Name: Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer covalente immobilisatie van eiwitten voor enkelmolecuul-krachtspectroscopie met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode maakt nauwkeurige meting van eiwitinteracties op siliciumoxide-oppervlakken mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB en HG erkennen financiële steun door de Europese Onderzoeksraad "Cellufuel, geavanceerde Grant No. 294438". HCS erkent financiële steun van het ministerie voor onderwijs en onderzoek door de Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS erkent dat financiële steun van de Beierse staat ministerie van Wetenschappen en onderwijs door de focus van het onderzoek "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - galop". Wij danken Conny Hasselberg-Christoph en Martina Hörig voor technische ondersteuning

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy%3A+Optical+Tweezers%2C+Magnetic+Tweezers+and+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy: Optical Tweezers, Magnetic Tweezers and Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy%2C+a+Powerful+Tool+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy, a Powerful Tool in Microbiology.</a> Journal of Bacteriology. 184 (19), 5205-5213 (2002).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+as+a+Multifunctional+Molecular+Toolbox+in+Nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy as a Multifunctional Molecular Toolbox in Nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Single+Molecular+Recognition+Events+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Single Molecular Recognition Events Using Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticky+Microbes%3A+Forces+in+Microbial+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sticky Microbes: Forces in Microbial Cell Adhesion.</a> Trends in Microbiology. 23 (6), 376-382 (2015).</li>
<li>Yakovenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FimH+Forms+Catch+Bonds+That+Are+Enhanced+by+Mechanical+Force+Due+to+Allosteric+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FimH Forms Catch Bonds That Are Enhanced by Mechanical Force Due to Allosteric Regulation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (17), 11596-11605 (2008).</li>
<li>Casillas-Ituarte, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Polymorphisms+in+the+Fibronectin-Binding+Repeats+of+Fibronectin-Binding+Protein+A+Affect+Bond+Strength+and+Fibronectin+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Polymorphisms in the Fibronectin-Binding Repeats of Fibronectin-Binding Protein A Affect Bond Strength and Fibronectin Conformation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8797-8810 (2017).</li>
<li>Hilleringmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Streptococcus+Pneumoniae+TIGR4+Pili%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Streptococcus Pneumoniae TIGR4 Pili.</a> The EMBO Journal. 28 (24), 3921-3930 (2009).</li>
<li>Izore, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Host+Cell+Recognition+by+the+Pilus+Adhesin+from+Streptococcus+Pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Host Cell Recognition by the Pilus Adhesin from Streptococcus Pneumoniae.</a> Structure. 18 (1), 106-115 (2010).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), a010215(2013).</li>
<li>Henderson, B., Nair, S., Pallas, J., Williams, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+a+Multidomain+Host+Adhesin+Targeted+by+Bacterial+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: a Multidomain Host Adhesin Targeted by Bacterial Fibronectin-Binding Proteins.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (1), 147-200 (2011).</li>
<li>Becke, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+Two-Domain+Binding+Mode+of+Pilus-1+Tip+Protein+RrgA+of+Streptococcus+Pneumoniae+to+Fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy Reveals Two-Domain Binding Mode of Pilus-1 Tip Protein RrgA of Streptococcus Pneumoniae to Fibronectin.</a> ACS nano. 12 (1), 549-558 (2018).</li>
<li>Herman-Bausier, P., Pietrocola, G., Foster, T. J., Speziale, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Activates+the+Capture+of+Human+Plasminogen+by+Staphylococcal+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Activates the Capture of Human Plasminogen by Staphylococcal Fibronectin-Binding Proteins.</a> mBio. 8 (5), e01067(2017).</li>
<li>Vitry, P., Valotteau, C., Feuillie, C., Bernard, S., Alsteens, D., Geoghegan, J. A., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-Induced+Strengthening+of+the+Interaction+between+Staphylococcus+aureus+Clumping+Factor+B+and+Loricrin%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Force-Induced Strengthening of the Interaction between Staphylococcus aureus Clumping Factor B and Loricrin.</a> mBio. 8 (6), e01748(2017).</li>
<li>Milles, L. F., Schulten, K., Gaub, H. E., Bernardi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+Extreme+Mechanostability+in+a+Pathogen+Adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of Extreme Mechanostability in a Pathogen Adhesin.</a> Science. 359 (6383), 1527-1533 (2018).</li>
<li>Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Receptor-Ligand+Systems+of+the+Cellulosome+with+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Receptor-Ligand Systems of the Cellulosome with AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).</li>
<li>Stetter, F. W., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Single+Molecule+Adhesion+by+Atomic+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).</li>
<li>Schmidt, S. W., Christ, T., Glockner, C., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Coupling+Chemistry+Linking+Carboxyl-Containing+Organic+Molecules+to+Silicon+Oxide+Surfaces+under+Acidic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Simple Coupling Chemistry Linking Carboxyl-Containing Organic Molecules to Silicon Oxide Surfaces under Acidic Conditions.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 26 (19), 15333-15338 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-Based%2C+Site-Specific+and+Covalent+Immobilization+of+Biomolecules+for+Single-Molecule+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thiol-Based, Site-Specific and Covalent Immobilization of Biomolecules for Single-Molecule Experiments.</a> Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polyproteins+and+Receptor-Ligand+Complexes%3A+The+Current+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy on Polyproteins and Receptor-Ligand Complexes: The Current Toolbox.</a> Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Ott, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+Polypeptide+Linkers+for+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> ACS nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New%2C+Simple+Method+for+Linking+of+Antibodies+to+Atomic+Force+Microscopy+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New, Simple Method for Linking of Antibodies to Atomic Force Microscopy Tips.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (4), 1176-1184 (2007).</li>
<li>Kufer, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Immobilization+of+Recombinant+Fusion+Proteins+with+hAGT+for+Single+Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Covalent Immobilization of Recombinant Fusion Proteins with hAGT for Single Molecule Force Spectroscopy.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 35 (1), 72-78 (2005).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schilcher, K., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Individual+Antibody-Antigen+Recognition+Events+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Individual Antibody-Antigen Recognition Events by Atomic Force Microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (8), 3477-3481 (1996).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Schilcher, K., Gruber, H. J., Schindler, H. Conjugation of Biomolecules to Tip and Probe Surfaces for Molecular Recognition in Atomic Force Microscopy. European Journal of Cell Biology. 74, 72(1997).</li>
<li>Riener, C. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267003011061">Heterobifunctional Crosslinkers for Tethering Single Ligand Molecules to Scanning Probes.</a> Analytica Chimica Acta. 497 (1-2), 101-114 (2003).</li>
<li>Metwalli, E., Haines, D., Becker, O., Conzone, S., Pantano, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Mono-%2C+Di-%2C+and+Tri-Aminosilane+Treated+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Mono-, Di-, and Tri-Aminosilane Treated Glass Substrates.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 298 (2), 825-831 (2006).</li>
<li>Beyer, D., Knoll, W., Ringsdorf, H., Elender, G., Sackmann, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040609095084568">Covalently Attached Polymer Mono- and Multilayers on Silanized Glass Substrates.</a> Thin Solid Films. 284, 825-828 (1996).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 13 - Silane Coupling Agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 535-548 (2013).</li>
<li>Howarter, J. A., Youngblood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Silica+Silanization+by+3-aminopropyltriethoxysilane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Optimization of Silica Silanization by 3-aminopropyltriethoxysilane.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (26), 11142-11147 (2006).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 6 - Heterobifunctional Crosslinkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 299-339 (2013).</li>
<li>Sehgal, D., Vijay, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+High+Efficiency+of+Water-Soluble+Carbodiimide-Mediated+Amidation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for the High Efficiency of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Amidation.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 87-91 (1994).</li>
<li>Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Thiol-Gold+Interactions+Towards+the+Efficient+Strength+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying Thiol-Gold Interactions Towards the Efficient Strength Control.</a> Nature Communications. 5, 4348(2014).</li>
<li>Butt, H. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0957-4484/6/1/001/meta">Calculation of Thermal Noise in Atomic Force Microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1367-2630/1/1/006/meta">Single Molecule Force Spectroscopy by AFM Indicates Helical Structure of Poly(ethylene-glycol) in Water.</a> New Journal of Physics. 1 (1), 6(1999).</li>
<li>Gugutkov, D., Gonzalez-Garcia, C., Rodriguez Hernandez, J. C., Altankov, G., Salmeron-Sanchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Activity+of+the+Substrate-Induced+Fibronectin+Network%3A+Insight+Into+the+Third+Dimension+Through+Electrospun+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Biological Activity of the Substrate-Induced Fibronectin Network: Insight Into the Third Dimension Through Electrospun Fibers.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (18), 10893-10900 (2009).</li>
<li>Rief, M., Oesterhelt, F., Heymann, B., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polysaccharides+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy on Polysaccharides by Atomic Force Microscopy.</a> Science. 275 (5304), 1295-1297 (1997).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Marszalek, P. E., Oberhauser, A. F., Pang, Y. P., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+Elasticity+Governed+by+Chair-Boat+Transitions+of+the+Glucopyranose+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide Elasticity Governed by Chair-Boat Transitions of the Glucopyranose Ring.</a> Nature. 396 (6712), 661-664 (1998).</li>
<li>Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Stability+of+Single+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical Stability of Single DNA Molecules.</a> Biophysical Journal. 78 (4), 1997-2007 (2000).</li>
<li>Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force-Clamp+Experiments+Reveal+Kinetics+of+Mechanically+Activated+Silyl+Ester+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force-Clamp Experiments Reveal Kinetics of Mechanically Activated Silyl Ester Hydrolysis.</a> ACS nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).</li>
<li>Schmidt, S. W., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Strength+of+the+Silicon-Carbon+Bond+Observed+Over+Three+Decades+of+Force-Loading+Rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dynamic Strength of the Silicon-Carbon Bond Observed Over Three Decades of Force-Loading Rates.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (11), 3664-3668 (2008).</li>
<li>Schmidt, S. W., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Activated+Rupture+of+Single+Covalent+Bonds%3A+Evidence+of+Force+Induced+Bond+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanically Activated Rupture of Single Covalent Bonds: Evidence of Force Induced Bond Hydrolysis.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (13), 5994-5999 (2011).</li>
<li>Schmidt, S. W., Pill, M. F., Kersch, A., Clausen-Schaumann, H., Beyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Induced+Silyl+Ester+Cleavage+Under+Acidic+Conditions+Investigated+by+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy+in+the+Force-Ramp+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Mechanically Induced Silyl Ester Cleavage Under Acidic Conditions Investigated by AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy in the Force-Ramp Mode.</a> Faraday Discussions. 170, 357-367 (2014).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+Forces+of+Titin+and+Fibronectin+Domains+Directly+Measured+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unfolding Forces of Titin and Fibronectin Domains Directly Measured by AFM.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 481, 129-136 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sinds de invoering van de AFM op basis van de SBF, het uitgegroeid tot een veel gebruikte techniek om direct sonde intra en intermoleculaire krachten van de individuele eiwitten, nucleïnezuren en andere biomoleculen3,4,5. Voor succesvolle experimenten van de SBF is een passende oppervlak koppeling strategie een voorwaarde. Om de sonde de intramoleculaire krachten in natuurlijke en synthetische polymeren, kunnen de polymeren rechtstreeks worden gekoppeld aan het substraat oppervlak en de AFM tip36,38,39,40,41. Voor het onderzoek van Inter moleculaire interacties, zoals de moleculaire obligaties, het is echter raadzaam om het gebruik van flexibele linker moleculen zoals hetero-bifunctionele PEG linkers of polypeptide kettingen, hechten de interactie-partners aan het uiteinde van de AFM en de substraat oppervlak, zodat de correcte oriëntatie van de bindende-partners, te korte afstand oppervlaktekrachten overwinnen en denaturatie en ontplooiing van eiwitten21,22,23, te vermijden 24,25,26,27,42. We beschreven daarom een eenvoudig en ongecompliceerd protocol voor de covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met hetero-bifunctionele PEG afstandhouders.
We toonden de toepasbaarheid ervan met het onderzoek naar de interactie tussen adhesine RrgA van S. pneumoniae en de extracellulaire matrix eiwitten Fn, zoals onlangs in detail beschreven elders13.
De oppervlakte chemie is een gevestigde en geanalyseerd en soortgelijke benaderingen zijn met succes gebruikt in meerdere SBF experimenten19,42,43,44,45. De silylether gebruikt voor het koppelen van het polymeer silane aan het oppervlak, is onderworpen aan de hydrolyse. De graad van hydrolyse is afhankelijk van de hoeveelheid gevormde siloxaan obligaties, die tijdens het silanization-proces kan worden gecontroleerd. Als hoge interactie krachten (≥ 1000 pN) verwachting tijdens de SBF metingen, moet de silanization worden uitgevoerd via damp-fase afzetting30 die in de vorming van een continue laag van siloxanen resulteert. Wat veel experimenten (bijv., veel eiwit-eiwitinteractie) zijn de krachten van de interactie in het bereik van een paar honderd pN, en de beschreven procedure, welke siloxaan vorming is uitgevoerd door afzetting van een waterige fase en unbound organo-silanes zijn zorgvuldig afgewassen met ethanol (stap 1.1.7) gevolgd door het genezen met warmte (stap 1.1.8), is voldoende.
Een andere belangrijke stap is om te wassen van de resterende EDC en NHS moleculen uit het oppervlak (stap 1.2.3), zoals restjes naar de activering van carboxylgroepen op de eiwitten leiden zal. Dit kan ofwel resultaat in crosslinking van eiwitten op hetzelfde oppervlak, waardoor hun functionaliteit kan worden gewijzigd of covalent paar eiwitten aan andere eiwitten op het tegenovergestelde oppervlak geactiveerd. Dit kan leiden tot het klemmen van de eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip, wat in hoge breuk krachten resulteert, eventueel vergezeld van domein ontvouwen (Zie Figuur 3b, spoor 1, 4 en 5, ontplooiing van Fn domeinen)46. Hetzelfde probleem kan optreden, als de actieve NHS-esters van de pin spacer onverzadigde zitten. Daarom wordt de incubatie met Tris gebufferde zoutoplossing aanbevolen (stap 1.2.6), omdat de primaire amine van Tris de resterende amino reactieve groepen lest.
Volgens het protocol stapsgewijze leidt tot een homogene verdeling van Fn op het gesilaneerde glas oppervlak (Zie Figuur 2), waardoor een dimeric vorm van het eiwit. Dit lijkt op Fn´s structuur in de oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens over andere monster oppervlakken37. Daarnaast wordt een geschikte concentratie van RrgA op het puntje van de AFM verkregen, die genereert een streefwaarde van ~ 20% van welomschreven interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen (Figuur 3 en Figuur 4). Een andere elegante manier om te bepalen welke van moleculen die zijn gekoppeld aan de steekproef substraat en cantilever tip naast variërend van de eiwit-concentratie en/of incubatie tijden, is de combinatie van silane-agenten met verschillende secundaire functionele groepen. Door het veranderen van de verhouding van eiwit reactieve groepen zich uitstrekt van de PEG-polymeer, kunnen het aantal geïmmobiliseerdet eiwitten gecontroleerde15,16,17,18.
Het protocol hier beschreven kan ook worden gebruikt om te immobiliseren andere -NH2 met moleculen of worden aangepast aan paar eiwitten aan andere siliciumoxide oppervlakte naast glas en silicium nitride. Afhankelijk van het ontwerp van de eiwitten, de reactieve carboxylgroep van amine kan worden gewijzigd in een sulfaatzuurstof reactieve groep (bijvoorbeeld, maleimide of ortho-pyridyl-disulfide) te koppelen de eiwitten via zijn vrij-SH-groepen. Voor Fn resulteert dit in een vooraf gedefinieerde oriëntatie13,17,20.
Kortom, dit protocol dienen verschillende eisen kan worden aangepast en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast enkel molecuul kracht spectroscopie experimenten.

Naast optische en magnetische pincet, de atomaire kracht Microscoop (AFM)1,2 heeft ontpopt als een nuttig instrument om te analyseren en manipuleren van moleculen en peilen naar hun eigenschappen en functies, met inbegrip van hun reactie op externe kracht3 ,4. In tegenstelling tot methoden zoals het enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA), oppervlakte plasmon resonantie (SPR) of quartz crystal microbalans (QCM) opstellingen, AFM staat voor het meten van interacties op de enkel molecuul (SBF)5 en eencellige niveau (SCF)6 . Deze technologieën leverde waardevolle inzicht in bindende mechanismen als de obligaties van de vangst gevonden voor de interactie van E. coli pilus eiwit die FimH met mannose7, of de tandem β-rits herhaalt gevormd door Fn bindende proteïnen uit S. aureus bij binding met Fn8. Konden we onlangs te tonen dat de pilus-1 adhesine RrgA9,,10 van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 vermag binden aan fibronectine12 met haar twee terminal domeinen. Dit bleek een nieuwe twee-domein bindend mechanisme dat verschilt van de tandem β-rits en piliated pneumokokken te vormen en onderhouden van een voorbijgaande contact naar fibronectine-bevattende host oppervlakken13kan inschakelen.
Het succes van de SBF experimenten is kritisch afhankelijk van de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen op vaste oppervlakken en AFM tips. Als er hoge krachten kunnen optreden tijdens de SBF metingen, moeten de eiwitten bij voorkeur worden covalent gekoppeld aan het oppervlak. Er zijn een groot aantal verschillende koppeling methoden voor de immobilisatie van eiwitten en andere biomoleculen, evenals de hele cellen op (anorganisch) vaste oppervlakken, nano-deeltjes en andere apparaten die zijn beschreven in de literatuur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Deze protocollen maken vaak gebruik van gevaarlijke stoffen, zijn moeilijk te voeren en/of het vereisen van speciale uitrusting (b.v., plasma reiniger). Een eenvoudige manier om paar moleculen tot glas is een dikkere laag van het polymeer van heterobifunctional crosslinkers met een silane-reactieve groep aan de ene kant en een amine-reactieve groep aan de andere kant hechten. Afhankelijk van de toepassing, de koppeling agenten kunnen bestaan uit flexibele hydro-koolstof ketens met een variabele lengte, bijv., polyethylenglycol (PEG). Ze onderdrukken van niet-specifieke interacties van de gemodificeerde oppervlakken (bijvoorbeeldhydrofobe, elektrostatische en interacties van-der-Waals) en de gekoppelde molecuul roterende vrijheid kunnen bieden.
Hier beschrijven we een algemeen protocol voor de covalente koppeling van eiwitten met een of meer vrije amino groepen (-NH2) naar het glazen oppervlakken en siliciumnitride AFM tips via een heterobifunctional ethoxy silane-PEG-carboxyl (-COOH). Dit protocol kan worden gebruikt in de SBF experimenten, die wordt geïllustreerd op basis van de interactie tussen RrgA en de extracellulaire matrix eiwitten Fn (Zie Figuur 1 voor een overzicht).
De eerste stap is de silanization van de oppervlakte28,29,30,31. Het gaat om de hydrolyse van de ethoxy groepen de koppelmiddel om zeer reactieve SiOH groepen vormen. Deze kunnen reageren met SiOH groepen op de drager vervagen. In een primaire condensatie stap, deze silanols formulier waterstofbruggen en verspreid over het substraat. In een secundaire condensatiereactie (die meestal vereist warmte of vacuüm om water te verwijderen), siloxaan obligaties worden gevormd. Dit resulteert in een laag covalent bijgevoegde organo-silane.
De tweede stap is de koppeling van de eiwitten aan de functionele (-COOH) groepen die uit te van de polymeer-32 breiden. Ten eerste, het zuur wordt geconverteerd naar een reactieve N-hydroxysuccinimid (NHS) ester gevorderde, die is opgedaan door de gevestigde NHS/EDC (1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid chemie33 en ondergaat nucleofiele substitutie tot slot een amide om binding te vormen met primaire amines op de eiwitten.
Op deze manier RrgA was gekoppeld aan siliciumnitride AFM tips en menselijke Fn glazen substraten in een willekeurige oriëntatie en hun interactie krachten werden geanalyseerd op het niveau van één molecuul. Onze resultaten tonen aan dat de beschreven Oppervlaktechemie tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen leidt. Deze chemie vermindert aspecifieke achtergrond interacties, is weinig vrijblijvend tijdens data-acquisitie en is daarom uitermate geschikt voor nauwkeurige SBF experimenten.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; analytische zuiverheid</td></tr><tr><td>Tweevoudig gedestilleerd water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99,8 %; analytische zuiverheid</td></tr><tr><td>Ethoxy silane polyethyleenglycolzuur</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimide</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; voor synthese</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Sondevoeler bijv. Fibronectine, menselijk plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Sondevoeler bijv. RrgA</td><td></td><td></td><td>Geproduceerd in laboratorium</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; bufferkwaliteit</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bekers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen snijder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen schuifjes</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Inerte gas-droger</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverteer microscoop - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard SPM en DP-software</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumoven</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magneetroerder</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microschuiver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Brand</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 &micro;l, 50-200 &micro;l, 100-1000&nbsp;&micro;l</td></tr><tr><td>Precisiebalans</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliciumnitride cantilever - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>Veerconstante &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Ultrasoonbad</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleurvat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reerstaaf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech science precision wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweez</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Kwikspectrum met de primaire energie op 254&nbsp;nm</td></tr><tr><td>Vakuumdroger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpomp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weegpapier</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul force spectroscopie

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In de afgelopen jaren gebaseerd atomaire kracht microscopie (AFM) enkel molecuul kracht spectroscopie (SBF) uitgebreid van ons begrip van de moleculaire eigenschappen en functies. Het gaf ons de mogelijkheid om te ontdekken een veelheid van biofysische mechanismen, bijvoorbeeldhoe bacteriële adhesines bind aan de oppervlakte receptoren host in meer detail. Onder andere factoren hangt het succes van de SBF experimenten in de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen van rente op vaste oppervlakken en AFM tips. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de covalente koppeling van eiwitten aan silicium oppervlakken met behulp van silane-PEG-carboxyls en de gevestigde N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemie in volgorde om te ontdekken de interactie van pilus-1 adhesine RrgA van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) met de extracellulaire matrix eiwit fibronectine (Fn). Onze resultaten tonen aan dat de oppervlakte functionalization tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de AFM cantilever tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF leidt metingen en geopenbaard dat RrgA aan Fn met een gemiddelde kracht van 52 pN bindt. Het protocol kan worden aangepast aan paar via specifieke gratis thiol sitegroepen. Dit resulteert in een vooraf gedefinieerde eiwit of molecuul oriëntatie en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast de SBF.

Het protocol beschreven hier resultaten in een covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met willekeurige oriëntatie (Figuur 1). Figuur 2 toont een beeld van de AFM van een gesilaneerde glazen oppervlak met (links) en zonder (rechts) Fn geïmmobiliseerd, afgelezen na de uitdroging van de monsters onder een zachte stroom van stikstof. De silane polymeer laag toont alleen kleine oppervlakte golvingen met een hoogte van ongeveer 2-5 nm (Figuur 2, rechts), terwijl op het oppervlak matiemaatschappij met Fn, ongeveer 10 nm hoog Fn moleculen zijn herkenbaar (Figuur 2, links). In close-ups, kan de dimeric structuur van de Fn worden herkend. De Fn-moleculen lijken te zijn met een hoogte van 4-5 nm boven de oppervlaktelaag van PEG en een lengte van compacte ~ 120 nm (Zie inserts).
Om te onderzoeken van de krachten van de interactie van RrgA met Fn, die onlangs door onze fractie13in detail werd beschreven, was de RrgA gekoppeld aan een siliciumnitride AFM uiteinde en menselijke Fn op het glas-substraat (Figuur 3a). Figuur 3 toont representatieve tip monster scheiding curven van de interactie van RrgA met Fn opgenomen met een trekken snelheid van 1 µm s-1. De gebruikte oppervlakte chemie leidde tot een lage achtergrond interactie en goed gevormde enkel (of dubbel) interactie gebeurtenissen (Figuur 3a), werden uitgerust met behulp van een extensible worm als ketting (eWLC) model (rode lijnen). Uitzetten van de resultaten van de pasvorm (breuk kracht en -lengte, Zie Figuur 4) laat zien dat na het overwinnen van aspecifieke oppervlakte interacties tussen AFM tip substraat en de linkers PEG (> 70 nm), die zich uitstrekt tot ~ 19% van de kracht-curven toonde breuk evenementen met een gemiddelde breuk kracht voor de RrgA - Fn interactie van ~ 52 pN op een tip-monster afstanden van ongeveer 100 nm. In contrast, een niet toepasbaar Oppervlaktechemie (hier weggelaten blussen met Tris gebufferde zoutoplossing Figuur 3b) zal een belemmering vormen voor een duidelijke evaluatie van één interactie evenementen als gevolg van aspecifieke interacties, meerdere eiwit bindende (sporen 2 en 3) en/of covalente koppeling van eiwitten tussen het oppervlak van het monster en de AFM cantilever tip. Dit leidt tot hoge breuk krachten (spoor 1), eventueel vergezeld van de ontplooiing van het eiwit (Fn) domeinen (sporen 4 en 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figuur 1: overzicht over de Oppervlaktechemie. De hydrolyse van ethoxy silane-PEG-carboxyl wordt gevolgd door de condensatie op de gehydrateerd glasoppervlak en de vorming van crosslinks siloxaan. De reactie van EDC met de carboxylgroepen resulteert in een reactieve o- acylisourea, een amine-reactief intermediair met een extreem korte halfwaardetijd in waterige oplossing (hydrolyse). De intermediaire wordt gestabiliseerd door de vorming van een ester van de NHS die ondergaat nucleofiele substitutie om te vormen tot slot een amide-binding met primaire amines op de eiwitten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figuur 2: Immobilisatie van fibronectine op een glazen substraat via heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel. AFM beelden van matiemaatschappij glazen oppervlakken met (links) en zonder (rechts) voetnoot aantallen wijzen op individuele Fn moleculen, die zijn homogeen verdeeld over het substraat oppervlak (insert). De moleculen vast een dimeric en compacte structuur met een hoogte van 4-5 nm boven de PEG coating en een lengte van > 100 nm. Dit lijkt op de structuur van Fn in oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens op andere oppervlakken, bijvoorbeeld mica (schaal staaf-van-inlays = 500 nm)37. Hieronder de AFM zijn beelden hoogte profielen langs de lijnen die zijn aangegeven in de beelden van de AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figuur 3: illustratie van een SBF experiment en vertegenwoordiger dwingen afstand curven van de RrgA - Fn interactie. (a) RrgA en Fn waren covalent gekoppeld via de heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel aan een siliciumnitride AFM cantilever uiteinde en een glazen oppervlak, respectievelijk. Vertegenwoordiger SMFS dwingen afstand curven voor RrgA - Fn interactie met een retractie snelheid van 1 µm s-1 met de beschreven immobilisatie van RrgA en Fn verkregen worden weergegeven. Rode curven vertegenwoordigen de uitbreidbare worm-achtige ketting past toegepast om ruptuur krachten en lengtes te verkrijgen. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano 201813. (b) de vertegenwoordiger van de SMFS dwingen afstand curven verkregen voor de RrgA - Fn interactie zonder blussen met Tris gebufferde zoutoplossing. In dit geval de primaire amine van Tris afwezig was zodat de resterende actieve NHS esters bleven onverzadigde, tijdens het experiment. Dit leidde tot multi eiwit bindende (sporen 2 en 3) en de klemmen van eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip wat in hoge breuk resulteerde troepen begeleid door (Fn-) domein ontvouwen (spoor 1, 4 en 5; Let op de verschillende schalen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figuur 4: kracht en lengte verdeling van één RrgA - Fn interacties. Scheuren van de kracht en bijbehorende breuk lengte histogrammen verkregen RrgA - Fn SBF interactie metingen (n = 1400) met een snelheid van de intrekking van 1 µm s-1. De histogrammen onthullen een meest waarschijnlijke breuk kracht fMP van 51.6 pN (Gauss past, zwarte lijn) en een opeenstapeling van breuk lengtes ongeveer 100 nm. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biofysica, zoals hoe sterk een enkel eiwit is bij eiwitinteracties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om een breed scala aan verschillende biomoleculen te immobiliseren. Over het algemeen kunnen nieuwkomers bij deze methode worstelen omdat de omgang met de cantilever-sonde van de atoomkrachtmicroscoop en de bediening van de atoomkrachtmicroscoop zelf uitdagend kunnen zijn.Trek eerst zuurbestendige handschoenen, veiligheidsbril en een laboratoriumjas aan. Gebruik onder een afzuigkap isopropanol in pluisvrije nauwkeurige doekjes. Verwijder grof stof en verontreinigingen van verschillende glasplaten.Breng de schone platen over naar een staande pot gevuld met zoutzuur verdund met tweemaal gedestilleerd water. Sluit de pot af met een geschikt deksel en plaats deze gedurende 90 minuten in een ultrasoon bad op kamertemperatuur. Breng vervolgens de siliciumnitride AFM-cantilever-sondes over naar een schone glasplaat met de punt naar boven gericht.Breng de plaat over naar een UV-lichtdichte kamer en bestraal de plaat van bovenaf gedurende minimaal 90 minuten met ultraviolet licht. Vervang hierna het zoutzuur in de kleurvat met tweemaal gedestilleerd water, zorg ervoor dat het glasoppervlak niet droogt. Sluit de pot af met het deksel en plaats het terug in het ultrasoon bad gedurende nog eens 10 minuten.Los ondertussen Ethoxy-silaan polyethyleenglycolzuur op in een mengsel van ethanol en tweemaal gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Sluit deze oplossing hermetisch af om de verdamping van het ethanol te voorkomen. Giet de silaanoplossing wanneer u klaar bent in twee afzonderlijke petrischalen.Plaats de schone glasplaten in de ene petrischaal en de cantilever in de andere. Sluit beide schalen hermetisch af met parafilm om te voorkomen dat het ethanol verdampt. Incubeer de stationaire schalen gedurende 90 minuten op kamertemperatuur.Gebruik daarna drie opeenvolgende bekers met zuiver ethanol om zowel de cantilever als de glasplaten te wassen. Plaats de gewassen cantilever op een schone glasplaat. Breng de gefunctionaliseerde glasplaten over naar de kleurvat.Harden beide in een oven bij 110 graden Celsius gedurende 30 minuten. Bewaar vervolgens de gesilaniseerde glasmonsters en de cantilever in een vacuümexsiccator gedurende maximaal een week. Wanneer u klaar bent om willekeurige immobilisatie van eiwitten te beginnen, bereidt u een oplossing voor die EDC en NHS bevat in standaard fosfaatgebufferd zoutwater zoals beschreven in het tekstprotocol.Bedek de met silaan gecoate glasplaten met deze oplossing. Plaats de gesilaniseerde cantilever-sondes in een druppel van de ECD/NHS-oplossing. Incubeer beide gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Spoel vervolgens zowel de cantilever als de platen in drie opeenvolgende bekers om eventueel overtollig EDC/NHS volledig weg te spoelen. Breng de geactiveerde glasplaten over naar een petrischaal voorzien van een vochtig weefsel. Voeg een druppel van de gewenste eiwitoplossing toe aan het EDC/NHS-geactiveerde gebied van de glasplaten en sluit de petrischaal af met parafilm en incubeer de sondes op kamertemperatuur.Voeg een druppel van de gewenste eiwitoplossing toe aan de cantilever-box voorzien van een vochtig weefsel. Was vervolgens de cantilever-sondes grondig met PBS. Plaats de sondes in de druppel in de box en sluit de box.Incubeer de sondes op kamertemperatuur. Markeer hierna het gebied van de eiwitdruppel op de achterkant van de glasplaten. Was zowel de glasplaten als de cantilever-sondes grondig met drie opeenvolgende bekers gevuld met PBS.Plaats de gewassen sondes gedurende 20 minuten op kamertemperatuur in een vat met Tris-gebufferd zoutwater. Was vervolgens de glasplaten en de cantilever-sondes grondig met PBS. Bewaar ze in afzonderlijke petrischalen bedekt met PBS totdat u klaar bent om ze te gebruiken.Bevestig een vers gereinigde glasplaat op de AFM-monsterhouder en bedek deze met PBS-buffer. Bevestig vervolgens de voorbereide cantilever-sonde op de cantilever-houder en plaats deze in de AFM-kop. Bevochtig de cantilever voorzichtig met een druppel PBS-buffer.Beweeg de cantilever langzaam richting het kalibratieoppervlak totdat de cantilever volledig ondergedompeld is in de PBS-buffer, maar nog steeds uit de buurt van het kalibratieoppervlak. Gebruik ofwel de bovenste optische microscoop ofwel de omgekeerde microscoop van de AFM om de laser aan de achterkant van de cantilever te positioneren. Plaats de laserspot nabij het uiteinde van de cantilever dicht bij de locatie waar de punt zich bevindt en pas de positie aan op de vierkwadrantdetector-fotodiode van de AFM zodat het gereflecteerde laserstraaltje in het midden van de fotodiode is gepositioneerd.Open vervolgens de kalibratiemanager in de AFM-software. Om te beginnen met het kalibreren van de gevoeligheid van de cantilever en de veerconstante, nadert u voorzichtig het substraatoppervlak en neemt u een krachtafstandscurve op. Pas een rechte lijn toe op het steilste gedeelte van de terugtrekkingskrachtcurve waar de punt in contact is met het substraatoppervlak om de gevoeligheid van de optische hefboom te bepalen.Trek de cantilever terug van het monstersoppervlak en neem meerdere thermische ruisspectra op met de cantilever op minstens 100 micron van het oppervlak en pas een harmonische oscillator, geleverd door de AFM-software, toe op de thermische ruisspectra om de veerconstante van de cantilever te bepalen. Trek hierna langzaam de cantilever terug en trek deze uit de oplossing. Verwijder het glasoppervlak dat voor de cantileverkalibratie is gebruikt en vervang het door het monstersoppervlak met de geïmmobiliseerde eiwitten.Beweeg de vochtige cantilever langzaam richting het monstersoppervlak totdat de cantilever volledig is bedekt met PBS-buffer, maar nog steeds uit de buurt van het substraatoppervlak. Benader het oppervlak en neem meerdere krachtafstandscurven op op verschillende locaties op het monstersoppervlak met een contactkracht van 250 piconewton, een contacttijd van één seconde, een terugtrekkingslengte van twee micrometer

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

This video describes a method to visualize the assembly of fusion protein condensates on DNA molecules at specific loci using single-molecule imaging. These condensates are formed due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, which allow for the recruitment of RNA polymerase II and enhanced gene transcription.

Single-Molecule Imaging to Visualize Fusion Protein Condensates Assembly on DNA Curtains

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Leer covalente immobilisatie van eiwitten voor enkelmolecuul-krachtspectroscopie met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode maakt nauwkeurige meting van eiwitinteracties op siliciumoxide-oppervlakken mogelijk.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Meer video's verkennen