Name: Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Leer een reproduceerbare qPCR-methode voor het kwantificeren van T7-bacteriofaag uit biopanning-experimenten. Deze techniek biedt tijdbesparende en nauwkeurige enumeratie voor virologisch en microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door PhRMA Stichting onderzoeksbeurs Starter en de nationale hart-, Long- en bloed Instituut van het National Institutes of Health verlenen award onder nummer R01HL138251.

1. primer ontwerp en analyse voor T7 Phage Genomic DNA
<ol><li>Het ontwerpen van inleidingen voor versterking van T7 phage genomic DNA. Opmerking: F (in voorwaartse richting) en R (omgekeerde) inleidingen (Zie Tabel van materialen) versterken de T7 DNA-sequentie ligt stroomopwaarts van de bibliotheek variabele regio (Figuur 1).</li>
	<li>Kies een geschikte primer analyzer te evalueren van de parameters van de inleidingen, waaronder smelttemperatuur (Tm), percentage GC-inhoud (GC %), inleidingsdimeer, haarspeld vorming en PCR geschiktheid (Figuur 1).</li>
	<li>Bestel de primer oligonucleotides (oligos), en bij aankomst, resuspendeer de gelyofiliseerd oligos in DNase en RNase gratis ultra pure water 100 µM voorraad concentraties in een centrifugebuis 1,5 mL maken en opslaan bij-20 ° C voor enkele maanden.</li>
	<li>Verschillende hoeveelheden (ongeveer 50 µL in elke buis 1,5 mL) van de 100 µM primer voorraad maken. Opmerking: Deze stap wordt gebruikt om te voorkomen dat frequente bevriezen-ontdooien cycli.</li>
</ol>2. voorbereiding van de normen voor kwantificering van T7 Phage Genomic DNA
<ol><li>Serieel Verdun 0,1 µg/µL (1.0 x 108 fg/µL) referentie T7 phage DNA (gekocht; bij een bekende concentratie van 0,1 µg/µL, zie materialen) 10-fold van 1,0 x 106 tot en met 1.0 x 100 fg/µL met ultra zuivere H2O in 0,2 mL PCR buizen. Bereiden elke concentratie in een totaal volume van 20 µL (Figuur 2).</li>
	<li>Vortex PCR buizen zodat homogenisatie van het mengsel bij elke stap van verdunning. Ook veranderen tips bij het toevoegen van het DNA-monster met de volgende verdunning. Opmerking: Het wordt aanbevolen voor te bereiden op nieuwe oplossing van DNA normen een standaard curve voor elke batch van het qPCR-experiment.</li>
	<li>De vergelijking 1 (zie hieronder) gebruiken om te converteren voor T7 phage referentie DNA concentraties van fg/µL naar genoom kopieën (gc) /µL (Figuur 2).</li>
	<li>T7 phage DNA concentratie in gc/µL = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) Opmerking: bp: basenpaar; Referentie T7 genomic DNA is 37314 bp.</li>
</ol>3. voorbehandeling van Phage monsters vóór qPCR reactie voorbereiding
<ol><li>
(Optie 1) Pipetteer 20 µL van een T7 kloon (faag) geselecteerd uit biopanning tegen in vitro cystic fibrosis (CF)-als slijm model in 1,5 mL centrifuge buizen. Toevoegen van 1,25 eenheden van DNase I (0,5 µL) bij elk monster 20 µL. Opmerking: T7 phage cysteïne beperkte heptapeptide bibliotheek (CX7C) werd biopanned tegen CF-achtige slijm bekleed op 24-well membraan inserts (Zie Tabel van materialen) gedurende 15 minuten. Verdere details vindt u in het gedeelte ' resultaten '. Een kloon van de T7 werd gekozen voor de bereiding van de monsters van de qPCR van het eluaat.<ol>
<li>Optie 2: Pipetteer 200 µL van de T7 klonen in een buizen 1,5 mL en voeg toe 5 eenheden van DNase ik (2 µL) aan elk monster. Opmerking: Het volume van phage monster geselecteerd bij deze stap is afhankelijk van het verzamelde volume van biopanning. Terwijl de focus van het protocol op de qPCR van biopanned bacteriofaag is, kit de stappen voor biopanning worden beschreven in het protocol van de gebruiker van de T7 phage (Zie Tabel van materialen)13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cap de T7 phage monster buizen (stap 3.1) en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten in een verwarmde droge bad (dat wil zeggen, warmte blok).</li>
	<li>Incubeer buizen (uit stap 3.2) bij 100 ° C gedurende 15 min. in een verwarmde droge bad (figuur 3A). Let op: Aangezien verdamping en condensatie tijdens de verwarming stap optreden, zorg ervoor dat de 1,5 mL centrifuge buizen volledig zijn afgetopt.</li>
	<li>Draai de warmtebehandelde bacteriofagen uit stap 3.3 bij 18,534 x g voor 10 s. Mix de bacteriofagen door het plaatsen van de buis op een vortex-mixer vastgesteldop touch-activering modus voor 10 s, en spin bij 18,534 x g gedurende 10 s weer. Opmerking: De spin-mix-spin-cyclus is om ervoor te zorgen dat de verwarmde faag monsters goed vermengd zijn.</li>
	<li>De buizen monster bij kamertemperatuur (RT) afkoelen door hen te verlaten op de experiment bankje of bewaren bij 4 ° C in een koelkast 's nachts. Opmerking: Experiment kan worden onderbroken bij deze stap.</li>
</ol>4. bereid qPCR reacties
Opmerking: Een PCR reactie is voor één monster. Elke PCR reactie bevat 5 µL van qPCR meester Meng (Zie materiaal), 1 µL van 5 µM primer paar mix, 2 µL van H2O en 2 µL van warmtebehandelde T7 phage monster. Voor meerdere PCR reacties, zijn alle reagentia behalve faag monster vooraf gemengd in een tube van 1,5 mL. Het volume van elk reagens in de premix is afhankelijk van het aantal faag monsters voor qPCR.
<ol><li>De qPCR premix voorbereiden op 10 biopanned faag monsters van de onbekende concentratie en 7 voorbeelden van standaard concentraties in drievoud. Dientengevolge, zijn er 51 alle monsters en daarom 51 qPCR Reacties (dat wil zeggen, een reactie per monster). 51 reacties, opstellen een premix van 255 µL van qPCR master mix (51 x 5 µL), 51 µL van inleidingen (51 x 1 µL) en 102 µL van H2O (51 x 2 µL). Opmerking: Het wordt aanbevolen om voor te bereiden van een paar extra PCR reacties om te compenseren voor het verlies van volume tijdens aliquoting de PCR-mix in elk putje van de qPCR van de 96-wells-plaat.</li>
	<li>Aliquot 8 µL van het PCR premix in elk putje van de plaat van de 96-Wells-qPCR voor een totaal van 51 wells (dat wil zeggen, 51 qPCR reacties). Er is geen behoefte om te veranderen van tips tijdens aliquoting.</li>
	<li>2 µL van warmtebehandelde T7 phage monsters (stap 3.4) of T7 phage referentie DNA (stap 2.1) toevoegen aan elk putje (figuur 3B); tips bij het toevoegen van verschillende DNA-monsters naar de waterput ter voorkoming van kruisbesmetting wijzigen Ook afzien de 2 µL DNA-monsters onder het oppervlak van de qPCR premix (dat wil zeggen, in de 8 µL PCR premix).</li>
	<li>De qPCR plaat met kleeffilm zegel. Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang, ongeacht het type van qPCR plaat. Gebruik de aanbevolen kit voor het afdichten van de plaat volledig; anders, iedere niet-verzegelde regio in de plaat volume verlies zal veroorzaken tijdens PCR fietsen.</li>
	<li>Wikkel de qPCR plaat met aluminiumfolie om te minimaliseren van de fluorescentie photobleaching en gaan draaien op de qPCR-apparatuur.</li>
</ol>5. qPCR Cycling voorwaarden
Opmerking: qPCR fietsen voorwaarden werden opgericht op de specifieke qPCR-apparatuur (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>De qPCR van de 96-wells-plaat op de qPCR-apparatuur uitgevoerd. Op het apparaat door instellingen te selecteren in het menu de volgende proefomstandigheden (Figuur 3 c) instellen.</li>
	<li>Instellen als volgt voorwaarden een monstervolume van 10 µL fietsen: één cyclus bij 50 ° C gedurende 2 minuten, één cyclus bij 95 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40 cycli van (95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min). Daarna lopen de smelt curve-instellingen: een cyclus van 95 ° C voor 15 s, 60 ° C gedurende 1 minuut, en 95 ° C 15 s.</li>
	<li>Ga verder met het analyseren van de gegevens, zoals beschreven in stap 6.</li>
</ol>6. de qPCR Raw Data analyseren en omzetten van qPCR Ct waarde naar gc/µL voor T7 bacteriofagen
<ol><li>De ruwe qPCR analyseren en evalueren van de kwaliteit van de gegevens door het analyseren van de karakteristieke percelen van de ruwe gegevens (Figuur 4). Opmerking: Versterking plot, multicomponent plot en smelt kromme plot zijn dat het voornaamste aspect percelen voor het valideren van de kwaliteit van de gegevens van qPCR.</li>
	<li>
Bereken de gemiddelde drempelwaarden voor cyclus (Ct) van de drievoudige monsters bij elke concentratie van de standaard curve (stap 2.1).
	<ol>
<li>Uitzetten van de gemiddelde Ct (Y) tegen log (gc/µL) (X) om de lineaire curve Y = kX + b (k is de helling van de lineaire curve, b is het snijpunt).</li>
		<li>Berekenen van de coëfficiënt van de lineaire14 R2 (R2 moet > 0.99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de standaard curve Y = kX + b voor de berekening van het aantal T7 bacteriofagen in de biopanning monsters (dat wil zeggen, bacteriofagen geselecteerd tegen CF-achtige slijm) in gc/µL (Figuur 5). Opmerking: k is de helling van de standaard curve.</li>
	<li>De efficiëntie van de versterking van de volgende vergelijking berekenen <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) Opmerking: k is de helling van de standaard curve gegenereerd op basis van referentie DNA qPCR. Het ideale bereik van versterking efficiëntie is 90-110%.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
<li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20020040">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li>
<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
<li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li>
<li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li>
<li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li>
<li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li>
<li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li>
<li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li>
<li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li>
<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li>
<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
<li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure%3A+A+Kinetic+Study%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij qPCR methodes om te kwantificeren van phage genomic DNA5ontwikkeld, en hier wij beschreven en aangepast van een qPCR methode om te inventariseren T7 bacteriofagen geselecteerd tegen een versperring CF-achtige slijm. Minimuminformatie voor publicatie van kwantitatieve Real-Time PCR experimenten (MIQE) richtsnoeren werden aangepast om te ontwikkelen en valideren van de methode van de qPCR opsomming van de T7 bacteriofagen15. Het protocol dat wij ontwikkeld om te kwantific...

Bacteriofaag (faag) display technologie, ontwikkeld door George Smith in 1985, is een krachtige, high-throughput benadering te identificeren van peptide of de proteïne liganden tegen doelstellingen of receptoren van het celmembraan, ziekte antigenen, cellulaire organellen of specifiek organen en weefsels in de afgelopen twee decennia1,2. Hier, willekeurige bibliotheken van polypeptiden of één keten antilichamen worden weergegeven op de vacht eiwitten van bacteriofagen (meestal M13 of T7), en specifieke liganden kunnen worden geïdentificeerd van pannen tegen geïmmobiliseerdet eiwitten in vitro of in vivo biologische systemen via een iteratieve selectietraject. Vervolgens kunnen liganden gepaard gaan met imaging of therapeutische agenten voor diagnose en behandeling van ziekten3,4. Het is van cruciaal belang om op te sommen nauwkeurig bacteriofagen tijdens meerdere stappen van biopanning: (1) te kwantificeren bacteriofagen die zich aan het substraat binden en (2) te kwantificeren bacteriofagen om te bepalen of er verrijking met elke ronde van de selectie (bacteriofaag verrijking geeft aan biopanned Phage affiniteit voor de doelgroep). De huidige gouden standaard voor kwantificering, dubbellaags plaque assay, presenteert meerdere uitdagingen; het is vervelend, omslachtige en potentieel onjuist is voor een groot aantal monsters. Daarom heeft onze fractie een gevoelige, reproduceerbaar, nauwkeurige en tijd-efficiënte kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) methode om te inventariseren M13 en T7 phage deeltjes van biopanning5ontwikkeld.
qPCR is een aantrekkelijke en haalbare methode om T7 en M13 bacteriofagen nauwkeurig te kwantificeren. Omdat elk deeltje van de individuele faag slechts één exemplaar van genomic DNA (dsDNA of ssDNA) bevatten kan, is een bacteriofaag genoom gelijk aan één phage deeltjes; door het kwantificeren van het aantal faag genomen, is het mogelijk te kwantificeren van het aantal bacteriofagen. Tijdens qPCR, fluorescerende verslaggever kleurstoffen binden genomic DNA van de bacteriofaag niet-specifiek of specifiek door middel van sequentie-specifieke primers tijdens PCR versterking, en de fluorescentie signaal verhoogt met elke ronde voor amplificatie. Wanneer het signaal van de fluorescentie bereikt de drempel, die ronde/cyclus van versterking is bekend als de drempel cyclus (Ct). De bekende concentraties van referentie phage DNA worden uitgezet tegen hun Ct-waarden om een standaard curve. Met behulp van de standaard curve met de Ct-waarden van DNA-monsters, kunnen de concentraties van bacteriofagen worden geïnterpoleerd.
Terwijl talrijke strategieën zijn eerder ontwikkeld en uitgebreid te kwantificeren bacteriofagen van biopanning gebruikt, heeft elk van hen specifieke uitdagingen. De meest populaire en conventionele methode is dubbellaags plaque assay. Hier, host bacteriën geïnfecteerd zijn met bacteriofagen voorbereid op een seriële verdunningen, op een solide agar substraat zijn verguld en zijn bedekt met agar; met het aantal plaques gevormd (dat wil zeggen, plaque vormende eenheden of pfu) op de agarplaat bacteriofagen geïnventariseerd. Plaque assay is gevoelig maar vervelend, tijdrovend en onnauwkeurig, vooral voor talloze voorbeelden en met hoge concentraties5. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zijn bovendien aangepast om op te sommen M13 en T7 phage deeltjes6,7,8. Hier, bacteriofagen in verschillende verdunningen zijn gebonden en gevangen op een stevige ondergrond (dat wil zeggen, een microplate) gesondeerd met faag-specifieke antilichamen en opgespoord door middel van verslaggevers (bijvoorbeeld enzym gevoelige chromogenic substraten, fluorophores) te Bepaal het aantal phage deeltjes aanwezig. De uitlezingen (b.v., fluorescentie, absorptie) van monsters kunnen te kwantificeren van onbekende concentraties tegen faag normen bij bekende concentraties worden gebruikt. Verschillende faag gebaseerde ELISAs zijn ontwikkeld, maar ze hebben potentiële beperkingen. Een groep ontwikkelde een papieren sandwich-ELISA met een kwantificering bereik dat omvatte zeven ordes van grootte (102-109 pfu/mL); echter, deze methode vereist meerdere stappen van antilichaam coating, kwam een hele dag voor de test-8. Onze fractie ook ontwikkelde een ELISA-methode om te kwantificeren M13 phage deeltjes maar had een minder gevoelige registratiebereik van 106  1011 pfu/mL5. Schakelbare lanthanide fluorescentie sondes zijn ontwikkeld om te inventariseren M13 en kwantificering gegevens kunnen worden verkregen binnen 20 min; Deze bepaling heeft echter een smalle dynamisch bereik van 109 tot en met 1012 pfu/mL9. Één groep atomaire kracht microscopie gebruikt om op te sommen M13 phage deeltjes in oplossing, maar dit vereist geavanceerde elektronenmicroscopie en werkte slechts binnen een smalle bandbreedte van concentraties10. Een andere studie monodispers emulsies gebruikt om val fluorescerende M13 en T4 verslaggever bacteriofagen en bacteriofagen tellen het aantal fluorescerende druppels; echter, deze aanpak ook tentoongesteld een smalle kwantificering variëren van 102 tot en met 106 pfu/mL11. Terwijl de druppel die digitale PCR te kwantificeren M13 bacteriofagen is gebruikt, is deze aanpak kunnen onderscheid maken tussen het aantal infectieuze en niet-infectieuze phage deeltjes12.
Onze fractie heeft onlangs qPCR methoden voor het inventariseren van de T7 en M13 bacteriofagen geïdentificeerd van biopanning tegen een bloed - hersenbarrière cel model met twee verschillende fluorescente verslaggever kleurstoffen5ontwikkeld. In vergelijking met voornoemde kwantificering methoden, de methoden van de qPCR we ontwikkeld waren high-throughput en tijd-efficiënte te kwantificeren van talloze voorbeelden en bekwaam om te onderscheiden tussen infectieuze en niet-infectieuze bacteriofagen met DNase ik voorbehandeling van de Phage monsters. Nog belangrijker is, deze aanpak kan reproducibly en nauwkeurig te kwantificeren M13 en T7 bacteriofagen van biopanning monsters. Begeleiden van beginnende onderzoekers op het gebied van phage qPCR, beschrijven hier we een gedetailleerde qPCR methode om te inventariseren T7 phage deeltjes uit een bibliotheek van cysteïne-beperkt (CX7C) laten draaien tegen een in vitro -barrière van het cystic fibrosis (CF)-slijm. Van dit werk, kan qPCR methode worden uitgebreid om te kwantificeren van phage deeltjes van andere soorten biopanning en uit andere bronnen, met inbegrip van water, bodem en lichaamsvloeistoffen.

<table><tbody><tr><td>Materialen en Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers voor T7 genomisch DNA</td><td>IDT</td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Select verpakkingscontrole DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optische 96-well reactieplaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td><td>Applied biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optische kleeffolie kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>70015</td><td>Gebruikersprotocollen : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>DNase I oplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>24-well transwell plaat</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Gedestilleerde H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferd Saline (1x)</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real-Time PCR Systeem met Fast 96-Well Blok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO WETENSCHAPPELIJK Multi-Blok Heater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Model:2001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Microplate Zwaaiende Emmer Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Real-time PCR software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Real-time qPCR primer ontwerp</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve pcr van t7 bacteriofaag van biopanning

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Dit protocol beschrijft het gebruik van kwantitatieve PCR (qPCR) om op te sommen T7 bacteriofagen van phage selectie experimenten (dat wil zeggen, "biopanning"). qPCR is een fluorescentie gebaseerde aanpak te kwantificeren van DNA, en hier, het is aangepast aan het kwantificeren van phage genomen als een proxy voor phage deeltjes. In dit protocol wordt een facile phage DNA voorbereiding methode beschreven met behulp van hoge-temperatuur verwarming zonder extra DNA zuivering. De methode moet alleen kleine volumes van warmtebehandelde bacteriofagen en kleine volumes van de reactie van de qPCR. qPCR is hoge gegevensdoorvoer en snel, kunnen verwerken en het verkrijgen van gegevens van een 96-wells-plaat van reacties in 2-4 h. vergeleken tot andere faag opsomming benaderingen, qPCR is tijd-efficiënter. Hier, wordt qPCR gebruikt om op te sommen T7 bacteriofagen geïdentificeerd van biopanning tegen in vitro cystic fibrosis-achtige slijm model. De qPCR methode kan worden uitgebreid om te kwantificeren T7 bacteriofagen uit andere experimenten, met inbegrip van andere soorten biopanning (bv., faag screening geïmmobiliseerd binding aan eiwitten, in vivo ) en andere bronnen (bijvoorbeeld watersystemen of lichaamsvloeistoffen). Kortom, kan dit protocol worden aangepast voor het kwantificeren van virussen DNA ingekapseld.

Tools voor het ontwerpen van verschillende primer kunnen worden gebruikt om qPCR inleidingen ontwerpen. Typisch, primer ontwerp programma's hebben hun eigen ingebouwde algoritmen om te berekenen en valideren van de essentiële parameters van de inleidingen, bijvoorbeeld GC %, Tm, primer dimeer of haarspeld vorming, etc. in het algemeen, de belangrijkste criteria zijn vergelijkbaar in verschillende primer ontwerptoepassingen en inleidingen kunnen worden ontworpen hun instr...

Een reproduceerbare, accuraat en tijd efficiënt kwantitatieve PCR (qPCR) methode om op te sommen T7 bacteriofaag wordt hier beschreven. Het protocol geeft een duidelijke beschrijving van phage genomic DNA voorbereiding, PCR reactie voorbereiding, qPCR fietsen voorwaarden en qPCR data-analyse.

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke problemen in de virologie en microbiologie velden in verband met de opsoming van bacteriofagen uit complexe monsters en bacteriofaag gebaseerde diagnostiek en therapieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdefficiënte en nauwkeurige kwantificering van een groot aantal monsters uit faag display biopanning experimenten niet haalbaar met traditionele testen mogelijk maakt. Het aantonen van de procedure zal Rashmi Mohanty en Jasmim Leal, afgestudeerde studenten van mijn laboratorium.Na het ontwerpen van de primers en het creëren van een voorraadconcentratie, verkrijgen referentie T7 faag DNA bij een concentratie van 0,1 microgram per microliter. Met behulp van ultrazuiver water verdunnen dit DNA in serie tienvoudig, van een miljoen femtogrammen per microliter tot één femtogrammen per microliter in 0,2 milliliter PCR-buizen. Bereid 20 microliter van elke concentratie, zorg ervoor dat pipet tips en vortex de buizen tussen elke fase van de verdunning te veranderen.Zet vervolgens de T7 faagreferentie-DNA-concentratie van femtogrammen per microliter om in genoomkopieën per microliter. Ten eerste, pipet 200 microliters van het monster T7 faag kloon in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis voor elk van de 10 gewenste monsters. Voeg twee microliter DNase een aan elke buis.Dop de buizen en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten in een verwarmd droog bad. Dan incubeer op 100 graden celsius gedurende 15 minuten in een verwarmd droog bad. Centrifugeren de buizen met de warmte behandeld fagen op 18, 534 keer g gedurende 10 seconden.Plaats de gecentrifugeerde buizen op een vortex mixer ingesteld op touch activering modus voor 10 seconden om de fagen te mengen. Draai opnieuw op 18, 534 keer g gedurende 10 seconden. Laat hierna de monsters ongeveer een uur op de laboratoriumbank liggen om ze op kamertemperatuur te koelen.Bereid de qPCR premix voor op 10 biopanned faagmonsters met onbekende concentratie en zeven monsters van standaardconcentraties in drievoud. Resulterend in een premix voor 51 monsters met 255 microliter qPCR master mix, 51 microliter primers en 102 microliter water. Aliquot acht microliters van de geprepareerde PCR mix in 51 putten van een 96-well qPCR plaat.Voeg vervolgens twee microliters van warmte behandelde T7 faagmonsters toe aan elk van deze putten, waardoor het onder het oppervlak van de qPCR premix wordt afgegeven. Verzegel de plaat met lijmfolie. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om fluorescentiefoto bleken te minimaliseren en ga vervolgens verder met het uitvoeren van de plaat op de qPCR-apparatuur.Stel de fietsomstandigheden in en smeltcurve-instellingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de qPCR is uitgevoerd, worden de versterkingsplot, smeltcurve plot, en multicomponent plot geanalyseerd uit de ruwe gegevens. De versterkingsplot geeft aan of de PCR-versterking van elk monster succesvol is of niet.De multicomponent plot vertegenwoordigt de versterking en het verval van het fluorescerende signaal gedurende de versterking cycli. Terwijl de smeltcurve plot wordt gebruikt om de specificiteit van de primers te valideren, omdat elk PCR-product heeft een unieke smelttemperatuur. De standaardcurve wordt vervolgens gegenereerd uit het referentie-DNA.Hier wordt de versterkingsefficiëntie berekend op 92,4%Representatieve gegevens uit een qPCR-studie worden vervolgens vergeleken met dezelfde faag die werden gekwantificeerd door een dubbele laag plaquetest op het geteste bereik van 10 tot 10 miljoen genoomkopieën per microliter. Zoals hier te zien is, is het aantal fagen in de qPCR-kwantificering hoger dan in de plaquetest. De herhaalbaarheid van de qPCR-methode zoals vertegenwoordigd door de coëfficiënt van variantie wordt gezien met waarden variërend van 2,85 tot 27,2%Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat er tal van overwegingen in de ontwikkeling en het gebruik van qPCR nauwkeurig kwantificeren fagen, met inbegrip van zorgvuldige behandeling en voorbereiding van monsters en kalibratie van relevante apparatuur.Volgens deze methode kunnen andere technieken worden uitgevoerd om faagdeeltjes op te sommen in een verscheidenheid van toepassingen die zijn opgenomen in vivo biopanning, faagbibliotheek DNA-voorbereiding en volgende generatie sequencing en faagdetectie in complexe milieumonsters. Vergeet niet dat fagen worden beschouwd als biologische gevaren in het laboratorium en voorzorgsmaatregelen zoals persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en labjassen, moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van de procedure.

quantitative-pcr-of-t7-bacteriophage-from-biopanning

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we discuss the quantitative polymerase chain reaction, qPCR, to enumerate T7 bacteriophages through DNA quantification. The fluorescent dye in the PCR mixture binds with the newly synthesized DNA strands and emits fluorescence, which is measured.

Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophages

This video demonstrates a method to study protein-drug interactions using QCM biosensor-based biopanning of the T7 phage-displayed peptide library. The biopanning of phages displaying a specific peptide on the QCM biosensor allows specific isolation of high-affinity peptides, followed by amino acid sequencing, which helps to identify specific interaction sites on the target protein.

Quartz-Crystal Microbalance Biosensor-Based Biopanning to Study Protein-Drug Interactions

Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.

Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

We beschrijven gevoelige, gel-gebaseerde discontinue assays om de kinetiek van lagging-strandinitiatie te onderzoeken met behulp van de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7.

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Dit protocol maakt het mogelijk om de impact van profagen op hun gastheren te onthullen. Bacterieculturen worden gesynchroniseerd met behulp van omstandigheden die de lysogene toestand het beste ondersteunen, waardoor spontane inductie wordt beperkt. RT-qPCR maakt ondubbelzinnig onderscheid tussen profaagbeperkte genen en genen die zijn losgekoppeld van faagcontrole en genen die tot expressie worden gebracht tijdens de lytische replicatiecyclus.

Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Nauwkeurige kwantificering van kopieën van het vectorgenoom van adeno-geassocieerd virus (AAV) is van cruciaal belang, maar er moet nog een gestandaardiseerd protocol worden opgesteld. Dit protocol beschrijft een gevalideerde methode voor het bereiden van gezuiverde AAV-monsters en het uitvoeren van een digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd_PCR) om de virale genoomtiter betrouwbaar te kwantificeren.

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

Leer een reproduceerbare qPCR-methode voor het kwantificeren van T7-bacteriofaag uit biopanning-experimenten. Deze techniek biedt tijdbesparende en nauwkeurige enumeratie voor virologisch en microbiologisch onderzoek.

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

Meer video's verkennen