Kwantificeren van de Plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud, met behulp van maïs (Zea mays) als een Exemplar
6 augustus 2018
De protocollen die hierin worden beschreven zorgen voor een heldere en toegankelijke methode voor het meten van oplosbare eiwitten en verteerbare (niet-structurele) koolhydraatgehalte in plantaardige weefsels. De mogelijkheid om te kwantificeren van deze twee plant macronutriënten heeft aanzienlijke gevolgen voor het bevorderen van het gebied van plantenfysiologie, nutritionele ecologie, plant-herbivoor interacties en voedselweb ecologie.
Deze methode stelt onderzoekers op het gebied van plantenwetenschappen en nutritionele ecologie in staat om nauwkeurig de concentraties van oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten in plantenweefsel te meten. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze een snelle en gemakkelijke methode bieden om deze twee ongelooflijk belangrijke macronutriënten met hoge nauwkeurigheid te kwantificeren. Deze technieken hebben sterke implicaties voor het veld van de ecologie omdat planteneiwitten en koolhydraten de basis vormen van terrestrische voedselketens.
Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn met deze techniek worstelen omdat er verschillende stappen en enkele technieken zijn die niet vaak worden uitgevoerd in een algemeen gebruik laboratorium. Om te beginnen, weegt u repliceer monsters van elk weefsel af in gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Noteer vervolgens de precieze massa van elk monster.
Gebruik een micropipettor om 500 microliter van 0,1 molair natriumhydroxide toe te voegen aan elke buis. Sluit de deksels goed en sonisch verhit de buisjes gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens de buisjes in een voorverwarmd heetwaterbad gedurende 15 minuten.
Centrifugeer de buisjes na dit proces gedurende 10 minuten bij 15.000 G. Pipetteer het supernatant in nieuwe, gelabelde microcentrifugebuisjes, met een nieuwe pipettentip voor elk monster. Voeg 300 microliter van 0,1 molair natriumhydroxide toe aan de pellet, en herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten.
Verwijder na dit proces het supernatant en breng het over naar de buisjes die het supernatant van de eerste centrifugatie bevatten. Om de pH van het supernatant te neutraliseren, voegt u 11 microliter van 5,8 molair zoutzuur toe. Gebruik lakmoespapier om te bevestigen dat de pH ongeveer zeven is.
Voeg vervolgens 90 microliter van 100% trichloroazijnzuur toe aan elke buis. Incubeer vervolgens de buisjes 30 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 13.000 G bij vier graden Celsius.
Gebruik voorzichtig een vacuümlijn en glasmicropipettip om het trichloroazijnzuur te verwijderen. Wees heel voorzichtig om de pellet niet te verstoren met de zuigtip. Was vervolgens de pellet met 100 microliter aceton gekoeld tot 20 graden Celsius en laat het aceton vervolgens verdampen in een afzuigkap.
Los het eiwitpellet op met één milliliter natriumhydroxide. Aanvullende rondes van verhitting, vortexen en sonisch verhitten kunnen nodig zijn. Voeg 160 microliter van elke IGG-standaardoplossing toe aan een 96-wellplaat in drievoudig, beginnend met de A1 positie. Voeg vervolgens in een nieuwe 1,5 milliliter buis 50 microliter van elke monsteroplossing toe aan 950 microliter gedestilleerd water.
Voeg vervolgens 60 microliter van elk verdunde monster toe aan de plaat in drievoudig, beginnend met de H1 positie. Voeg 100 microliter gedestilleerd water toe aan alle lege en onbekende monsterwells. Gebruik een multi-kanaals pipettor om 40 microliter Coomassie Brilliant Blue G-250 eiwitkleurmiddel toe te voegen aan elk wel van de plaat.
Gebruik een naald om eventuele bubbels in de wells te verwijderen. Laat vervolgens de plaat vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een microplaatspectrofotometer om de absorptiewaarden voor elke well bij 595 nanometer te registreren.
Weeg eerst replieken van elk weefselmonster af in glazen 15 milliliter buisjes. Label de buisjes en noteer de exacte massa van elk monster. Voeg vervolgens één milliliter 0,1 molair zwavelzuur toe aan elke buis en sluit de doppen goed.
Plaats vervolgens de buisjes een uur lang in een kokend waterbad. Breng de buisjes over naar een lauw waterbad om af te koelen. Giet vervolgens de inhoud van de buisjes in gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.
Centrifugeer de buisjes na dit proces gedurende 10 minuten bij 15.000 G. Gebruik een micropipettor om het supernatant over te brengen naar nieuwe, gelabelde 1,5 milliliter buisjes. Gebruik een pipettor om 15 microliter van elk onbekend monster over te brengen naar zijn eigen testbuis.
Voeg vervolgens 385 microliter gedestilleerd water toe aan elke buis. Voeg in een afzuigkap 400 microliter van 5% fenol toe aan elke standaard en onbekende monstertestbuis. Voeg onmiddellijk daarna twee milliliter zwavelzuur toe aan elke buis.
Zorg ervoor dat u het zwavelzuur toevoegt aan het oppervlak van de oplossing. Na het incuberen van de buisjes gedurende 10 minuten, vortex de buisjes. Incubeer de buisjes vervolgens nog eens 30 minuten.
Breng 800 microliter van elk monsterbuisje over naar drie polystyreen 1,5 milliliter semi-microcuvettes. Stel vervolgens de spectrofotometer in om bij 490 nanometer te lezen en kalibreer met een lege cuvet. Ten slotte voert u elke cuvet door de spectrofotometer en noteert u de absorptie.
Met behulp van dit protocol werd het oplosbare eiwit- en verteerbare koolhydraatgehalte van vier verschillende veld- en zoete maïsweefsels uit drie geografische regio's geanalyseerd. Er werden significante verschillen in oplosbaar eiwitgehalte waargenomen tussen de regio's, waardoor afzonderlijke analyses voor elke regio noodzakelijk waren. Tussen regio's waren er verschillende verschillen in oplosbaar eiwit- en verteerbaar koolhydraatgehalte tussen weefsels.
In Minnesota varieerden weefsels alleen in oplosbaar eiwitgehalte, terwijl North Carolina weefsels varieerden in zowel oplosbaar eiwit als verteerbare koolhydraten. De variabiliteit in macronutriëntengehalte in weefsels in Texas was afhankelijk van de variëteit. Deze techniek zal onderzoekers op het gebied van plantenwetenschappen en nutritionele ecologie in staat stellen om precies oplosbaar planteneiwit en verteerbare koolhydraten te meten, in plaats van extrapoleren van elementaire maatregelen.
Vergeet niet dat het werken met vloeibaar stikstof, geconcentreerde zuren en basen buitengewoon gevaarlijk
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert methodologieën voor het meten van oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten in plantenweefsels. Deze technieken zijn essentieel voor het begrijpen van de plantenfysiologie en ecologische interacties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Plantwetenschappen
- Nutritionele Ecologie
- Ecologie
Achtergrond
- Het kwantificeren van macronutriënten is essentieel voor het bestuderen van voedselwebben.
- Oplosbare eiwitten en koolhydraten vormen de basis van terrestrische ecosystemen.
- Nieuwe onderzoekers kunnen de technieken uitdagend vinden vanwege de complexiteit.
- Nauwkeurige meting is cruciaal voor ecologisch onderzoek.
Doel van de studie
- Om een heldere methodologie te bieden voor het meten van macronutriënten in planten.
- Om het begrip van interacties tussen planten en herbivoren te vergroten.
- Om onderzoek in de plantenfysiologie en ecologie te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Weeg herhaalde monsters van plantweefsel.
- Gebruik gelabelde microcentrifugebuisjes voor de opslag van monsters.
- Noteer de exacte massa van elk monster.
- Volg specifieke protocollen voor een nauwkeurige meting.
Belangrijkste resultaten
- Technieken bieden een hoge nauwkeurigheid bij het meten van macronutriënten.
- Methoden zijn snel en eenvoudig zodra ze onder de knie zijn.
- Resultaten hebben significante implicaties voor ecologische studies.
- Faciliteert een beter begrip van de nutritionele inhoud van planten.
Conclusies
- Nauwkeurige meting van oplosbare eiwitten en koolhydraten is haalbaar.
- Deze methoden kunnen het onderzoek in diverse ecologische vakgebieden bevorderen.
- Inzicht in macronutriënten van planten is essentieel voor de dynamiek van voedselwebben.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige kwantificering van macronutriënten in planten ondersteunt de validatie van doelstellingen in de nutritionele ecologie en het mechanistische risicobeheer van modellen voor interacties tussen planten en herbivoren. Directe meting van oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten verbetert het voorspellend vertrouwen in studies naar voedselwebdynamiek door de afhankelijkheid van geëxtrapoleerde elementaire correlaties te verminderen. Dit maakt een betrouwbaardere ontdekking van translationele biomarkers en de ontwikkeling van preklinische modellen mogelijk in onderzoekslijnen op basis van planten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van nutritionele hypothesen mogelijk door nauwkeurige gegevens over oplosbare eiwitten en koolhydraten te verschaffen voor doelvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via reproduceerbare kwantificering van belangrijke macronutriënten in planten over verschillende weefseltypen en teeltregio's.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor assays van oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten, wat de assay-gereedheid en schaalbaarheid bevordert.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door geoptimaliseerde digestiestappen en colorimetrische detectie, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in screening-workflows mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt plantenmineralenvoeding met fysiologische processen, wat de translationele continuïteit ondersteunt van ontdekking tot preklinische validatie.
- Operationele waarde: Levert ziekte-relevante systeemdata voor studies naar nutritionele ecologie, waardoor risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang in plantaardig onderzoek worden verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in discovery biology-workflows door kwantitatieve macronutriëntgegevens te leveren die bijdragen aan hypothesetoetsing en het verhelderen van signaalpaden in modellen van plant-herbivoorinteracties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie door nauwkeurige meting van oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk via kwantitatieve colorimetrische readouts voor het oplosbare eiwit- en koolhydraatgehalte.
- Analytics: Genereert nauwkeurige spectrophotometrische metingen bij 595 nm (eiwit) en 490 nm (koolhydraat) om condities tussen weefsels en regio's te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de nutritionele inhoud van planten met ecologische uitkomsten, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers in studies naar voedselwebdynamiek.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor macronutriëntenkwantificering dat toepasbaar is over verschillende plantensoorten en onderzoekcontexten.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in nutritionele assays voor planten, vermindering van mechanische ambiguïteit in ecologische modellering.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de kwantificering van oplosbare eiwitten en koolhydraten.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen bij doelwitvalidatie, kapitaalefficiëntie bij de ontwikkeling van assays, verminderd biologisch risico in een laat stadium bij preklinische modellen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van plantgebaseerde doelwitten op basis van gevalideerde macronutriëntenprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de behandeling van plantenweefsel, colorimetrische assays en spectrophotometrische analyse.
- Vereist instrumentarium, waaronder microcentrifuges, waterbaden, vortexers en microplaat-spectrophotometers.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de digestie-, neutralisatie- en precipitatiestappen voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan variërende plantenweefsels, soorten en geografische herkomst.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de omgang met gevaarlijke reagentia (NaOH, HCl, TCA, fenol, zwavelzuur), waarvoor strikte veiligheidsprotocollen vereist zijn.
