Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot tumorprogressie. Het ex vivo acellulaire en cellulaire longmodel maakt de vorming mogelijk van een primaire tumor die in de loop van de tijd groeit en circulerende tumorcellen en metastatische laesies vormt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van kankerprogressie in een verkorte tijd mogelijk maakt en de groei van verschillende soorten kankercellen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze gepersonaliseerde therapie aangezien tumorcellen van patiënten kunnen worden gebruikt in het model om de werkzaamheid van therapeutische geneesmiddelen, inclusief immuuncellen, te beoordelen. Begin met een diep geanesthetiseerde rat. Scheer de borst en buik en veeg de huid af met een chloorhexidine-doekje.

Na het openen van de borstholte, voer een bilaterale thoracotomie uit door de voorzijde van de ribbenkast aan de linkerkant in de rechterkant van het diafragma door te snijden. Houd de ribbenkast omhoog en injecteer twee milliliter van 1000 eenheden per milliliter heparine in de rechterventrikel van het kloppende hart met behulp van een naald van 27 gauge om de vorming van bloedstolsels in de long te voorkomen. Na het verwijderen van de ribbenkast, plaats een naald van 18 gauge in de linkerventrikel als een ventilatieopening om het bloed eruit te laten en gebruik vervolgens een naald van 25 gauge om 15 milliliter van 12,5 eenheden per milliliter heparine PBS in de rechterventrikel te injecteren.

Snijd vervolgens de luchtpijp aan de basis van de schildklier en verwijder voorzichtig de afdalende aorta op het niveau van de hemiazygos-ader en takken van de aorta bij de boog. Nadat de hart-longblok uit de borstholte is verwijderd, snijd de helft van de rechter- en linkerventrikels weg en plaats vervolgens een op maat gemaakte 18 gauge roestvrijstalen naaldcanule door de rechterventrikel in de hoofdlongslagader. Bevestig de canule met de 2-0 zijden band en leg voorzichtig de rechterventrikel en atrium bloot.

Begin met het laten lopen van heparine PBS bij een fysiologische perfusiedruk van 30 millimeter kwik totdat het vrij in de fles van de decelluarisatie-eenheid stroomt, bevestig vervolgens de hart-longblok aan de decelluarisatie-eenheid aan het longslagadereinde door de longslagader canule. Na 15 minuten wassen met heparine PBS, vervang de heparine PBS fles met een fles die 0,15% natriumdodecylsulfaat en gedeïoniseerd water bevat, en perfuseer de long gedurende twee uur voor decelluarisatie. Na de decelluarisatie, perfuseer gedeïoniseerd autoclaved water door de longscaffold voor 15 minuten gevolgd door 1% niet-ionisch detergent in gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.

Vervang ten slotte de fles met 500 milliliter autoclaved PBS aangevuld met antibiotica. Laat de pomp lopen op zes milliliter per minuut en perfuseer de longen gedurende 72 uur waarna de acellulaire long klaar is voor onmiddellijk gebruik. Spuit 70% ethanol op de pompcartridge en zet de oxygenator op door het uitlaateinde van de oxygenator aan te sluiten op de pompbuis en het andere uiteinde op een buis van 1,5 voet in de bioreactor.

Zet de bioreactor fles op in een bioveiligheidskabinet onder aseptische omstandigheden. Bevestig een drieweg stopkraan aan de kop van een vrouwelijke Luer lock om de stroom door de longslagader te controleren, verbind vervolgens een eenweg stopkraan met een andere vrouwelijke Luer lock bulkhead voor celzaaien door de luchtpijp. Verbind twee inch buis aan de buitenkant en zes inch buis aan de binnenkant van de fles om het medium te laten circuleren.

Bereid de buis voor om de bioreactor fles aan te sluiten op de oxygenator. Pas een mannelijke Luer lock aan op een buis van twee voet en bevestig een vrouwelijke Luer lug stijl T om toegang te bieden, en bevestig een mannelijke Luer lock en een vrouwelijke Luer lock aan buizen van twee voet. Voeg celkweekmedium toe en zet de bioreactor in de incubator.

Verbind de oxygenatorbuis aan de twee open uiteinden om het een gesloten loop bioreactor te maken. Laat de pomp vooraf lopen op zes milliliter per minuut om de oxygenator en buizen te vullen met kweekmedium zodat er geen luchtbellen in de buis zijn. Zodra de buizen gevuld zijn met medium, sluit de stopkraan en koppel de oxygenators los van beide uiteinden van de bioreactor fles.

Plaats de bioreactor fles in het bioveiligheidskabinet, laat het kweekmedium door de stopkraan lopen en bevestig de pulmonaire canule van de longscaffold. Als u met het cellulaire longmodel werkt, slaat u de decelluarisatie over. De geoogste long kan dyadisch in de bioreactor worden geplaatst.

Laat het kweekmedium opnieuw door de eenweg stopkraan lopen om eventuele lucht te verwijderen en bind de trachea canule vast met een zijden draad aan de luchtpijp, sluit vervolgens de bioreactor fles. Breng de bioreactor over naar de incubator en start de pomp. Laat kweekmedium lopen gedurende 10 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat alle lobben opgeblazen zijn en de long er goed uitziet.

Pas het acellulaire of cellulaire longscaffold aan zoals hieronder beschreven voor het metastatische model. Open de bioreactor kap met het hangende longscaffold en gebruik een Luer lock spuit om vijf milliliter kweekmedium door de luchtpijp te laten lopen. Gebruik hoektang om 2-0 zijden door de luchtpijp bij het splitsingspunt te laten lopen.

Bind de luchtpijp die naar de rechter long gaat vast op het splitsingspunt en controleer de vrije stroom van medium door de luchtpijp naar de linker long door kweekmedium door te laten lopen. Bereid een volume van 50 milliliter longkankercellen zoals A549 of H1299 in RPMI 1640 volledige kweekmedia voor op een concentratie van twee tot drie miljoen cellen per milliliter. Zet een 20 milliliter Luer lock spuit op de trachea canule en voeg 15 milliliter cellen toe aan de spuit.

Laat de celsuspensie door de longlobben gaan door de zwaartekracht. Voeg de rest van de cellen toe voordat er luchtbellen doorlopen. Zodra gezaaid, verwijder de spuit en wacht 15 minuten, voeg vervolgens vers medium toe aan de bioreactor.

Breng het terug naar de incubator en, na het verwij