Name: Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer een ex vivo longkankermodel met acellulaire en cellulaire longen om tumorprogressie te bestuderen. Deze methode maakt isolatie van primaire tumoren, circulerende tumorcellen en metastasen mogelijk voor gepersonaliseerde therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Min P. Kim kreeg financiële steun van de tweede John W. Kirklin onderzoek beurs, Amerikaanse Vereniging voor de ductus chirurgie, Graham Foundation, Houston Methodist Specialty arts onderzoeksgroep Grant, en Michael M. en Joann H. Cone Research Award. Wij danken Ann Saikin voor het bewerken van de taal van het manuscript.

De protocollen voor dierproeven werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Houston Methodist Research Institute en overeenkomstig alle voorschriften, wetten, richtlijnen en beleid.
1. rat Lung oogst
<ol><li>Anesthetize een 4 - tot 6-week-oude mannelijke Sprague-Dawley ratten door een intraperitoneale injectie (IP) van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) in de flank. Anesthesie zorgen door te controleren voor een gebrek aan beweging, wanneer de hind-limb teen is geknepen met een tang.</li>
	<li>Na 10 min, scheren van de borst en de buik en veeg de huid met een doekje chloorhexidine.</li>
	<li>Verwijder de huid door het oppakken van met een tang en door gebeuren het met een disposable scalpel. Na het openen van de borstholte gebeuren met scalpel door te snijden, voeren een bilaterale Thoracotomie door het snijden van de voorste van de ribbenkast aan de linkerkant en de rechterkant van het middenrif met een schaar. Opmerking: Dit is een niet-survival-operatie.</li>
	<li>De ribbenkast omhoog houden en injecteren van 2 mL van heparine (1.000 eenheden/mL) in het rechterventrikel van het kloppend hart met behulp van een naald 27 G. Opmerking: Dit zal verhinderen de vorming van bloedstolsels in de longen.</li>
	<li>Volledig verwijderen van de ribbenkast met een schaar en een naald 18 G in het linkerventrikel plaatsen als een vent, totdat het bloed komt. Vervolgens 15 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing EDTA (12,5 eenheden/mL; EDTA PBS) te injecteren in het rechterventrikel met behulp van een naald van 25 G.</li>
	<li>Snijd de minderwaardig en superieure vena cava, twee grote aderen op de rechterkant van het hart, en spoelen van de longen met een extra 10 mL van de EDTA PBS in de rechter ventrikel met behulp van een naald 27 G. Opmerking: De vena cava inferior is gevisualiseerd onder de bodem van het hart als een groot vat gevuld met rood bloed. Ook is de superieure vena cava gevisualiseerd in het bovenste gedeelte van het hart als een groot schip.</li>
	<li>Snijd de luchtpijp aan de voet van de schildklier. Verwijder voorzichtig de aflopende aorta op het niveau van de hemiazygos ader en de takken van de aorta in de boog.</li>
	<li>Haal het hart-longen-blok van de borstholte en de rest van het lichaam van de rat.</li>
	<li>Uitvoeren van ventriculotomy door het snijden van de helft van de rechter en linker ventrikels en plaats een op maat gemaakte ingevulde 18 G roestvrij stalen naald canule via de rechterventrikel in de belangrijkste longslagader (PA).</li>
	<li>De canule met een 2-0 zijden stropdas veilig en zorgvuldig blootstellen het rechterventrikel en atrium.</li>
	<li>Plaats een vrouwelijke Luer schot in het linkerventrikel en veilig met een 2-0 zijden stropdas.</li>
	<li>Spoel het hart-Long blok met 20 mL van de EDTA PBS via de canule PA en plaatst u deze in een tube van 50 mL bevattende voedingsbodems of PBS EDTA. Opmerking: Voor een cellulaire model, ga naar stap 3.1 de bioreactor instellen. Voor een Acellulair model, gaat u verder met stap 2.1 voor de decellularization.</li>
</ol>2. Long Decellularization
<ol><li>
Voorbereiding van de decellularization-eenheid
	<ol>
<li>Bereiden elke decellularization kamer/fles door piercing twee gaten in de fles dop en een vrouwelijke Luer breuk in de gaten (figuur 1A en 1B). Veilig met een zwart nylon ring aan de andere kant. Evenzo, boor een één gat in een andere fles dop voor de intraveneuze instellen bevestiging (Figuur 1 c). Opmerking: Figuur 1A en 1B zijn van de dezelfde kroonkurken van twee verschillende kanten. Figuur 1 c is van een verschillende dop met een enkel gat zoals hierboven vermeld in stap 2.1.1.</li>
		<li>Een 0,5-inch buis (aan de longslagader of PA einde) en 6-inch buizen (figuur 1J) koppelen aan een vrouwelijke Luer uit binnen de doppen (figuur 1A en 1B) en bevestig een mannelijke Luer-lock aan de uiteinden. Stel het slot met een 500 mL fles als de decellularization kamer/fles.</li>
		<li>Sluit het ene uiteinde van twee buizen van 2 ft (die zijn verbonden met een mannelijke Luer-lock) aan beide uiteinden van de pomp-buis (Figuur 1 H), die is gekoppeld aan het hoofd van de pomp (figuur 1E en 1F) door een patroon (figuur 1G) met een vrouwelijke Luer vergrendelen (figuur 1I).</li>
		<li>Sluit de andere uiteinden van de 2 ft buizen (uit stap 2.1.3) elke aan een vrouwelijke Luer lock hoofd op de decellularization kamer/fles dop (Figuur 1 L).</li>
		<li>Instellen van een 250 mL EDTA PBS fles (met 200 mL PBS) door ophanging van een omgekeerde fles op een stand met het proximale einde van een intraveneuze set (Figuur 1 d) ingevoegd in de fles dop en het distale uiteinde ter vervanging van de 2 ft buis verbonden met de decellularization-c Hamber/fles PA eind (figuur 1B). Deze buis 2 ft verbinden met de fles negeren. Opmerking: De flessen worden ingesteld in karton, zoals aangegeven in Figuur 1 K. De intraveneuze buizen komen uit de hangende flessen af te zien van reagentia in de Long-steiger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Long decellularization proces
	<ol>
<li>De heparinized PBS uitgevoerd bij een druk van de fysiologische perfusie van 30 mm Hg (Figuur 1 K) totdat het stroomt vrij in de decellularization kamer/fles en koppelt vervolgens, het hart-longen-blok aan het einde van de PA via de canule PA.</li>
		<li>Houd lopend de pomp voortdurend, zodat alle overtollige bufferoplossing binnen de decellularization kamer/fles wordt weggegooid.</li>
		<li>De heparinized PBS doorlopen de PA gedurende 15 minuten bij een druk van de perfusie van 30 mm Hg voor de eerste wasbeurt (Figuur 1 K).</li>
		<li>Vervang de heparinized PBS fles met 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water en perfuse van de Long voor 2 h voor de decellularization.</li>
		<li>Perfuse na de decellularization, gedeïoniseerd gesteriliseerde met autoclaaf water via de longen steiger voor 15 min.</li>
		<li>Vervolgens, perfuse 1% niet-ionogene wasmiddel in gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Vervang de decellularization kamer/fles met 500 mL gesteriliseerde met autoclaaf PBS aangevuld met 1 x antibiotica (penicilline-streptomycine Amfotericine), de Long opknoping met het GLB intact te houden in de fles.</li>
		<li>Gooi de intraveneuze ingesteld, zet de 2 ft-buis gekoppeld aan de teruggooi container terug naar de longslagader einde van de decellularization kamer, en draaien van de pomp op 6 mL/min (Figuur 1 L).</li>
		<li>Perfuse van de longen voor 72 h en blijven veranderen de PBS met antibiotica elke 12 h. Opmerking: De Acellulair Long is klaar voor direct gebruik. Het kan worden achtergelaten bij-80 ˚C totdat het nodig is. Als roze vlekken of bloedstolsels kunnen duidelijk worden gevisualiseerd in de lobben van de Long, gooi de Long. Het is mogelijk om willekeurig test voor DNA of histopathologisch onderzoek. Een volledige Acellulair Long zal niet tonen cellen en 99,9% van het DNA zal worden afgewassen. Opmerking: Wanneer u werkt met een cellulaire Long-model, slaat u de decellularization. De geoogste Long (stap 1) kan direct worden ingesteld in de bioreactor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bioreactor Set-up
<ol><li>Bereiden de bioreactor fles en vereiste artikelen voor de set-up.<ol>
<li>Drie boorgaten in een 500 mL fles dop op een gelijke afstand en monteren van een vrouwelijke Luer in alle drie gaten, met behulp van zwarte nylon ringen (figuur 2A en 2B). Opmerking: In twee gaten, de Luer-lock eindigt gezicht buiten, terwijl één uiteinde moet opnemen tegen de binnenkant van de fles.</li>
		<li>Snijd een 6 in pomp buis, een 2 in buis, een 6 in de buis, een 1.5 ft buis, een buis 2 ft, en 10 ft oxygenator per bioreactor.</li>
		<li>Knip een naald 18 G roestvrij staal en, nogmaals, Verbind de einden met biocompatibel buizen voor een tracheale canule.</li>
		<li>Wikkel de oxygenator buis, met Luer lock-connectors aan de uiteinden, op een solenoïde gaas met autoclaaf tapes (figuur 2C).</li>
		<li>Autoclaaf de bovengenoemde items en bewaar ze op UV licht voor 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De pomp binnen de reguliere cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) instellen met de juiste afstand tussen de platen gemakkelijk aan een fles van 500 mL.</li>
	<li>70% ethanol spray op de cartridge pomp en de pomp buis verbindt met vrouwelijke Luer lock connectoren aan beide uiteinden aan de pomp.</li>
	<li>De oxygenator gewikkeld rond de solenoïde gaas binnen de cel cultuur incubator door het ene uiteinde (de uitstroom) van de oxygenator verbinden met de buis van de pomp en het andere uiteinde met de 1.5 ft buis in de bioreactor instellen.</li>
	<li>Stel de bioreactor fles in een bioveiligheid kast met aseptische condities.<ol>
<li>Hechten van een 3-weg afsluiter (geel) aan het hoofd van een van de vrouwelijke Luers om de stroom door de PA.</li>
		<li>Een one-way afsluiter (blauw) verbinden met een andere vrouwelijke Luer lock schot voor cel zaaien via de luchtpijp (figuur 2F).</li>
		<li>Verbinding 2 in buis aan de buitenkant (wit) en 6 in de buis aan de binnenkant van de fles te laten circuleren van de media uit. Past een mannelijke Luer-lock aan een buis 2 ft en hechten een vrouwelijke Luer lug stijl Tee om toegankelijkheid als wilt toevoegen of verwijderen om het even wat.</li>
		<li>Sluit een one-way afsluiter aan op een van de openingen van de drie-weg-connector (vrouwelijke Luer lug stijl Tee).</li>
		<li>Een mannelijke Luer-lock en een vrouwelijke Luer-lock aan 2 ft buizen te koppelen.</li>
		<li>Voeg 200 mL RPMI1640 met 10% FBS en 1% antibiotica cel kweekmedium (varieert per cel vereiste) en de bioreactor overbrengen in de incubator. Sluit de oxygenator buis aan de twee open uiteinden (one-way afsluiter en Tee-connector) om er een kringloopsysteem bioreactor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vooraf de pomp worden uitgevoerd op 6 mL/min binnen de cel cultuur incubator met cel voedingsbodems te vullen de oxygenator en buizen, zodat er geen luchtbellen in de slangen bestaan.</li>
	<li>Zodra de buizen zijn gevuld met media, sluit de afsluiter en de bioreactor fles uit de incubator verwijderen door het loskoppelen van de oxygenators van beide uiteinden van de bioreactor fles.</li>
	<li>Zet de bioreactor fles in het biosafety kabinet, doorgeven van cultuur media via de afsluiter en de canule PA van de Long-steiger (Acellulair of met celstructuur) hechten aan de afsluiter door de mannelijke Luer-connector. Nota: Hier is het mogelijk om te gebruiken het Acellulair model (naar aanleiding van het decellularization-proces) of een vers geoogste hart-longen-blok (dat wil zeggen, de cellulaire model, als het behoudt de oorspronkelijke rat cellen).</li>
	<li>Het doorgeven van cultuur media via een one-way afsluiter te verwijderen alle lucht en koppelen van de trachea canule door een zijden draad naar de luchtpijp.</li>
	<li>Zorg ervoor om een torsie van de PA en de luchtpijp te voorkomen. Dicht de bioreactor fles dop met de Long steigerwerk binnen en, nogmaals, aseptisch de bioreactor overbrengen in de incubator en start de pomp bij een snelheid van 6 mL/min.</li>
	<li>Uitvoeren van voedingsbodems voor 10-15 min moet ervoor zorgen alle lobben krijgen opgeblazen en de Long ziet er in goede vorm (Figuur 2 g).</li>
</ol>4. metastase Model en cel zaaien
Opmerking: Ga naar cel zaaien met het bovenstaande Long model voor een primaire tumor groei studie. Het wijzigen van de Long-steiger (Acellulair of met celstructuur) als volgt voor de metastatische model.
<ol><li>Neem uit de bioreactor met de steiger van de longen uit de incubator en zet het in de bioveiligheid kabinet.</li>
	<li>Gebruik een Luer lock spuit doorgeven van 5 mL cultuur media via de luchtpijp en het GLB bioreactor openen met de opknoping Long steiger (figuur 2F).</li>
	<li>Bij deze stap is één meer persoon vereist om te helpen bij de wijziging van de longen bij een metastatische model.</li>
	<li>Zijde 2-0 klaar en hoekige pincet gebruik te maken van een pass through-de luchtpijp op de bifurcatie punt te krijgen.</li>
	<li>Bind de luchtpijp naar de juiste Long op het punt van de bifurcatie en controleren van de vrije stroom van media via de luchtpijp naar de linker long door het passeren van de voedingsbodems. Opmerking: Zodra de luchtpijp is vastgebonden op het punt van de bifurcatie, ontpit via de luchtpijp cellen automatisch omgeleid naar zaad aan de linker kwab. Het kan worden getest vóór het zaaien van de cellen door duwen voedingsbodems via de luchtpijp. In de gemetastaseerde model, zal de media aan de linker kwab alleen, die zal opblazen, en niet aan de juiste lobben10verplaatsen.</li>
	<li>Stel een 20 mL Luer lock spuit op de top van de trachea canule en ATCC Long kankercellen (A549, H1299) in 50 mL RPMI1640 volledige voedingsbodems (figuur 2F) toevoegen.</li>
	<li>De cel zaaien in het kabinet biosafety uitvoeren Voeg toe 15 mL van cellen in de spuit en laat het passeren van de Long lobben door de zwaartekracht. Voeg de rest van de cellen voordat alle luchtbellen passeren.</li>
	<li>In Acellulair Long zaaien, verzamelen de perfused media druipen beneden in de bioreactor fles en laat het passeren van de luchtpijp weer 3 x. Opmerking: De perfused media heeft soms de kankercellen zaadjes. Daarom, voor de efficiënte zaaien, weer terug de media in de luchtpijp via de spuit.</li>
	<li>Eenmaal uitgezaaid, verwijderen van de spuit, 15 min wachten, toevoegen van nieuwe media en de bioreactor terugkeren naar een incubator. Verwijder alle luchtbellen in de slangen.</li>
	<li>Start de pomp om te perfuse de media op 6 mL/min.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De 4-D ex vivo Long biedt de mogelijkheid te bestuderen van tumorgroei en uitzaaiing in een laboratorium-opstelling. Een native Long-matrix is een complex systeem dat biedt ondersteuning aan normale weefsel en cel-cel interacties, cel-matrix interacties, celdifferentiatie en weefsel organisatie onderhoudt. Het biedt een kans om de eventuele tumor communicatie-onderdelen om te bestuderen van de gevolgen daarvan voor de tumorgroei en de interactie met andere cellen toe te voegen.
De oog...

Uitzaaiing van kanker is de beklaagde achter de meeste kanker sterfgevallen en de ultieme uitdaging in de poging om kanker te bestrijden. Het algemene doel van deze methode is het ontwerpen van een protocol voor een vier-dimensionale (4-D) van de celcultuur die een dimensie van flow, naast de drie-dimensionale (3-D) celgroei heeft. Het vertegenwoordigt de drie fasen van het proces van de metastase [dat wil zeggen, de primaire tumor, circulerende tumorcellen (CTCs), en metastatische laesies].
In de afgelopen drie decennia leverde wetenschappers over de hele wereld een ongeëvenaarde rijkdom aan informatie om te begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de metastatische progressie in verschillende vormen van kanker die het vooruitzicht van een genezen of progressie-vrije overleving verbeterd. De klinische behandeling van bepaalde kankers, zoals borstkanker, verbeterd aanzienlijk1; echter, sommige kankers, zoals longkanker, nog een arme overleving2. In vitro en in vivo diermodellen geweest instrumentaal bij het genereren van nieuwe inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de ziekte. In de afgelopen jaren, cel lijn afkomstige xenografts (CDX) en patiënt afkomstige xenografts (PDX) geweest van meer belang als zij veel relevante functies van de primaire tumor van menselijk3, zoals groei kinetiek, histologisch functies, gedrags behouden kenmerken, en de respons op therapie. Elk model heeft echter zijn beperkingen te begrijpen van het mechanisme van CTC vorming en uitzaaiing naar een verre orgel4,5,6.
Onlangs, we een 4-D ex vivo -model van het long-kanker ontwikkeld door gebruik te maken van het concept van orgel reengineering en perfusie gebaseerde celkweek. Het bootst de menselijke long kanker groei door de vorming van perfusable tumor knobbeltjes die in de tijd met een soortgelijke mens kanker groeien-uitgescheiden eiwitten productie7. Het vertegenwoordigt de gen expressie handtekening die voorspelt arme overleving bij patiënten met kanker en toont ook een therapeutische respons door tumor regressie op cisplatine behandeling8,9. Het Long-model is verder bewerkt zodat het metastatische laesies kan vormen. De CTCs groeien van een primaire tumor en intravasate tot de therapieën en extravasate in de contralaterale Long metastatische laesies10vormen. Gen expressie studies suggereren een afzonderlijke expressie-profiel van de primaire tumor, de CTCs, en de metastatische laesies en de opregulatie van de subset van genen die nodig zijn voor het fenotype10. Dit metastatische proces optreedt als gevolg van de aanwezigheid van biologische omstandigheden gezien bij patiënten met kanker. Het voordeel van dit model is de aanwezigheid van een natuurlijke matrix en het platform, en een perfusie van voedingsstoffen die tot de vorming van tumor knobbeltjes leidt. Daarnaast biedt het ook de mogelijkheid aan het bestuderen van de effecten van verschillende componenten van de communicatie van de tumor of drugs op tumor progressie na verloop van tijd. Dit model kan worden gebruikt om te groeien van een cellenbereik kanker (longkanker, borstkanker, Sarcoom enz.) in een laboratorium-opstelling.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>voor canule</td></tr></tbody></table>

acellulair en cellulaire lung model studie tumor uitzaaiingen

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Het is moeilijk om te isoleren van de tumorcellen op verschillende tijdstippen van de progressie van de tumor. Wij een ex vivo Long model dat de interactie van tumorcellen met een natuurlijke matrix en de voortdurende stroom van voedingsstoffen kan tonen, evenals een model waarin de interactie van tumorcellen met normale cellulaire componenten en een natuurlijke matrix hebt gemaakt. De Long Acellulair ex vivo model wordt gemaakt door het isoleren van een rat hart-Long blok en het verwijderen van alle cellen met behulp van het decellularization-proces. Het recht belangrijkste bronchiën is afgebonden en tumorcellen worden geplaatst in de luchtpijp door een spuit. De cellen verplaatsen en vullen van de linker long. De Long wordt dan geplaatst in een bioreactor waar de longslagader een voortdurende stroom van media in een gesloten circuit ontvangt. De tumor gegroeid op de linker long is de primaire tumor. De tumorcellen die zijn geïsoleerd in de circulerende media zijn circulerende tumorcellen en de tumorcellen in de juiste Long zijn metastatische laesies. De cellulaire ex vivo Long model wordt gemaakt door het overslaan van het decellularization-proces. Elk model kan worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te beantwoorden.

De Long geoogst van rat onderhoudt de intact therapieën en longblaasjes11 (figuur 3A en 3B). Op decellularization, worden de componenten van de extracellulaire matrix van een Acellulair Long, zoals collageen, fibronectine en elastine,11 (Figuur 3 c, 3D, 3Een 3F) bewaard. De decellularization leidt tot een volledige ...

Hier presenteren we een protocol voor een ex vivo long kanker model dat bootst de stappen van de progressie van de tumor en helpt bij het isoleren van een primaire tumor, circulerende tumorcellen, en metastatische laesies.

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot tumorprogressie. Het ex vivo acellulaire en cellulaire longmodel maakt de vorming mogelijk van een primaire tumor die in de loop van de tijd groeit en circulerende tumorcellen en metastatische laesies vormt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van kankerprogressie in een verkorte tijd mogelijk maakt en de groei van verschillende soorten kankercellen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze gepersonaliseerde therapie aangezien tumorcellen van patiënten kunnen worden gebruikt in het model om de werkzaamheid van therapeutische geneesmiddelen, inclusief immuuncellen, te beoordelen. Begin met een diep geanesthetiseerde rat. Scheer de borst en buik en veeg de huid af met een chloorhexidine-doekje.Na het openen van de borstholte, voer een bilaterale thoracotomie uit door de voorzijde van de ribbenkast aan de linkerkant in de rechterkant van het diafragma door te snijden. Houd de ribbenkast omhoog en injecteer twee milliliter van 1000 eenheden per milliliter heparine in de rechterventrikel van het kloppende hart met behulp van een naald van 27 gauge om de vorming van bloedstolsels in de long te voorkomen. Na het verwijderen van de ribbenkast, plaats een naald van 18 gauge in de linkerventrikel als een ventilatieopening om het bloed eruit te laten en gebruik vervolgens een naald van 25 gauge om 15 milliliter van 12,5 eenheden per milliliter heparine PBS in de rechterventrikel te injecteren.Snijd vervolgens de luchtpijp aan de basis van de schildklier en verwijder voorzichtig de afdalende aorta op het niveau van de hemiazygos-ader en takken van de aorta bij de boog. Nadat de hart-longblok uit de borstholte is verwijderd, snijd de helft van de rechter- en linkerventrikels weg en plaats vervolgens een op maat gemaakte 18 gauge roestvrijstalen naaldcanule door de rechterventrikel in de hoofdlongslagader. Bevestig de canule met de 2-0 zijden band en leg voorzichtig de rechterventrikel en atrium bloot.Begin met het laten lopen van heparine PBS bij een fysiologische perfusiedruk van 30 millimeter kwik totdat het vrij in de fles van de decelluarisatie-eenheid stroomt, bevestig vervolgens de hart-longblok aan de decelluarisatie-eenheid aan het longslagadereinde door de longslagader canule. Na 15 minuten wassen met heparine PBS, vervang de heparine PBS fles met een fles die 0,15% natriumdodecylsulfaat en gedeïoniseerd water bevat, en perfuseer de long gedurende twee uur voor decelluarisatie. Na de decelluarisatie, perfuseer gedeïoniseerd autoclaved water door de longscaffold voor 15 minuten gevolgd door 1% niet-ionisch detergent in gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.Vervang ten slotte de fles met 500 milliliter autoclaved PBS aangevuld met antibiotica. Laat de pomp lopen op zes milliliter per minuut en perfuseer de longen gedurende 72 uur waarna de acellulaire long klaar is voor onmiddellijk gebruik. Spuit 70% ethanol op de pompcartridge en zet de oxygenator op door het uitlaateinde van de oxygenator aan te sluiten op de pompbuis en het andere uiteinde op een buis van 1,5 voet in de bioreactor.Zet de bioreactor fles op in een bioveiligheidskabinet onder aseptische omstandigheden. Bevestig een drieweg stopkraan aan de kop van een vrouwelijke Luer lock om de stroom door de longslagader te controleren, verbind vervolgens een eenweg stopkraan met een andere vrouwelijke Luer lock bulkhead voor celzaaien door de luchtpijp. Verbind twee inch buis aan de buitenkant en zes inch buis aan de binnenkant van de fles om het medium te laten circuleren.Bereid de buis voor om de bioreactor fles aan te sluiten op de oxygenator. Pas een mannelijke Luer lock aan op een buis van twee voet en bevestig een vrouwelijke Luer lug stijl T om toegang te bieden, en bevestig een mannelijke Luer lock en een vrouwelijke Luer lock aan buizen van twee voet. Voeg celkweekmedium toe en zet de bioreactor in de incubator.Verbind de oxygenatorbuis aan de twee open uiteinden om het een gesloten loop bioreactor te maken. Laat de pomp vooraf lopen op zes milliliter per minuut om de oxygenator en buizen te vullen met kweekmedium zodat er geen luchtbellen in de buis zijn. Zodra de buizen gevuld zijn met medium, sluit de stopkraan en koppel de oxygenators los van beide uiteinden van de bioreactor fles.Plaats de bioreactor fles in het bioveiligheidskabinet, laat het kweekmedium door de stopkraan lopen en bevestig de pulmonaire canule van de longscaffold. Als u met het cellulaire longmodel werkt, slaat u de decelluarisatie over. De geoogste long kan dyadisch in de bioreactor worden geplaatst.Laat het kweekmedium opnieuw door de eenweg stopkraan lopen om eventuele lucht te verwijderen en bind de trachea canule vast met een zijden draad aan de luchtpijp, sluit vervolgens de bioreactor fles. Breng de bioreactor over naar de incubator en start de pomp. Laat kweekmedium lopen gedurende 10 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat alle lobben opgeblazen zijn en de long er goed uitziet.Pas het acellulaire of cellulaire longscaffold aan zoals hieronder beschreven voor het metastatische model. Open de bioreactor kap met het hangende longscaffold en gebruik een Luer lock spuit om vijf milliliter kweekmedium door de luchtpijp te laten lopen. Gebruik hoektang om 2-0 zijden door de luchtpijp bij het splitsingspunt te laten lopen.Bind de luchtpijp die naar de rechter long gaat vast op het splitsingspunt en controleer de vrije stroom van medium door de luchtpijp naar de linker long door kweekmedium door te laten lopen. Bereid een volume van 50 milliliter longkankercellen zoals A549 of H1299 in RPMI 1640 volledige kweekmedia voor op een concentratie van twee tot drie miljoen cellen per milliliter. Zet een 20 milliliter Luer lock spuit op de trachea canule en voeg 15 milliliter cellen toe aan de spuit.Laat de celsuspensie door de longlobben gaan door de zwaartekracht. Voeg de rest van de cellen toe voordat er luchtbellen doorlopen. Zodra gezaaid, verwijder de spuit en wacht 15 minuten, voeg vervolgens vers medium toe aan de bioreactor.Breng het terug naar de incubator en, na het verwij

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit artikel beschrijft de procedures van een experimentele metastase test die wordt gebruikt om de metastatisch potentieel van kanker bij de mens cellijnen te bepalen.

Experimentele Metastase Assay

Een experimentele long metastase en CTL immunotherapie muis-model voor de analyse van...

Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Het doel van dit protocol is om borsttumorigenesis te bestuderen. Met deze techniek worden muisborsttumoren verwijderd en worden primaire cellen bereid uit tumoren. Er is een longextractieprotocol opgenomen voor het bestuderen van longmetastasen. Verder is er nog een protocol opgenomen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten van het muizenembryo.

Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase

Dit manuscript beschrijft een methode om te kwantificeren tumor cel accumulatie in de longen in een diermodel van uitzaaiing van de tumor.

Long Tumor cel aanwerving Assay

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

Het vermogen van metastaserende klonen om verre locaties te koloniseren, hangt af van hun proliferatievermogen en/of hun vermogen om te overleven in de micro-omgeving van de gastheer zonder significante proliferatie. Hier presenteren we een diermodel dat kwantitatieve visualisatie van beide typen leverkolonisatie door metastaserende klonen mogelijk maakt.

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer een ex vivo longkankermodel met acellulaire en cellulaire longen om tumorprogressie te bestuderen. Deze methode maakt isolatie van primaire tumoren, circulerende tumorcellen en metastasen mogelijk voor gepersonaliseerde therapie.

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

Meer video's verkennen