, los de HPMC met twee milliliter 0,25% trypsine gedurende één tot twee minuten, gevolgd door neutralisatie van de reactie met 12 milliliters compleet groeimedium. Verzamel de HPMC door centrifugatie en suspendeer het pellet in 10 milliliters compleet groeimedium voor het tellen.Verdun de cellen tot een concentratie van 300.000 HPMC per milliliter compleet groeimedium en voeg 2,5 milliliter vers compleet groeimedium toe aan elke put van een zes-putten kweekplaat. Gebruik steriele pincetten om elke inzet met de rechterkant naar boven in elke put van de zes-putten plaat te plaatsen, zodat de onderste aangehechte oppervlakken van de eierstokkankercellen in het medium worden ondergedompeld. Zaai vervolgens 1,5 milliliter HPMC in de put van elke inzet.Plaats vervolgens de plaat in de cellenkweek incubator gedurende 72 uur. Aan het einde van de incubatie, verwijder voorzichtig de inserts uit elke put en spoel beide zijden van de inserts met PBS. Plaats elke inzet in een nieuwe zes-putten plaat en voeg 0,5 milliliter trypsine toe aan de insertputten en twee milliliters trypsine aan de bodemputten.Na twee minuten bij 37 graden Celsius, voeg een milliliter compleet groeimedium toe aan elke inzet en pipetteer de oplossing voorzichtig een paar keer zonder de membraan te scheuren of de celsuspensie in de onderliggende put te morsen. Tijdens het pipetteren moet erop worden gelet dat de cellen niet kruisbesmetting van de ene kamer met de andere veroorzaken. Breng de gesuspendeerde cellen over in een gelabelde opvangbuis en neutraliseer het trypsine verder met nog eens twee milliliter compleet groeimedium.Om de cellen op de bodem van de inserts te verzamelen, spoel de bodems van de membranen twee tot drie keer met de twee milliliter trypsine van de corresponderende put van de zes-putten plaat, zodat de losgekomen cellen in de juiste putbodems worden opgevangen. Wanneer alle cellen zijn losgemaakt, neutraliseer het trypsine in elke put met zes milliliter vers groeimedium en breng de celsuspensies over in gelabelde opvangbuizen. Verzamel vervolgens alle cellen door centrifugatie en suspendeer de pellets in 0,7 milliliter fenol en guanidine thiocyanaat-gebaseerde lysisreagens per buis voor RNA-extractie en -isolatie volgens standaardprotocollen.Proximale kweek van HPMC met eierstokkankercellen resulteert in een verhoogde expressie van fibronectine en Transforming Growth Factor of TGF beta één vergeleken met controle HPMC gezaaid op inserts in afwezigheid van kankercellen. De expressie van zowel fibronectine als TGF beta één neemt ook significant toe in eierstokkankercellen bij proximale kweek met HPMC's vergeleken met controle eierstokkankercellen gekweekt in afwezigheid van HPMC. Omgekeerd vertonen eierstokkankercellen behandeld met HPMC geconditioneerd medium een significant verminderde fibronectine expressie zonder verandering in TGF beta één expressie.Blokking van TGF beta één met een neutraliserend antilichaam resulteert echter in een significante afname van TGF beta één expressie in eierstokkankercellen bij proximale kweek met HPMC's. Interessant is dat een lichte toename in TGF beta één expressie wordt waargenomen in controle niet-proximaal gekweekte eierstokkankercellen, waarschijnlijk als een compensatoire reactie. Proximale kweek met eierstokkankercellen verhoogt de E-cadherine expressie in HPMC's licht terwijl een duidelijke afname van E-cadherine wordt waargenomen in eierstokkankercellen die in de nabijheid van HPMC's worden gekweekt vergeleken met controles, wat verder de effectiviteit van het proximale kweeksysteem aantoont voor het bestuderen van paracriene signalering tussen eierstokkankercellen en normale cellen op de plaats van metastase.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het aantal gezaaide cellen en de duur van de proximale kweek te optimaliseren. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals immunoblotting worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de veranderingen in eiwitexpressie en de activering van downstream signaaltransductieroutes tijdens de co-cultuur van tumorcellen en mesotheelcellen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van tumormicro-omgeving, immunologie en ontwikkelingsbiologie om wederzijdse paracriene interacties tussen cell

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we develop a proximal co-culture model of ovarian cancer cells and primary human mesothelial cells. This physiologically relevant model allows the study of paracrine signaling, where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Proximal Culture System: An In Vitro Culture Technique to  Study Paracrine Signaling Between Cells

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.

Een cel cultuur Model van weerstand slagaders

We presenteren een protocol om te onderzoeken de Overspraak tussen Caco-2 X-Vleug-bestraalde en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het protocol start met Caco-2 bestraling en opzet van de co cultuur met PBMC; trans-epitheliale elektrische weerstand is vervolgens regelmatig gedurende 48 h en westelijke vlek uitgevoerd in zowel Caco-2 en PBMC gemeten.

Een co cultuur methode te onderzoeken de Overspraak tussen X-ray bestraald Caco-2 cellen en PBMC

Wij bieden protocollen voor evaluatie van mesenchymale stamcellen van tandmerg geïsoleerd en prostaatkanker cel interacties op basis van directe en indirecte co kweekmethoden. Voorwaarde medium en trans-well membranen zijn geschikt voor het analyseren van indirecte paracrine activiteit. Zaaien differentieel is gekleurd cellen samen een passend model voor directe cel-cel interactie.

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.

Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen

De huidige studie schetst een zeer reproduceerbare en handelbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsgebeurtenissen in vitro te bestuderen.  Dit protocol werd toegepast om de impact van paracriene Wnt5a-signalering in muizenneuraalcellen en myoblasten te evalueren.

Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro

In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Leer een proximale cultuurmethode om paracrine signalen tussen eierstokkankercellen en het tumor-micro-omgeving te bestuderen. Deze eenvoudige, reproduceerbare techniek isoleert paracrine effecten zonder direct celcontact.

Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen

Meer video's verkennen