Name: Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Leer een high-throughput calcium-flux assay voor NMDA-receptoren met HEK 293-cellen. Deze methode analyseert receptormodulatie door kleine moleculen voor neurologische therapieontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank het postkantoor baccalaureaat geleerden programma en Novartis instituten voor biomedisch onderzoek als een geheel voor de financiering van deze studie.

1. bereiding van cellen
Opmerking: Dit protocol, met inbegrip van gegevens generatie, maakt gebruik van HEK293 cellen getransduceerde met een baculovirus codering NR1 en NR2A cellen.
<ol><li>Zaad van het juiste aantal HEK293 cellen en voeg de NR1 en/of NR2A virus aan de juiste eindconcentraties (elke 1.00 µL). Gebruik voor een 384-well plaat, cellen per putje op 10.000 in een eindvolume van 30 µL.</li>
	<li>U kunt ook zaad HEK293-NR1-NR2A cellen op de gewenste cel nummer en het volume (voor een 384-well plaat, gebruik 10.000 cellen per putje in een eindvolume van 30 µL). Toevoegen van tetracycline bij een concentratie van 2 µg/mL induceren NR2A expressie en het toevoegen van de samengestelde bescherming (100 µM MDL105, 519 of 5 µM CGP07066724).</li>
	<li>Opmerking: De baculovirus codering NR1 en NR2 moet hebben een geschatte titer tussen 5 x 109 - 10 x 109 besmettelijke eenheid per milliliter24.</li>
</ol>2. meting van de NMDA-receptor activiteit
<ol><li>Bereiden een 384-well-plate met HEK293 cellen met NR1/NR2 of HEK293-NR1-NR2A cellen in aanwezigheid van beide beschermende samengestelde getransduceerde. Gebruik een duidelijk bodem, zwart frame, poly-D-lysine beklede plaat. Opmerking: Bescherming met 100 µM MDL105, 519 wordt gebruikt voor het verlenen van gevoeligheid voor glycine, terwijl 5 µM CGP070667 wordt gebruikt voor het verlenen van gevoeligheid voor glutamaat.</li>
	<li>Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 16 uur ('s nachts).</li>
	<li>Verwijderen de plaat uit de incubator en zachtjes de cel media negeren door het vertragen van het wegknippen van de plaat over een compatibel biologisch afbreekbaar afval container. Tik zachtjes op de plaat op een papieren handdoek voor het reinigen van de media uit de randen van de plaat en afvoer van alle resterende media.</li>
	<li>Bereid de calcium6-kleurstof door één flacon van calcium6 kleurstof (1 plaat grootte) solubilizing in 10 mL incubatie buffer (HBSS pH 7.5, van 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecide). Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Verwijderen de plaat uit de incubator en laat de cellen aan te passen aan kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Zachtjes aan de calcium6-kleurstof zoals beschreven in stap 2.3 uitstorten en Voeg 30 µL van assay buffer (HBSS pH 7.5, van 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecide).</li>
	<li>Herhaal stap 2.6 tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten. Laat 30 µL van assay buffer op de cellen na de laatste wasbeurt.</li>
	<li>Laat de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur rusten.</li>
	<li>Bereid de ligand-plaat door het maken van een 4-fold voorraad van 400 µM glycine en 400 µM glutamaat (eindconcentratie van 100 µM; optimale concentratie van liganden te bepalen zoals hieronder beschreven). Pipetteer een minimum van 25 µL van het ligand materieel in een bodemplaat die V-384-well.</li>
	<li>Laad de ligand plaat en de plaat van de cel in de FDSS (functionele Drug Screening System).</li>
	<li>Het meten van de basislijn fluorescentie (Fo) van de cel plaat voor 30 seconden. Pipetteer 10 µL van het ligand-voorraad in de plaat van de cel met behulp van de FDSS verstrekking functie en de maatregel de calcium-flux door het opnemen van calcium6-kleurstof fluorescentie gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Berekenen de maximale fluorescentie verhouding door te delen van de maximale fluorescentie verkregen door de basislijn fluorescentie (Fmax/fo).</li>
</ol>3. optimalisatie van NMDAR expressie niveaus
<ol><li>Uitvoeren om te bepalen van de optimale hoeveelheid baculovirus te gebruiken, een titratie van zowel de NR2A als de NR1 virussen. Bereid een 384-well plaat met HEK293 cellen (aanbeveling van 10.000 cellen/well, 30 µL van media) en omvatten de bescherming-verbindingen, zoals beschreven in stap 2.1.</li>
	<li>Toevoegen van wisselende hoeveelheden van het virus van de NR1 in verschillende rijen van de plaat (bijvoorbeeld: Voeg respectievelijk 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL in rijen A-E). Toevoegen van duplicaten voor nauwkeurigheid van gegevens.</li>
	<li>Toevoegen van wisselende hoeveelheden van het NR2A-virus in verschillende kolommen van de plaat (bijvoorbeeld: Voeg respectievelijk 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL in rijen A-E). Toevoegen van duplicaten voor nauwkeurigheid van gegevens.</li>
	<li>Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 16 uur ('s nachts).</li>
	<li>Het bepalen van de optimale verhouding en het bedrag van de NR1 en NR2A virussen door het uitvoeren van een meting van de flux calcium op de FDSS (zie hierboven).</li>
</ol>4. ligand titratie
<ol><li>Bereiden de cellen zoals beschreven in stap 2.3.</li>
	<li>Maak verdunningen van elke ligand in aanwezigheid van concentraties (100 µM) verzadigen van de andere ligand als de stamoplossing van een 4-fold. Bijvoorbeeld: voor een concentratie van de laatste test 10 µM van glycine, bereiden een 40 µM-stockoplossing van glycine, met inbegrip van 400 µM glutamaat.</li>
	<li>Ga verder met de meting van de FDSS zoals beschreven in stap 2.11.</li>
</ol>5. samengestelde testen
<ol><li>Bereiden de cellen zoals beschreven in stap 1.</li>
	<li>De ligand-plaat met een 5-fold voorraad van definitieve ligand concentratie in de buffer assay voor te bereiden.</li>
	<li>De plaat van de verbindingen met de 4-fold voorraad van gewenste eindconcentratie van verbindingen in de buffer assay voor te bereiden. Voor een samengestelde eindconcentratie van 10 µM in de buffer assay, bereiden een stamoplossing van 40 µM.<ol>
<li>Houd de concentratie van de dimethylsulfoxide (DMSO) constant over alle monsters door het opstellen van een pre verdunning van de stof in DMSO vóór verdere verdunning in de buffer assay.</li>
		<li>Maak voor een dosis-respons van de verbinding in de definitieve bepaling variërend tussen de 3 en 30 µM, een pre verdunning van de stof in DMSO variërend van 1 tot 10 mM. Verdun die in de buffer van de test bij de 4-fold voorraad concentratie. De uiteindelijke concentratie van de DMSO mag niet meer dan 0,5%. Opmerking: Het wordt aanbevolen om te testen van elk monster in triplicates.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laad de ligand, samengestelde en cel plaat in FDSS.</li>
	<li>Het meten van de fluorescentie van de basislijn voor 30 seconden.</li>
	<li>Voeg 10 µL van samengestelde materieel en meten van de fluorescentie gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 10 µL van het ligand materieel en meten van de fluorescentie gedurende 5 minuten.</li>
	<li>De integraal van de fluorescentie verhouding bepalen door het berekenen van het oppervlak onder de kromme van de fluorescerende verhoudingen tijdens de laatste 5 minuten van de meting. Opmerking: U kunt ook de maximale verhouding van fluorescentie na toevoeging van het ligand kan worden gebruikt voor analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li>
<li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional%2C+lifespan+and+systems+vulnerability+view%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li>
<li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li>
<li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li>
<li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li>
<li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunit+diversity%3A+impact+on+receptor+properties%2C+synaptic+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+receptor+composition%3A+many+regulators%2C+many+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition%3A+limitations+of+the+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li>
<li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li>
<li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+block+by+Mg2%2B+of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li>
<li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li>
<li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li>
<li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li>
<li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li>
<li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A%2C+R1-2B%2C+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li>
<li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine%2FD-serine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).</li>
<li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li>
<li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A%2F2A%2C+rather+than+1A%2F2B+receptor+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li>
<li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors%3A+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li>
<li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten en niets te onthullen.

Het succes van deze test hangt grotendeels af van de gezondheid van de cellen van de HEK gebruikt. Cellen die een exponentiële groei en met lage passage nummer moet worden gebruikt. Deze bepaling omvat vele overdrachten en toevoegingen van oplossingen, dus met behulp van voorzichtigheid zorgt voor hogere nauwkeurigheid in de resultaten. Concentraties van stoffen en alle andere reagentia moeten ook kruiscontrole minimaliseren van fouten. Bij het vervangen van mobiele media met de buffer assay voor de calcium flux assay, m...

Met huidige vooruitgang in de geneeskunde toegenomen levensverwachting aanzienlijk; Zo heeft echter de prevalentie van leeftijd gerelateerde ziekten. Ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) zoals schizofrenie, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer en Parkinson's disease, onder anderen, zijn geen uitzondering en hebben naar zijn verwachting toenemen in de komende tien jaar1, 2 , 3. de storing van ionotropic glutamaat receptoren bekend als N-methyl-D-aspartaat receptoren (NMDAR) is gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer, schizofrenie, traumatisch hersenletsel, beroerte, diabetes en glaucoom o.a. die garandeert de moeten hun biologie voor de ontwikkeling van effectieve, ziekte-wijzigen therapieën4,5,6,7te bestuderen.
NMDARs bestaan uit vier monomeren of subeenheden4,8,-9. De structurele samenstelling van de NMDAR toont ontwikkelings- en regionale variabiliteit binnen de hersenen7,10. NMDARs zijn betrokken bij de Synaptische plasticiteit, cognitie en de generatie van ritmes voor ademhaling en motoriek11,12,13. Als een spanning-gated kanaal, het is grotendeels niet-geleidend op rusten membraanpotentiaal (-70 mV) en wordt geblokkeerd door magnesium om te voorkomen dat verdere permeatie van ionen. Het kanaal wordt geactiveerd door de binding van twee liganden, glutamaat en glycine/D-serine en een gelijktijdige depolarisatie op de synaptische membraan gemedieerd door AMPA receptoren, een subklasse van ionotropic glutamaat receptoren. De depolarisatie verwijdert de magnesium-blokkering van de NMDAR, zodat de toestroom van kationen, met name calcium14,15,16. Hoewel de activering van het NMDAR essentieel voor de overleving van de cel is, kan buitensporige activering leiden tot cel dood17,18,19 tot en met excitotoxicity. Dit, maakt naast het complexe karakter van de receptoren, het uitdagend om onderzoek te verrichten nodig voor het ontwikkelen van effectieve therapieën.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de NMDAR. Echter, ieder heeft begeleidende waarschuwingen. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte techniek een fluorescentie-gebaseerde test die NMDAR-gemedieerde veranderingen in intracellulair calcium in een stabiele cellijn onder de controle van een tetracycline-afleidbare promotor (Tet-On)20 meet. In dit systeem maakt de supramaximal concentraties van liganden die nodig zijn en de eis dat NMDAR-remmers aanwezig tijdens de meting zijn het echter bijna onmogelijk op te sporen van de activiteit van de concurrerende antagonist. De expressie van de functionele receptor veroorzaakt in andere soortgelijke systemen, toxiciteit, kanaal-blokkers zoals ketamine21,22 te behouden van de celculturen vereisen. Deze kanaal blokkers zitten de kern van de receptor en zijn moeilijk te wassen, met name in een plaat gebaseerde indeling, zodat ze met functionele studies van de receptor interfereren. Ten slotte, in elektrofysiologische metingen zoals patch klemmen, er is beperkte doorvoer en grootschalig onderzoek zijn erg duur23. Ondanks zijn de bovengenoemde systemen ongevoelig voor glycine stimulatie; Vandaar, studeren glycine-afhankelijke activiteit van de NMDAR wordt een uitdaging.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de studie van NMDAR dat de besproken beperkingen overwint. Onze techniek speelt in op het systeem van de expressie baculovirus wil de receptor op functionele niveaus met een optimale verhouding van de subeenheden in zo weinig als 16 uur. Anderzijds zorgt het gebruik van baculovirus voor een eenvoudige en combinatorische aanpak, waarmee een globale karakterisering van de verschillende subtypen voor recombinante NMDAR. In tegenstelling tot andere testen vereist dit protocol geen kanaal blokkers vanwege het gebruik van zwakke antagonisten. De sterkste voordeel van de methode is dat na wassen van de zwakke antagonist, de receptor is gevoelig voor modulatie van de individuele glycine - en glutamaat-bandplaatsen naast dual modulatie van zowel glutamaat als glycine/D-serine ligand-bindende sites. De assay recapituleert bekende farmacologie van de NMDAR receptor en de gevolgen van haar bekende positieve en negatieve modulatoren. Ten slotte, deze cellulaire assay in vitro generatie overwint de cellulaire toxiciteit veroorzaakt door buitensporige calcium toestroom en zorgt voor functionele studies van de receptor in een high-throughput mode, die ontdekkingen van NMDAR modulatoren versnellen kan in ziekte staten.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Dual Expression Vector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td><td>Molecular Devices</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Boston Bio Product</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr></tbody></table>

een high-throughput calcium-flux assay te studeren nmda-receptoren met gevoeligheid voor glycine/d-serine en glutamaat

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren (NMDAR) worden geclassificeerd als ionotropic glutamaat receptoren en hebben belangrijke rol bij het leren en geheugen. NMDAR storing, uitgedrukt als ofwel over - of onder - activity veroorzaakt door mutaties, veranderde expressie, mensenhandel of lokalisatie, kan bijdragen aan vele ziekten, met name in het centrale zenuwstelsel. Begrip van de receptor biologie, alsmede het vergemakkelijken van de ontdekking van stoffen en kleine moleculen is daarom van cruciaal belang in voortdurende inspanningen ter bestrijding van neurologische aandoeningen. Huidige aanpak aan het bestuderen van de receptor hebben beperkingen waaronder lage doorvoersnelheid, hoge kosten en het onvermogen om te bestuderen zijn functionele capaciteiten als gevolg van de noodzakelijke aanwezigheid van kanaal blokkers om te voorkomen dat NMDAR-gemedieerde excitotoxicity. Bovendien, de bestaande assay-systemen zijn gevoelig voor stimulatie door glutamaat slechts en gebrek aan gevoeligheid voor stimulatie door glycine, de andere co ligand van de NMDAR. Hier presenteren wij de eerste plaat gebaseerde bepaling met hoge gegevensdoorvoer macht te bestuderen van een NMDA-receptor met gevoeligheid voor zowel mede-liganden, glutamaat en D-serine/glycine. Deze benadering kunt de studie van de verschillende NMDAR subeenheid composities en functionele studies van de receptor in glycine - en/of glutamaat-gevoelige modi. De methode hoeft bovendien niet de aanwezigheid van remmers tijdens de metingen. De effecten van positieve en negatieve allosteric modulatoren met deze test kunnen worden gedetecteerd en de bekende farmacologie van NMDAR is gerepliceerd in ons systeem. Deze techniek overwint de beperkingen van bestaande methoden en rendabel. Wij zijn van mening dat deze nieuwe techniek zal het versnellen van de ontdekking van therapieën voor NMDAR-gemedieerde aandoeningen.

Voor het testen van de effecten van kleine molecules, moet men de optimale expressie niveaus van NMDARs, alsmede de optimale ligand concentraties bepalen. Zoals beschreven, HEK293 cellen werden zaadjes op 10.000 cellen per putje in een 384-well plaat, in aanwezigheid van 5 µM CGP060667, dan getransduceerde met wisselende hoeveelheden van NR1 en NR2A virussen. Na incubatie overnachting, ligand-geïnduceerde calcium flux werd gemeten (Figuur 1). De resultaten va...

Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Deze methode kan helpen bij het ontdekken van NMDA-modulatoren om neurologische ziekten te behandelen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de fissumstudie van NMDA-receptoractiviteit mogelijk maakt, in reactie op afweerconcentraties of combinaties van liganden in verbindingen. Dus deze methode kan inzicht geven in de algemene capaciteit van de NMDA-receptor.Het kan ook worden toegepast om subtypen specifiek in biologie en een gevoeligheid van NMDA-receptor te bestuderen, in reactie op liganden of verbindingen. Om de activiteit van de NMDA-receptor te meten, bereid een 384-wellplaat voor, met HEK 293-cellen, getransduceerd met NR1, NR2, of HEK 293, NR1, NR2A-cellen in aanwezigheid van beschermend compound. Bewaar vervolgens de plaat gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide.De volgende dag, verwijder de plaat uit de incubator, en gooi voorzichtig het celmedium weg, door de plaat langzaam om te draaien boven een compatibel biowaste-container. Tik voorzichtig op de plaat op een papieren handdoek, om het medium van de randen van de plaat te verwijderen, en laat eventueel resterend medium weglopen. Bereid vervolgens de calcium 6-kleurstof voor, d

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video biedt een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van het farmacologische profiel van menselijke TRPA1-kanalen met behulp van FlexStation 3. Het protocol behandelt details over de celvoorbereiding, het laden van de kleurstof en het bedienen van de microplaatlezer, FlexStation 3.

Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.

Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen

Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).

Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Hier presenteren we een protocol om in vitro Ca2+ fluxen in midbrain neuronen en hun downstream effecten op caspase-3 met behulp van primaire muis midbrain culturen te meten. Dit model kan worden gebruikt om pathofysiologische veranderingen in verband met abnormale Ca2 + activiteit in midbrain neuronen te bestuderen, en om nieuwe therapieën voor anti-apoptotische eigenschappen te screenen.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Leer een high-throughput calcium-flux assay voor NMDA-receptoren met HEK 293-cellen. Deze methode analyseert receptormodulatie door kleine moleculen voor neurologische therapieontwikkeling.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

Meer video's verkennen