Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de analytische chemie, biochemie en biotechnologie. Zoals, wat zijn de veranderingen die optreden in de cafeïne biosynthese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, is dat het kan worden toegepast op invitro plant modellen die cafeïne produceert.

Om te beginnen voegt u 10 milliliter aceton toe aan de lyophilized cellen en sluit u de kolf af voordat u de vortexmixer gedurende 30 seconden mengt. Meng vervolgens het monster bij 100 rpm met een rotator gedurende vijf uur bij kamertemperatuur. Daarna moet u het monster opnieuw opschorten met 25 microliter aceton.

Breng eerst een microliter van het eerder bereide cafeïne-extract aan op de silicagelplaten. Ontwikkel vervolgens de TLC in de chromatografiekamer met 10 milliliter van de mobiele fase, cyclohexaanaceton. Visualiseer de cafeïnebanden in korte golflengte ultraviolet, met een compacte UV-lamp.

Daarna kwantificeren cafeïne niveaus door densitometrie op 273 nanometer. Met behulp van filterpapier filtert u de eerder voorbereide celsuspensie. Gebruik vervolgens een porseleinmortel om het celmonster te macereren, met vloeibare stikstof en RNA-isolatiereagens, totdat het gehomogeniseerd is.

Breng vervolgens 500 microliter van het monster over naar een steriele microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 300 microliter chloroforme isoamylalcohol toe en 300 microliter van geëquilibreerd fenol. Meng het monster met een vortex mixer en centrifugeren op 20,000G gedurende 15 minuten op vier graden Celsius.

Breng hierna 300 microliter van de bovenste fase over naar een schone microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 200 microliter isopropanol toe en broed de buis gedurende een uur uit bij negatieve 20 graden Celsius. Voeg een milliliter ethanol toe aan de pellet.

Dan, centrifuge de buis op 12,000 G gedurende 10 minuten en decanteren de vloeibare fase. Droog vervolgens het monster 1,5 uur op kamertemperatuur. Hang vervolgens het RNA-extract opnieuw op met 25 microliter met DEPC-behandeld water.

Voeg eerst twee microgram totaal RNA-extract toe aan een steriele microcentrifugebuis. Voeg vervolgens een microliter van 10X-reactiebuffer en één microliter DNase toe. Breng het uiteindelijke volume van de reactie naar 10 microliter met DEPC-behandeld water.

Meng vervolgens het monster en centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut. Vervolgens, incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg hierna een microliter van 50 micromolar disodium ethyleendiamine tetraacetaat toe om de reactie te stoppen.

Broed het monster 10 minuten in op 65 graden Celsius. Breng vervolgens 100 nanogram RNA aan op een agarosegel en voer de gel uit. Visualiseer de integriteit van het RNA met behulp van een gel foto documentatiesysteem.

Voeg eerst 2,5 microgram totaal RNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg vervolgens een microliter oligo deoxythymidine primer toe en vul de buis tot een eindvolume van 13 microliters met nuclease-vrij water. Meng het monster en centrifugeren op 2,000 G voor een minuut.

Broed het monster vijf minuten lang uit op 65 graden Celsius. En dan op vier graden Celsius gedurende twee minuten. Voeg vervolgens vier microliters 5x-reactiebuffer, twee microliters van dNTP-mix en één microliter omgekeerde transcriptase toe aan het monster.

Meng vervolgens het monster voorzichtig en centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut. Daarna, incubeer het monster op 45 graden Celsius gedurende 50 minuten, en vervolgens op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg 7,5 microliter 2x Taq DNA polymerase en 0,1 micromol RAX toe aan een PCR micro centrifugebuis.

Voeg vervolgens 0,75 microliters toe elk van voorwaartse en omgekeerde primer om het CCS1-gen te versterken. Voeg hierna 600 nanogram CDNA-sjabloon toe. Voorvormen van de versterking reactie in real-time PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.

Analyseer vervolgens de gegevens met de PCR-software. Weeg een gram cellulair materiaal af en verpak het in aluminiumfolie. Na het macereren van het monster, breng het naar een glazen flacon en voeg 2,5 milliliter extractie buffer.

Vervolgens centrifuge het monster op 20,000G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng 500 microliters aliquots over in cryogene flesjes. Meet met een spectrofotometer de eiwitconcentratie van het monster op 562 nanometer met behulp van een bicinchoninic zuurtest, met runder seric albumine als standaard.

Bereid eerst het reactiemengsel in een microcentrifugebuis, volgens het tekstprotocol. Verhoog vervolgens het totale volume tot 200 microliter met 100 millimolar tris HCL. Vergeet niet, is het noodzakelijk voor uw eigen veiligheid om de juiste voorzorgsmaatregelen te volgen tijdens de voorbereiding van reactie mengsel met radioactief materiaal.

Houd de microcentrifuge buis op ijs en voeg een volume van de oplosbare fractie, met zeven tot negen milligram eiwit. Dan, vortex het mengsel en incubeer op 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Hierna worden de monsters vijf minuten lang op 11.000 G gecentrifuger.

Herstel vervolgens voorzichtig een volume van 900 microliters en breng de monsters over naar een scintillatieblad. Verdampen vervolgens de chloroform om de droogte in de kap bij kamertemperatuur te voltooien. Voeg vijf milliliter scintillatievloeistof toe aan de flacon.

Ten slotte, analyseren van de radioactiviteit opgenomen in de cafeïne met behulp van een scintillatie teller. In dit protocol werd het patroon van absorptie voor cafeïne geanalyseerd via TLC densitometrie, door het zichtbare lichtspectrum, en het meten in maximale absorptie op 273 nanometer. De scheidingscurve van cafeïne op de TLC-plaat, toonde een RF tussen 0,34 en 0,39.

Het RNA afgeleid van zwevende cellen vertoont duidelijke scheidingen van de 28s, 18s en 5s RRNA subeenheden, wat aangeeft dat de monsters van hoge kwaliteit waren. Ten slotte werd een smeltcurve verkregen uit de QPCR-analyse, met een enkel versterkingsproduct voor het cafeïnesynthease-gen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biotechnologie en biochemie om de secundaire metaboliserende weefselkweek van koffie, thee en coco te verkennen.

Vergeet niet dat het werken met radioactiviteit en moleculaire pathologie uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van handschoenen, veiligheidsbrillen en speciale apparatuur voor radioactief materiaal moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.