Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het efferocytoseveld te beantwoorden, zoals de rol van signaalmoleculen bij het mediëren van de opname van apoptotische cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een duidelijke kwantificering biedt van de opname van apoptotische cellen, inclusief gedeeltelijke of stukjeswijze opname van apoptotische cellen, wat niet altijd duidelijk is met andere methoden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in efferocytose door immuuncellen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen zoals epitheel- of kankercellen.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de moeilijkheid om de microscoopinstellingen te optimaliseren. Na het bereiden van humane macrofagen en apoptotische Jurkat-cellen, gebruik een hemocytometer om de apoptotische cellen te tellen. Breng vervolgens een voldoende hoeveelheid apoptotische cellen over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Pellet de Jurkat-cellen via centrifugatie bij 500 maal g gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in 500 microliter PBS. Terwijl de Jurkat-cellen in de centrifuge zijn, verdeel 10 microliter DMSO in een nieuw microcentrifugebuisje.

Los vervolgens een minimale hoeveelheid NHS-Biotine op in het DMSO. Breng daarna 500 microliter van de apoptotische cel- en PBS-suspensie over naar het buisje met DMSO en NHS-Biotine. Verdun vervolgens een geschikte celvolgverf volgens de instructies van de fabrikant.

Incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg vervolgens een gelijk volume RPMI 1640 met 10%FBS toe en incubeer de suspensie gedurende nog eens vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker. Hierna pellet de cellen via centrifugatie bij 500 maal g gedurende vijf minuten.

Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspendeer de gekleurde cellen in 100 microliter RPMI 1640 met 10%FBS. Voeg 100 microliter gekleurde celsuspensie druppelsgewijs toe aan elk wel van de macrofagen. Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende één minuut bij 200 maal g.

Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5%CO2 in een weefselkweekincubator. Verwijder na de juiste incubatietijd de cellen uit de incubator. Was vervolgens de cellen tweemaal met één milliliter PBS.

Voeg vervolgens verdunde FITC-geconjugeerde streptavidine toe aan elk wel. En incubeer de plaat gedurende 20 minuten in het donker. Was de cellen drie keer met één milliliter PBS en schud de monsters zachtjes gedurende vijf minuten na elke spoeling.

Fixeer vervolgens de cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen eenmaal met PBS om eventueel overtollig PFA te verwijderen. Monteer de dekglasjes op een beeldvormingsslide en breng de slide over naar een fluorescentiemicroscoop.

Maak Z-stacks van een voldoende aantal cellen voor kwantificering. Het is cruciaal om de afstand tussen deze secties zo in te stellen dat alle opgenomen apoptotische materiaal wordt gedetecteerd. De maximale afstand tussen deze secties mag niet groter zijn dan de brandpuntdiepte van uw objectieflens, typisch 0,5 tot één micrometer.

Laad een van de Z-stacks in de software via de importfunctie. Selecteer vervolgens Geïntegreerde dichtheid als meetoptie onder het paneel Instellingen meten. Analyse is het gemakkelijkst uit te voeren als zowel de streptavidine als de celvolgverfkanalen als een overlay worden weergegeven.

Elk object met streptavidinekleuring langs een omtrek moet als streptavidine-positief worden beschouwd en mag daarom niet worden gekwantificeerd als streptavidine-negatief. Zodra het beeld is geladen, gebruikt u de streptavidine en het Freehand-, of polygoonselectie-gereedschap om al het celvolgverf-positieve, streptavidine-negatieve materiaal in een enkele vlak van de Z-stack te omcirkelen. Meet vervolgens de geïntegreerde intensiteit van de celvolgverf in het gebied.

Gebruik in dezelfde Z-sectie de streptavidinekleuring en het Freehand- of polygoonselectie-gereedschap om al het celvolgverf-positieve, streptavidine-positieve materiaal te omcirkelen. Meet tenslotte de geïntegreerde intensiteit van dit gebied. Met deze procedure onderging meer dan 95% van de Jurkat-cellen behandeld met Staurosporine apoptose.

In de meeste experimenten nam het aandeel van de efferocytosed apoptotische cellen toe op een tijdsafhankelijke manier. Bij het optimaliseren van dit protocol voor verschillende efferocytische celtypen, of verschillende apoptotische celdoelen, is het belangrijk om het bereik van de verhoudingen tussen apoptotische cellen en efferocytische cellen te testen. Meestal werken verhoudingen van 10 tot 1 of 30 tot 1 het beste.

Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast om activering van signaalmoleculen of intracellulaire transport te volgen door fluorescente reportergenen in de efferocytische cellen tot expressie te brengen, waardoor deze processen tijdens efferocytose kunnen worden geïmagerd.