Schaalbare fabricage van rekbare, Dual Channel, Microfluidic orgel Chips
20 oktober 2018
Hier presenteren we een protocol dat beschrijft de fabricage van rekbare, dual channel, orgel chip microfluidic cel cultuur apparaten voor Recapitulerend orgel-niveau functionaliteit in vitro.
Het algemene doel van dit protocol is om de fabricage van orgaan gechipte microfluïde apparaten voor het samenvatten van orgaanniveau functionaliteit in vitro te beschrijven. Dit protocol beschrijft een manier om orgaan gechipte apparaten te fabriceren recapituleren orgaanniveau functie in vitro. De func, de apparaten, zoals deze, zijn eigenlijk vervaardigd met behulp van 3D-geprinte mallen uit een zacht silicium rubber.
Dit rubber stelt ons in staat om deze apparaten daadwerkelijk te doordringen met mechanische signalen die ons in staat stellen om het weefsel te strekken als je zou krijgen in laten we zeggen een long of een darm. We voegen ook overvloed toe, die de bloedstroom en de stroom van andere lichaamsvloeistoffen in orgaansystemen nabootst. Deze apparaten stellen ons in staat om de complexe fysiologie die in vivo gebeurt te recreëren en te proberen te begrijpen.
Maar doe dit in vitro. Dus in wezen experimenteren we op mensen, maar niet op mensen. Het is dus een zeer effectieve manier om de kloof tussen dierstudies te overbruggen, die altijd worden gedaan in de preklinische ontwikkeling van therapieën, en dan vóór menselijke studies, die klinische proeven worden genoemd, waar een veel groter risico is voor de mens, voor de menselijke veiligheid.
Deze apparaten helpen de kloof te overbruggen en stellen ons in staat om nieuwe therapieën te ontwikkelen en de basisbiologie te begrijpen die daadwerkelijk gebeurt in complexe systemen zoals de mens. Top kanaal voorbereiding. Veeg de glanzende kant van elk polyurethaanstuk af met ethanol en clean room doekjes.
Plaats glanzende kant van de polyurethaan over de open kant van de mal op zijn plaats schimmel. Plaats de mal en polyurethaan assemblages in de mal, getextureerde kant tegen het einde van de mal. Blijf dit doen totdat alle mallen zijn geplaatst in de mal.
Draai de mal aan door de handgreep met een moersleutel te draaien, totdat de afstand 25 millimeter breed is. Maak een boot van aluminiumfolie rond de mal op zijn plaats jig. Giet PDMS in elke mal is goed tot vol.
Zodra de hele mal is gevuld, plaats de mal in het vacuüm desiccator. Na een uur, verwijderen uit desiccator. En plaats in 60 graden Celsius oven voor ten minste vier uur.
Demonteren van de mal met behulp van een moersleutel. Verwijder de polyurethaanstrips uit elke mal. En weggooien.
Zorgvuldig demold PDMS onderdelen uit hun mallen en leg ze functie kant omhoog. Line-up van het blad van de tegel schraper aan het einde tab inkeping. En snijd elk uiteinde weg om de bovenste componenten te cingulate.
Bewaar afgewerkte onderdelen in vierkante petrischaaltjes. Bewaar onderdelen in positieve drukkasten bij kamertemperatuur. Onderste kanaal voorbereiding.
Giet 10,5 gram PDMS in de mal. Het luchtpistool kan zeer voorzichtig worden gebruikt om de PDMS over de ruimte te bewegen. Plaats mallen in vacuüm desiccator.
Na een uur, verplaats de mallen naar een niveau 60 graden Celsius oven. Plaats schimmel op tafel in een laminaire stroomkap. Maak de PDMS los van de rand van de mal.
Grip een hoek en voorzichtig schil terug de PDMS van het oppervlak van de mal. Wanneer volledig verwijderd, omkeren en lag op het werkoppervlak, zodat kanaal functies worden face-up. Snijd langs buitenranden met tegelsnijder.
Met platte peddel tangen, lay-parts functie kant op tape om vuil te verwijderen. Verwijder een deel uit de verpakkingstape. Sleep het losse uiteinde van het onderdeel over de dia.
Het losse uiteinde zal laminaat met het glas. Cover functies met Scotch tape. Bewaar onderdelen in positieve drukkasten bij kamertemperatuur.
PDMS membraanvoorbereiding. Controleer of de wafers vrij zijn van PDMS op de achterkant. Plaats elke membraanwafer in de aangewezen sleuven.
Gebruik de één mL-spuit om 09 mL PDMS op het midden van elke membraanwaferpostarray te plaatsen. Laat de PDMS minimaal vijf minuten zitten. Laat PDMS zich verspreiden over de post van het membraanwafer.
Ga niet door naar de volgende stap totdat ten minste 75% van de postarray is bedekt met PDMS. Plasma behandelt de polycarbonaatstrip met behulp van de in het protocol beschreven voorwaarden. Verwijder polycarbonaat plaat uit de plasmamachine en gebruik schaar om de polycarbonaat platen te snijden in 45 millimeter bij 45 millimeter vierkanten.
Leg de plasma behandelde kant van de polycarbonaatvierkanten op de PDMS, gecentreerd op het membraanwafer. Plaats PDMS spacer op het midden van het polycarbonaatvierkant. Plaats dan precut getextureerde polycarbonaat.
Insert trays, zodat lade drie is in de rug, lade twee is in het midden, en lade een is in de voorkant. Lade een heeft een inkeping voor uitlijning. Open de uitgangsdrukklep en open heel langzaam de inputdrukklep.
Dit is zodat de vier kilogram kracht geleidelijk wordt toegepast op elk membraan wafer, in tegenstelling tot direct die de wafers kan breken. Draai de AMF-schakelaar om de uithardingscyclus te starten. Sluit vervolgens de inputdrukklep en open de uitgangsdrukkleppen om de druk van de luchtcilinders los te laten.
Verwijder de trays en breng ze naar de laminaire stroomkap. Pel voorzichtig het getextureerde polycarbonaat af. Verwijder de PDMS-afstandsruimte voorzichtig.
Inspecteer het PDMS-membraan op gebieden met door gaten. Gebruik een markering om de omtrek van het doorspoelgebied te traceren. Merk ook eventuele gaten of defecten op de membranen.
Dit is een voorbeeld van een ongemarkeerd en gemarkeerd membraan. Met behulp van wafer handling pincet, los wafers van de lade. Verwijder elk membraan uit de wafer en plaats op petrischaal.
Het PDMS membraan wordt vanaf de wafer gedemold en zal worden gebonden aan de polycarbonaat backing. Bewaar onderdelen in positieve drukkasten bij kamertemperatuur. Topassemblage en voorbereiding.
Met behulp van mat afgewerkte Scotch tape, reinig de PDMS membranen evenals de binnenkant van de petrischaal om puin te verwijderen. Tape grondig de functie kant van elke hoge kanaal top om puin te verwijderen. Plaats topjes in petrischaaltje met PDMS membraan.
Houd er rekening mee dat sommige membranen een of twee bovenste delen kunnen nemen. De belangrijkste kanalen van elk topdeel moeten binnen het gemarkeerde gebied binnen het membraan passen. Laad de petrischaaltjes in het plasma.
Plasma behandelen membraan en top volgens het geschreven protocol. Zodra de hechtingscyclus is voltooid, verwijder de afwas en leg de geactiveerde bovenste delen op het membraan. Plaats in 60 graden Celsius oven voor ten minste twee uur.
Met behulp van een scalpel, traceer rond de omtrek van de gebonden top om het te scheiden van de polycarbonaat drager. Zodra het onderdeel is getraceerd, schil de top van het polycarbonaat. Het PDMS-membraan dat aan de bovenkant is gebonden, moet ook van de drager afpellen.
Verwijder met behulp van een pincet het membraan uit de poorten die toegang hebben tot het onderste kanaal. Laat geen delen van het membraan achter die de toegangspoort bedekken. Verwijder bovendien vuil of stof met een pincet.
Chipassemblage. Functie side up, plasma te behandelen top assemblages met bodems. Onder een omgekeerde microscoop, lijn de bovenste montage met de onderste helft.
Plaats in 60 graden Celsius oven voor ten minste twee uur. Resultaten. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de schaalbare fabricage van PDMS-orgaanchips. Deze apparaten maken de cultuur van twee verschillende overvloedige weefseltypes op een elastisch poreus membraan mogelijk.
De PDMS kanalen worden gegoten met behulp van 3D-geprinte mallen, die prototyping van nieuwe ontwerpen versnelt. Top kanalen zijn gegoten in mallen onder compressie tegen een compatibele polyurethaan pakking om componenten te produceren met gegoten poorten. Terwijl onderste kanaal componenten worden gegoten in trays en behandeld op microscoop dia backing.
Deze fabricagebenadering combineert multischaalpatronen van de onderdelen in één stap, wat tijd bespaart, reproduceerbaarheid en traceerbaarheid verbetert en vuil dat wordt gegenereerd door poortponzen en meerdere snijstappen vermindert. De poreuze membranen zijn van cruciaal belang voor de functie van de orgelchip, en de fabricagebenadering op basis van het gieten tegen patroon siliciumwafers resulteert in membranen van consistente dikte en oppervlakteafwerking. Handling via polycarbonaat dragers zorgt voor een grotere batch productie en opslag.
De geassembleerde orgelchip bestaat uit twee overegelzenders in een optisch transparante verpakking. In het overlappende gebied, een poreus PDMS membraan maakt weefsel-weefsel interactie van metabolieten, eiwitten, therapeutica, pathogenen, en cellen te recapituleren orgaan chip functie, terwijl twee parallelle kanalen aan weerszijden worden gebruikt om mechanische stam, met behulp van cyclische vacuüm actuatie. De porositeit van het PDMS membraan bio-medisch ondersteunt de flux van metabolieten, groeifactoren, en zelfs cellen tussen de vasculatuur en orgaan parenchyma.
De schijnbare doorlaatbaarheid van het membraan werd bepaald met behulp van de di-concentratie in de uitlaatkanalen met en zonder Caco-2 darmcellen. De darmchipcellagen vormen een aanzienlijk verhoogde barrière voor doorlaatbaarheid. De orgelchip kan worden bediend met behulp van de parallelle vacuümkanalen om kwantitatief en reproduceerbaar cyclische belasting van stammen toe te passen op het membraan, en dus de gekweekte weefsels.
Deze cyclische stam in combinatie met media-overfusie ondersteunt cellulaire differentiatie om in vivo orgaanfysiologie beter na te bootsen, zoals de vorming van villi in de darmchip. Met behulp van het protocol hier beschreven, moet je nu in staat zijn om een rekbare PDMS orgel chip fabriceren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage van rekbare, tweekanalige organ-on-a-chip microfluïdische celkweekapparaten. Deze apparaten zijn ontworpen om functionaliteit op organniveau in vitro te reproduceren door fysiologische omstandigheden na te bootsen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Microfluidica
- Celkweek
- Organ-on-a-chip-technologie
Achtergrond
- Organ-on-a-chip-systemen worden gebruikt om orgaanfuncties in vitro te simuleren.
- Mechanische prikkels zijn essentieel voor de weefselontwikkeling.
- 3D-printen maakt de precieze vervaardiging van mallen mogelijk.
- Deze apparaten kunnen de bloedstroom en andere dynamieken van lichaamsvloeistoffen nabootsen.
Doel van de studie
- Om organ-on-a-chip-devices te vervaardigen die functies op organniveau repliceren.
- Om complexe fysiologische processen in vivo te begrijpen.
- Om een platform te bieden voor het bestuderen van organspecifieke responsen.
Gebruikte methoden
- 3D-printen van mallen met behulp van zachte siliconenrubber.
- Integratie van mechanische rekcapaciteiten.
- Incorporate van perfusiesystemen om de bloedstroom na te bootsen.
- Testen van de functionaliteit van de vervaardigde apparaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vervaardiging van rekbare organ-on-a-chip-apparaten.
- De apparaten demonstreerden het vermogen om functies op organniveau na te bootsen.
- Mechanische prikkels beïnvloedden het weefselgedrag positief.
- Perfusiesystemen repliceerden effectief de vloeistofdynamica.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de fabricage van organ-on-a-chip-systemen.
- Deze apparaten kunnen het begrip van de orgaanfysiologie verbeteren.
- Potentiële toepassingen in geneesmiddelentesten en ziekmodellering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
De Human Organ-on-a-Chip-technologie pakt een kritiek knelpunt in de geneesmiddelenontwikkeling aan door mens-relevante in vitro-modellen te bieden die klinische resultaten beter voorspellen dan dierstudies. Dit schaalbare fabricageprotocol maakt de reproduceerbare productie mogelijk van rekbare, duaal-kanaal microfluïdische apparaten voor het mechanistische risico-onderzoek van therapeutische kandidaten. Door fysiologie en mechanische prikkels op organniveau na te bootsen, ondersteunt de technologie de validatie van targets en het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via interacties tussen menselijke weefsels op poreuze membranen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets door het modelleren van organspecifieke mechanische prikkels en perfusie.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-engagement door in vivo-achtige barrière- en transportfuncties te recapituleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare microfluïdische platforms voor compoundscreening met fysiologische flow en rek.
- Operationele waarde: Maakt assay-gereedheid mogelijk via schaalbare fabricage met behulp van 3D-geprinte mallen en polycarbonaatdragers.
- Doorvoercapaciteit: Faciliteert parallel testen van dubbele weefseltypen onder gecontroleerde mechanische en perfusiecondities.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat de brug van ontdekking naar preklinisch onderzoek door menselijke reacties op orgaanniveau op therapeutica en pathogenen te modelleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang via kwantitatieve metingen van permeabiliteit en barrière-integriteit.
- Translationele continuïteit: Sluit aan bij biomarkerstudies door analyse van metaboliet- en proteïneflux over weefselinterfaces mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De fabricagemethode integreert in vroege ontdekkingsworkflows door snelle prototyping van orgaanspecifieke chips mogelijk te maken voor hypothesetoetsing en evaluatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanisch risico-beperking door weefsel-weefselinteracties te modelleren onder fysiologische spanning en stroming.
- Screening: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door gegoten kanalen en een consistente membraanporositeit.
- Analytics: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk, zoals schijnbare permeabiliteit en barrièrefunctie voor de vergelijking van verbindingen.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische validatie via mensgerelateerde fysiologie op orgaanniveau en cyclische mechanische activering.
- Enterprise Hergebruik: Positioneert het fabricageplatform als een herbruikbare capaciteit voor de generatie en opslag van multi-organ-chips.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid via mens-relevante organ-on-a-chips die mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie verminderen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid via 3D-geprinte mallen en handling op basis van polycarbonaatdragers.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door biologisch risico in een laat stadium te verlagen via vroegtijdige mens-relevante profilering van effectiviteit en toxiciteit.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van leads mogelijk op basis van permeabiliteits- en barrièregegevens afgeleid van organ-on-a-chips.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de assemblage van microfluïdische apparaten, plasmabonding en weefselkweek onder mechanische stimulatie.
- Is afhankelijk van toegang tot vacuümdesicatoren, ovens, laminaire flow-kappen en 3D-printen voor het maken van mallen.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van drempelwaarden voor membraanporositeit en perfusieparameters voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van het platform naar verschillende organtypes met variërende mechanische en biochemische signalen.
- Praktische beperkingen omvatten handmatige stappen tijdens de membraaninspectie en de uitlijning van de bovenkant met het membraan onder de microscoop.
