Name: Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer efferocytose kwantificeren met fluorescentiemicroscopie voor celbiologisch onderzoek met humane macrofagen en apoptotische Jurkat-cellen. Deze methode biedt duidelijke kwantificering van apoptotische celopname.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) operationele subsidie MOP-123419, natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada Discovery Grant 418194, en een Ontario ministerie van onderzoek en innovatie vroege Research Award aan BH. DGW bijgedragen enkele van de beelden gepresenteerd, de optimalisatie van de protocollen en het schrijven van het manuscript; Hij werd gefinancierd door een subsidie van de pomp-priming van de Universiteit van Liverpool. CY wordt gefinancierd door een Vanier Graduate beurs en CIHR MD/PhD studententijd. De financieringsinstanties had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

De methoden die worden beschreven in dit protocol inschakelen beeldvorming en kwantificering van het proces van dynamische efferocytic, met behulp van zowel vaste-cel en live-cel benaderingen. Deze benaderingen bieden verscheidene voordelen over algemeen werknemer stroom cytometry gebaseerde methoden23,24. Het gebruik van binnenstebuiten kleuring met vaste monsters biedt een meer robuuste en nauwkeurige kwantificering van het tarief en de omvang van efferocytosis...

Apoptosis of geprogrammeerde celdood, is een sterk gereguleerd fysiologische proces dat voorkomt in de meeste meercellige organismen en is van cruciaal belang voor hun ontwikkeling en homeostase1. Naast betrokkenheid bij normale cel omzet en embryonale ontwikkeling, apoptosis kan de verwijdering van geïnfecteerde of beschadigde cellen van weefsels en kan worden geactiveerd in reactie op de infectie, ontsteking, kanker, en ook door medische ingrepen zoals radiotherapie of steroïden1. Apoptotic cellen bloot "eten-me" signalen op hun celoppervlak die worden herkend door receptoren op een scala aan professionele en niet-professionele fagocyten, gezamenlijk aangeduid als "efferocytes". Betrokkenheid van deze receptoren induceert de opname en afbraak van de apoptotic cel door de efferocyte door middel van een proces dat bekend staat als efferocytosis2,3. Fosfatidylserine is het beste gekarakteriseerd eten-me signaal drijvende efferocytosis. Het is normaliter beperkt tot de innerlijke bijsluiter van het plasma-membraan, met een lipide-scramblase die dit membraan asymmetrie verstoort, dus bloot fosfatidylserine op de oppervlakte van cel4activeren apoptosis. Fosfatidylserine is te vinden op het extracellulaire oppervlak van sommige niet-apoptotic cellen, zoals volwassen macrofagen en bloedplaatjes geactiveerd. Deze cellen zijn echter niet efferocytosed als gevolg van de aanwezigheid van "don't eat me" signalen, zoals CD47, op hun cel oppervlakte5,6,7. Blootgestelde fosfatidylserine wordt herkend door een matrix van efferocytic receptoren uitgedrukt door efferocytes. Binden van deze receptoren aan fosfatidylserine, activeert ofwel rechtstreeks ofwel via de hulp van opsonins, signaalroutes ter bevordering van de engulfment van de apoptotic cel in een membraan-gebonden vacuole genoemd de efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. de efferosome zekeringen opeenvolgend met Endosomen en lysosomes, die de moleculaire machines nodig breng het efferosome te leveren te degraderen de apoptotic cellen lading13,14. Zodra gedegradeerd, de apoptotic cel-afgeleide materialen worden verhandeld aan de recycling endosome — een proces die grenzen immuunresponsen aan apoptotic cel-afgeleide antigenen, en die kunnen toestaan voor de terugwinning van voedingsstoffen uit de apoptotic cellen13, 15. Een storing in efferocytosis resulteert in verminderde Goedkeuringvande apoptotic cellen; Deze onontgonnen cellen ondergaan uiteindelijk secundaire necrose. Necrotische cellen introductie pro-inflammatoire cytosolische inhoud, pathogenen en autoantigens in de extracellulaire milieu, dus een drivingrange van besmettelijke, inflammatoire en auto-immune ziekten16,17. Samen, apoptosis en efferocytosis de opheffing vergemakkelijkt van de stervende en dode cellen en zorgen voor het onderhoud van de weefsel homeostase.
Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efferocytosis vereist methoden waarmee een duidelijke kwantificering van apoptotic cellen opname. Deze kwantificering wordt bemoeilijkt door het feit dat in tegenstelling tot andere opname mechanismen zoals endocytose en fagocytose18,19, efferocytosis niet leiden de engulfment van intact doelcel tot kunnen, resulterend in de versnipperde opname van de apoptotic cel door de efferocyte20. Het protocol hierin beschreven beschrijft een in vitro efferocytosis bepaling waarmee nauwkeurige afbakening van de verinnerlijkte versus niet-geïnternaliseerd gedeelten van individuele apoptotic cellen en kan gecombineerd worden met een aantal vaste-cel en Live-cel microscopie benaderingen. Traditionele fagocytose assays toevoegen antilichamen die specifiek zijn voor de fagocytische doelgroep op het einde van het experiment om het label niet-geïnternaliseerd doelen, waar als onze methode verschilt door etikettering van het doel van de apoptotic met biotine covalent alternerende21 , 22. terwijl apoptotic cel specifieke antilichamen kunnen worden gebruikt in deze test, de biotinylation aanpak zorgt voor geen eiwithoudende doelstelling worden gelabeld en vermijdt potentiële problemen met secundair antilichaam Kruisallergie als immunokleuring wordt uitgevoerd . Specifiek, duidelijk naar voren komt de voorbereiding van apoptotic Jurkat cellen, die dual-gekleurd met zowel een cel bijhouden kleurstof en biotine zijn. De cel voor het bijhouden van kleurstof zorgt voor apoptotic cel-afgeleide materialen worden bijgehouden tijdens de efferocytosis, terwijl de oppervlakte biotinylation zorgt voor de discriminatie van geïnternaliseerd van niet-geïnternaliseerd delen van efferocytosed apoptotic cellen. Ook beschrijven we de cultuur en de voorbereiding van J774.2 en THP-1 cellijnen voor gebruik als lymfkliertest en menselijke efferocytes, monocyt-afgeleide M2 macrofagen als een voorbeeld van de primaire cel efferocytosis en Jurkat cellen voor gebruik als efferocytic doelen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op andere cellijnen of primaire cellen, doelcellen ondergaat elke vorm van celdood (bijvoorbeeld apoptosis, necrose en necroptosis) en micron-sized nabootsers die simuleren van apoptotic cellen via lipide coatings of coating met liganden specifieke aan een receptor efferocytic van belang.
De methode geschetst in dit protocol kent verschillende voordelen ten opzichte van de stroom cytometry gebaseerde methoden gewoonlijk worden gebruikt in het veld23,24. Door direct imaging de fagocytensysteem-apoptotic cel interactie, gecombineerd met duidelijke etikettering van beide totale en niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal, kunnen kwantitatieve metingen van efferocytosis worden gemaakt. Bovendien beperkt het gebruik van pH-ongevoelig fluorophores storende factoren zoals de onderdrukking van FITC en GFP fluorescentie bij lysosomale pH dat kunstdiscours sommige alternatieve methoden25. Tot slot, terwijl niet in detail beschreven, deze methoden kunnen worden ingezet met behulp van uiten van fluorescently-label transgenen, efferocytes of met na fixatie immunokleuring, met het oog op kwantificering van de activiteit van de molecule signalering en monitoring van de cellulaire processen tijdens efferocytosis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72290-08</td><td>Grootte en vorm van dekglas is niet kritisch, maar 18 mm past in de putjes van een standaard 12-well plate wat celkweek vereenvoudigt</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>Los op in DMSO bij 1 mM (1.000x stockoplossing)</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Bewaar in een exsicatuur. Maak geen stockoplossing.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte-poly cel scheidingsmedium</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-4</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Macrophage Cell Line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat T Cell Line</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Bestuderen van de regulering van de efferocytosis vereist methoden die kunnen de opname van apoptotic cellen nauwkeurig te kwantificeren en sonde de signalering en cellulaire processen die efferocytosis zijn. Deze kwantificering kunnen moeilijk uit te voeren zoals apoptotic cellen vaak efferocytosed fragmentarisch zijn, aldus dwingt tot methoden die nauwkeurig af te tussen het efferocytosed-gedeelte van een doelwit van de apoptotic versus residuele unengulfed mobiele bakenen kunnen fragmenten. De aanpak hierin maakt gebruik van dual-labeling benaderingen om de dynamiek van efferocytosis en efferocytic capaciteit van efferocytes zoals macrofagen nauwkeurig te kwantificeren. Het cytosol van de apoptotic cel heet met een cel-tracking kleurstof aan controle van alle apoptotic cel-afgeleide materialen, terwijl de oppervlakte biotinylation van de cel van apoptotic zorgt voor differentiatie tussen verinnerlijkte en niet-geïnternaliseerd inschakelen de fracties van de cel van de apoptotic. De capaciteit van de efferocytic van efferocytes wordt bepaald door de fluorescerende opnamen van live of vaste cellen en kwantificeren van het bedrag van de afhankelijke versus verinnerlijkte doelen, zoals onderscheiden door daar kleuring. Deze benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van methoden zoals stroom cytometry, namelijk de nauwkeurige afbakening van niet-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cel breuken, de mogelijkheid voor het meten van efferocytic dynamiek door live-cel microscopie, en de capaciteit voor het uitvoeren van studies van cellulaire signalering in cellen uiten fluorescently-label transgenen. Gecombineerde, dienen de methoden die worden beschreven in dit protocol als basis voor een flexibele experimentele aanpak die kan worden gebruikt om de activiteit van de efferocytic nauwkeurig te kwantificeren en te ondervragen van cellulaire signaalroutes actief tijdens efferocytosis.

'S nachts cultuur van Jurkat cellen met 1 µM staurosporine resultaten in apoptosis van > 95% van de cellen, die kunnen worden bevestigd met Annexine V kleuring (Figuur 1). Andere celtypes kunnen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel de concentratie van staurosporine en de duur van de behandeling van de staurosporine zal moeten worden geoptimaliseerd voor elke regel van de cel. Voor betrouwbare detectie en kwantificering van efferocytosis, > 80% van d...

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het efferocytoseveld te beantwoorden, zoals de rol van signaalmoleculen bij het mediëren van de opname van apoptotische cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een duidelijke kwantificering biedt van de opname van apoptotische cellen, inclusief gedeeltelijke of stukjeswijze opname van apoptotische cellen, wat niet altijd duidelijk is met andere methoden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in efferocytose door immuuncellen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen zoals epitheel- of kankercellen.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de moeilijkheid om de microscoopinstellingen te optimaliseren. Na het bereiden van humane macrofagen en apoptotische Jurkat-cellen, gebruik een hemocytometer om de apoptotische cellen te tellen. Breng vervolgens een voldoende hoeveelheid apoptotische cellen over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.Pellet de Jurkat-cellen via centrifugatie bij 500 maal g gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in 500 microliter PBS. Terwijl de Jurkat-cellen in de centrifuge zijn, verdeel 10 microliter DMSO in e

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

This video demonstrates a method for quantifying the phagocytosis of FITC-labeled pathogenic fungal spores by human leukocytes. Phagocytosed spores are discerned from cell-adherent spores through counterstaining, followed by flow cytometric analysis.

Quantitative Flow Cytometric Measurement of Fungal Spore Phagocytosis by Human Phagocytes

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het identificeren van een populatie van enucleating orthochromatische erytroblasten van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, die een visualisering van de erytroblast enucleatie proces.

Identificatie van een Muriene erytroblast subpopulatie verrijkt in Enucleating Events door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Voor veel wetenschappelijke studies die een biologische en chemische analyse van celpopulaties de cellen moeten worden in een hoge staat van zuiverheid. Fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) is een superieure methode om zuivere celpopulaties te verkrijgen.

Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Leer efferocytose kwantificeren met fluorescentiemicroscopie voor celbiologisch onderzoek met humane macrofagen en apoptotische Jurkat-cellen. Deze methode biedt duidelijke kwantificering van apoptotische celopname.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen