Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie
20 augustus 2018
Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biofysica, zoals hoe sterk een enkel eiwit is bij eiwitinteracties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om een breed scala aan verschillende biomoleculen te immobiliseren. Over het algemeen kunnen nieuwkomers bij deze methode worstelen omdat de omgang met de cantilever-sonde van de atoomkrachtmicroscoop en de bediening van de atoomkrachtmicroscoop zelf uitdagend kunnen zijn.
Trek eerst zuurbestendige handschoenen, veiligheidsbril en een laboratoriumjas aan. Gebruik onder een afzuigkap isopropanol in pluisvrije nauwkeurige doekjes. Verwijder grof stof en verontreinigingen van verschillende glasplaten.
Breng de schone platen over naar een staande pot gevuld met zoutzuur verdund met tweemaal gedestilleerd water. Sluit de pot af met een geschikt deksel en plaats deze gedurende 90 minuten in een ultrasoon bad op kamertemperatuur. Breng vervolgens de siliciumnitride AFM-cantilever-sondes over naar een schone glasplaat met de punt naar boven gericht.
Breng de plaat over naar een UV-lichtdichte kamer en bestraal de plaat van bovenaf gedurende minimaal 90 minuten met ultraviolet licht. Vervang hierna het zoutzuur in de kleurvat met tweemaal gedestilleerd water, zorg ervoor dat het glasoppervlak niet droogt. Sluit de pot af met het deksel en plaats het terug in het ultrasoon bad gedurende nog eens 10 minuten.
Los ondertussen Ethoxy-silaan polyethyleenglycolzuur op in een mengsel van ethanol en tweemaal gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Sluit deze oplossing hermetisch af om de verdamping van het ethanol te voorkomen. Giet de silaanoplossing wanneer u klaar bent in twee afzonderlijke petrischalen.
Plaats de schone glasplaten in de ene petrischaal en de cantilever in de andere. Sluit beide schalen hermetisch af met parafilm om te voorkomen dat het ethanol verdampt. Incubeer de stationaire schalen gedurende 90 minuten op kamertemperatuur.
Gebruik daarna drie opeenvolgende bekers met zuiver ethanol om zowel de cantilever als de glasplaten te wassen. Plaats de gewassen cantilever op een schone glasplaat. Breng de gefunctionaliseerde glasplaten over naar de kleurvat.
Harden beide in een oven bij 110 graden Celsius gedurende 30 minuten. Bewaar vervolgens de gesilaniseerde glasmonsters en de cantilever in een vacuümexsiccator gedurende maximaal een week. Wanneer u klaar bent om willekeurige immobilisatie van eiwitten te beginnen, bereidt u een oplossing voor die EDC en NHS bevat in standaard fosfaatgebufferd zoutwater zoals beschreven in het tekstprotocol.
Bedek de met silaan gecoate glasplaten met deze oplossing. Plaats de gesilaniseerde cantilever-sondes in een druppel van de ECD/NHS-oplossing. Incubeer beide gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Spoel vervolgens zowel de cantilever als de platen in drie opeenvolgende bekers om eventueel overtollig EDC/NHS volledig weg te spoelen. Breng de geactiveerde glasplaten over naar een petrischaal voorzien van een vochtig weefsel. Voeg een druppel van de gewenste eiwitoplossing toe aan het EDC/NHS-geactiveerde gebied van de glasplaten en sluit de petrischaal af met parafilm en incubeer de sondes op kamertemperatuur.
Voeg een druppel van de gewenste eiwitoplossing toe aan de cantilever-box voorzien van een vochtig weefsel. Was vervolgens de cantilever-sondes grondig met PBS. Plaats de sondes in de druppel in de box en sluit de box.
Incubeer de sondes op kamertemperatuur. Markeer hierna het gebied van de eiwitdruppel op de achterkant van de glasplaten. Was zowel de glasplaten als de cantilever-sondes grondig met drie opeenvolgende bekers gevuld met PBS.
Plaats de gewassen sondes gedurende 20 minuten op kamertemperatuur in een vat met Tris-gebufferd zoutwater. Was vervolgens de glasplaten en de cantilever-sondes grondig met PBS. Bewaar ze in afzonderlijke petrischalen bedekt met PBS totdat u klaar bent om ze te gebruiken.
Bevestig een vers gereinigde glasplaat op de AFM-monsterhouder en bedek deze met PBS-buffer. Bevestig vervolgens de voorbereide cantilever-sonde op de cantilever-houder en plaats deze in de AFM-kop. Bevochtig de cantilever voorzichtig met een druppel PBS-buffer.
Beweeg de cantilever langzaam richting het kalibratieoppervlak totdat de cantilever volledig ondergedompeld is in de PBS-buffer, maar nog steeds uit de buurt van het kalibratieoppervlak. Gebruik ofwel de bovenste optische microscoop ofwel de omgekeerde microscoop van de AFM om de laser aan de achterkant van de cantilever te positioneren. Plaats de laserspot nabij het uiteinde van de cantilever dicht bij de locatie waar de punt zich bevindt en pas de positie aan op de vierkwadrantdetector-fotodiode van de AFM zodat het gereflecteerde laserstraaltje in het midden van de fotodiode is gepositioneerd.
Open vervolgens de kalibratiemanager in de AFM-software. Om te beginnen met het kalibreren van de gevoeligheid van de cantilever en de veerconstante, nadert u voorzichtig het substraatoppervlak en neemt u een krachtafstandscurve op. Pas een rechte lijn toe op het steilste gedeelte van de terugtrekkingskrachtcurve waar de punt in contact is met het substraatoppervlak om de gevoeligheid van de optische hefboom te bepalen.
Trek de cantilever terug van het monstersoppervlak en neem meerdere thermische ruisspectra op met de cantilever op minstens 100 micron van het oppervlak en pas een harmonische oscillator, geleverd door de AFM-software, toe op de thermische ruisspectra om de veerconstante van de cantilever te bepalen. Trek hierna langzaam de cantilever terug en trek deze uit de oplossing. Verwijder het glasoppervlak dat voor de cantileverkalibratie is gebruikt en vervang het door het monstersoppervlak met de geïmmobiliseerde eiwitten.
Beweeg de vochtige cantilever langzaam richting het monstersoppervlak totdat de cantilever volledig is bedekt met PBS-buffer, maar nog steeds uit de buurt van het substraatoppervlak. Benader het oppervlak en neem meerdere krachtafstandscurven op op verschillende locaties op het monstersoppervlak met een contactkracht van 250 piconewton, een contacttijd van één seconde, een terugtrekkingslengte van twee micrometer
Overzicht
Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met behulp van een heterobifunctioneel silaan-koppelingsmiddel op siliciumoxide-oppervlakken voor single-molecule krachtspectroscopie op basis van atoomkrachtmicroscopie. De methode wordt geïllustreerd aan de hand van de interactie van RrgA, een pilus-1 tip-adhesine van S. pneumoniae, met fibronectine.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biofysica
- Proteïne-interacties
- atoomkrachtmicroscopie
Achtergrond
- Deze methode beantwoordt fundamentele vragen in de biofysica, in het bijzonder met betrekking tot eiwitinteracties.
- Het maakt de immobilisatie van diverse biomoleculen mogelijk.
- Het hanteren van de atoomkrachtmicroscoop kan voor nieuwkomers uitdagend zijn.
- Correcte veiligheidsmaatregelen en reinigingsprocedures zijn essentieel voor een succesvolle implementatie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het immobiliseren van eiwitten op oppervlakken.
- Het faciliteren van de studie naar interacties tussen enkelvoudige moleculen.
- Het verbeteren van het inzicht in het gedrag van eiwitten onder kracht.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van siliciumoxide-oppervlakken met behulp van zoutzuur en ultrasone reiniging.
- Functionalisering van oppervlakken met ethoxysilaan polyethyleenglycolzuur.
- Activering van oppervlakken met EDC/NHS voor eiwitimmobilisatie.
- Kalibratie van AFM-cantilevers en meting van kracht-afstandscurves.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle immobilisatie van proteïnen op gesilaniseerde oppervlakken.
- Nauwkeurige meting van proteïne-interacties met behulp van AFM.
- Demonstratie van de veelzijdigheid van de methode voor diverse biomoleculen.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van eiwitinteracties op single-molecule niveau.
- Het benadrukt het belang van oppervlaktepreparatie en functionalisatie in biofysische studies.
- Deze methode kan worden aangepast voor een breed scala aan toepassingen in de biofysica en moleculaire biologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Covalente eiwitimmobilisatie maakt een precieze biofysische karakterisering van target-ligandinteracties mogelijk, wat vroege targetvalidatie ondersteunt door de bindingssterkte en specificiteit te kwantificeren. Deze methode vermindert mechanische ambiguïteit in studies naar eiwit-eiwitinteracties, waardoor er een voorspellende zekerheid ontstaat voor de ontwikkeling van downstream assays en lead-identificatiecampagnes. De aanpasbaarheid van het protocol aan een site-specifieke oriëntatie verbetert de reproduceerbaarheid binnen discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet scheurkrachten (bijv. 52 pN voor RrgA-fibronectine) om de sterkte van therapeutische hypothesen en de relevantie van pathways te onderzoeken.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe kwantificering van interactiegebeurtenissen op enkelvoudig molecuulniveau onder gecontroleerde omstandigheden.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfoliotriage door het identificeren van targets met een hoge betrouwbaarheid op basis van meetbare biofysische drempelwaarden (bijv. tot 20% interactiefrequentie).
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, op kracht gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en hit-bevestiging in fenotypische screeningcascades.
- Operationele waarde: Produceert homogene oppervlaktefunctionalisatie (bijv. fibronectine-distributie), waardoor een reproduceerbare ligandpresentatie over screeningcampagnes heen wordt gegarandeerd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met diverse biomoleculen via EDC/NHS- of thiol-specifieke koppeling, wat hergebruik over meerdere doelwitklassen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door interacties te karakteriseren in ziekterelevante systemen (bijv. binding van pneumokokken-adhesine aan de gastheer-matrix).
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt bindingsmechanismen (bijv. ruptuurlengte >70 nm via het worm-like chain model) om lead-optimalisatie te informeren en het risico op uitval te verminderen.
- Afstemming van Biomarkers: Ondersteunt de identificatie van interactiesignaturen die vertaalbaar zijn naar validatiemodellen op cellulair of weefselniveau.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van de beoordeling van target-interactie tot lead-optimalisatie en biedt biofysische risicovermindering voorafgaand aan investeringen in cellulaire assays.
- Discovery Biology: Test target-ligand-hypothesen via directe krachtmeting, waardoor bindingsmechanismen en specificiteit worden verduidelijkt.
- Screening: Levert kwantitatieve resultaten van de breukkracht, waardoor de effecten van verbindingen of varianten op de interactiesterkte van het target vergeleken kunnen worden.
- Analytics: Genereert krachtspectra die zijn gefit aan polymeermodellen (bijv. extensible worm-like chain) voor objectieve interactieprofilering en batchconsistentie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt data op enkelvoudig molecuulniveau met multicellulaire contexten via compatibiliteit met downstream single-cell force spectroscopie.
- Hergebruik binnen de Organisatie: Vestigt een gestandaardiseerd protocol voor oppervlaktepreparatie dat toepasbaar is op meerdere targets, waardoor de inspanning voor herontwikkeling tussen projecten wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door middel van directe, kwantitatieve meting van interactiekrachten en -frequenties.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van de assay via gecontroleerde covalente immobilisatie en oppervlaktepassivering (bijv. PEG-spacers die aspecifieke binding minimaliseren).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biofysische drempelwaarden te bieden die correleren met de functionele relevantie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van gegevens over interactiestabiliteit en -specificiteit uit de vroege ontdekkingsfase.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in AFM-bediening, oppervlaktechemie en eiwitbehandeling om een juiste immobilisatie en datakwaliteit te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot AFM-systemen met krachtspectroscopie-mogelijkheden en gecontroleerde vloeistofomgevingen (bijv. PBS, Tris-buffers).
- Maakt standaardisatie van silanisatie-, activatie- en incubatiestappen tussen teams noodzakelijk om de consistentie van het oppervlak te behouden.
- Aanpassing aan verschillende eiwitisoformen of mutanten kan optimalisatie van de koppelingschemie vereisen (bijv. amine- versus thiol-oriëntatie).
- Praktische beperkingen omvatten potentiële oppervlakteheterogeniteit en de noodzaak voor zorgvuldige baseline-subtractie om specifieke van niet-specifieke ruptuurgebeurtenissen te onderscheiden.
