Name: Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe je triterpenen produceert in Nicotiana benthamiana via voorbijgaande expressie met Agrobacterium-infiltratie. Dit protocol biedt een snelle, schaalbare methode voor preparatieve productie van waardevolle natuurlijke verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een Norwich Research Park studententijd (JR), verlenen de gezamenlijke Engineering en Physical Sciences Research Raad/Biotechnological en biologische wetenschappen onderzoek Raad BBSRC-gefinancierde OpenPlant synthetische biologie onderzoekscentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., O.A.); een John Innes Centre kennisuitwisseling en commercialisering verlenen (BB/KEC1740/1) (BB); en de BBSRC Instituut strategisch programma subsidie 'Moleculen uit de natuur' (BB/P012523/1) en de John Innes Foundation (O.A.). We zouden graag bedanken George Lomonossoff voor het verstrekken van de pEAQ-vectoren en Andrew Davis voor fotografie.

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoog-via-gezette vacuüm infiltratie kan dit protocol worden routinematig gebruikt in ons laboratorium preparatieve voordeproductie van triterpene verbindingen van belang voor diverse downstream toepassingen. De hier beschreven vacuüm infiltratie-apparaat is gemakkelijk gerepliceerd. Toevoeging van het vacuüm reservoir is aan te raden om het verlagen van de benodigde tijd voor het trekken van het vereiste vacuüm, maar het is mogelijk om gewoon hergebruiken ongewijzigde vacuüm oven als de kamer van de infiltratie. Het beschermen van de vacuümpomp via de toevoeging van een geschikte condensor is theoretisch verstandig, maar in ons laboratorium hebben we gevonden dit overbodig.
Infiltratie dekking is aangetast als de bladeren zijn niet volledig ondergedompeld in de schorsing van de infiltratie. Dit probleem wordt geminimaliseerd door ervoor te zorgen dat het niveau van de suspensie bereikt de oppervlaktelaag van de houder van de plant, en dat de houder van de plant is een strakke pasvorm voor de infiltratie-bad. Opmerking van Figuur 2 dat de oppervlaktelaag van de houder van de plant is verzonken aan het bad van de infiltratie bij plaats. Dit wordt bereikt door de panelen op de middelste randen van de houder die vormen van het ankerpunt met de bovenkant van de infiltratie-bad. De infiltratie schorsing vergt periodieke aanvullingen op het peil van de schorsing. Dit is best bereikt door toevoeging van overtollige infiltratie opschorting om te voorkomen dat de geleidelijke vermindering van de OD600 in de loop van een grote batch-wise infiltratie. Echter in onze handen, doet vervanging voor water niet toelijken voor zijn een merkbaar effect op verwachte rendementen op preparatieve schaal, hoewel dit niet is geweest quantitively onderzocht. Hoeveel planten kunnen worden geïnfiltreerd van één partij van infiltratie schorsing is nog steeds een open vraag. We infiltreren routinematig tussen 100 en 200 planten met één enkele batch van infiltratie schorsing. Bovendien is het normaal dat sommige bodemmonster/uitspoelen naar de schorsing infiltratie in de loop van het proces van de infiltratie. Dit is niet een merkbaar effect op infiltratie werkzaamheid gevonden.
Tijdens de oogst is het aan te raden (maar niet kritisch) om te oogsten alleen de bladeren die waren geïnfiltreerd (enkele blaadjes zal zijn gegroeid na infiltratie). Selectieve oogst voorkomt verdunning met onproductieve weefsel, die anders de verhouding van endogene onzuiverheden ten opzichte van de compound van belang zou verhogen. Dit heeft een nominale invloed op het gemak van downstream zuivering, en verhoogt de omvang van deze processen. Bij het gebruik van tHMGR ter bevordering van de levering van de voorloper, wordt een necrosed fenotype vaak waargenomen te ontwikkelen in de groeiperiode na de infiltratie. Dit is normaal en het daadwerkelijk helpt selectieve oogst en het stroomafwaarts droogproces. Het gedroogde blad poeder kan meestal worden opgeslagen in een verzegelde container in een koele, droge, donkere plaats, maar idealiter in een exsiccator onder vacuüm. Dit hangt af van de stabiliteit van de stof van belanghebbende partijen. Wees voorzichtig als kiezen om op te slaan in een vriezer-80 ° C. Opdat de gedroogde bladeren zijn in een waterdichte container, en op de uitslag, toestaan deze container opwarmen tot kamertemperatuur voorafgaand aan de opening. Niet te doen zal resulteren in het rewetting van de bladeren, down-stream processing belemmeren.
De stappen na de oogst in dit protocol worden verschaft voor illustratieve doeleinden en steun die onderzoekers die praktische chemie beperkte mogelijk ervaring. Zij kunnen worden vervangen voor vele andere natuurproduct extractie/zuivering technieken. Zoals uiteengezet in de inleiding, PSE heeft vele voordelen, maar de hoofdstad kosten van verkrijgbare PSE-apparaat kan worden onbetaalbaar en het is niet noodzakelijk. Fundamentele ionenwisseling-hars behandeling is een zeer handige methode ter vervanging van de traditionele verzeping gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren. Het is echter niet geschikt voor producten met carbonzuur of functionele groepen die zou worden gehydrolyseerd onder randvoorwaarden, zoals esters. Deze producten zou worden verwacht op de fundamentele ionenwisseling hars worden bewaard. Er is echter potentieel te exploiteren dit voor een vangst en de vrijgave procedure (niet gedocumenteerd hier). Waar traditionele verzeping wenselijk, fungeert fundamentele ionenwisseling-hars behandeling als een geschikt alternatief. De chromatografie-methode, beschreven in stap 9, geconstateerd worden gegeneraliseerd voor de verbindingen die zijn beschreven in Figuur 3. Verbindingen van verhoogde polariteit kunnen echter een langere periode van 100% ethylacetaat elutie. Met betrekking tot stap 9.2, stroomafwaarts fijne zuivering is volledig samengestelde specifiek, en is ook afhankelijk van de schaal. Herhaalde rondes van kleinschaliger flash chromatografie met geoptimaliseerde hellingen, is meestal voldoende om een passende NMR p.a. zuiverheid. Voor grotere schalen is kristallisatie vaak een handig alternatief. In moeilijke gevallen, kan de voorbereidende of semi-preparatieve krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) afhankelijk van de gewenste hoeveelheid van geïsoleerde samengestelde worden toegepast. Voorbeelden van downstream zuivering processen voor een aantal representatieve verbindingen kunnen worden gevonden elders8.
Het huidige protocol, zoals hier gepresenteerd in ons laboratorium routinematig wordt gebruikt, en heeft bewezen nut. Er is echter nog aanzienlijke ruimte voor verdere optimalisatie van het platform van de expressie. Wordt gewerkt in ons laboratorium om te onderzoeken hoe verdere traject engineering en differentiële controle van expressie eiwitniveaus zou kunnen verbeteren triterpene productie verder, terwijl het bemiddelen van de toxiciteit voor de cellen van de gastheer. Er zijn ook mogelijkheden te onderzoeken van de manipulatie van intracellulair transport systemen20,21, en de richting van enzymen tot andere cellulaire compartimenten22,23, wegen die kunnen verbeteren de efficiëntie van meerdere oxidatie gebeurtenissen. Potentiële voordelen voor het wijzigen van de onderliggende morfologie van belangrijke organellen kunnen ook worden onderzocht. Bijvoorbeeld, heeft overexpressie van het domein van de membraan van Arabidopsis thaliana HMGR waargenomen voor het opwekken van hypertrofie van het endoplasmatisch reticulum in planten24; een belangrijke site voor CYP450 activiteit. Dit protocol is bij uitstek geschikt voor de productie van milligram naar gram-schaal hoeveelheden van triterpene producten, en in de instelling van een onderzoek kan worden gebruikt voor toegang tot compounds voor downstream studie (bijvoorbeeld, het systematische verkenning van structuur-activiteit relaties en vooronderzoek in naar de farmacodynamische en farmacokinetische eigenschappen van loodverbindingen van klinisch belang). Echter, het platform is lineair en betrouwbaar schaalbare gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt, en de uitvoerbaarheid van voorbijgaande expressie via agroinfiltration is aangetoond op industriële schaal voor de productie van farmaceutische eiwitten 14, dus is er potentieel voor dit platform worden uitgebreid voor commerciële productie van hoogwaardige triterpenen. Als alternatief, is het ook mogelijk om de productie van stabiele transformants uitvoering van de multigene biosynthetic pathway gefinaliseerde verlangen, waardoor de massale teelt voor ogen en bleef 'landbouw' van transgene N. benthamiana stammen het produceren van verschillende stoffen met een handelswaarde.

De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Ondanks hun enorme diversiteit, worden alle triterpene-natuurproducten verondersteld te worden afgeleid uit de dezelfde lineaire voorloper 2,3-oxidosqualene, een product van de mevalonate-pathway in planten. Cyclisatie van 2,3-oxidosqualene is gestart en wordt beheerd door een familie van enzymen oxidosqualene cyclases (OSCs) genoemd. Het eerste niveau van diversificatie, vertegenwoordigt deze stap cyclisatie met honderden verschillende triterpene steigers van aard1hebben gemeld. Deze steigers zijn verder gediversifieerd door afstemming van enzymen waaronder, maar niet beperkt tot, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Dergelijke biosynthetic trajecten kunnen leiden tot immense complexiteit, soms resulterend in eindproducten die nauwelijks herkenbaar uit de bovenliggende triterpene. Bijvoorbeeld, wordt de complexe structuur van de krachtige insecticide en antifeedant limonoïde-azadirachtin verondersteld te ontlenen aan een triterpene van de tetracyclic van de tirucallane type3.
Vele triterpene bereide natuurlijke producten, zelfs degenen met relatief ongewijzigde bovenliggende steigers, hebben aangetoond dat het bezitten van medisch relevante biologische activiteit4,,5,,6,7. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen.
Voorbijgaande expressie triterpene biosynthetic enzymen uit andere plantensoorten in N. benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten (Figuur 1). Dit proces kan worden gebruikt voor functioneel karakteriseren kandidaat-enzymen en reconstrueren van de biosynthetic trajecten van belangrijk natuurlijk voorkomende metabolieten. Ook kan het ook worden benut in combinatorische biosynthetic benaderingen om nieuwe triterpene producten, een strategie die in bibliotheken van structureel verwante analogen resulteren kan, waardoor systematische verkenning van de structuur-activiteit verhoudingen te produceren verbindingen van biologisch actieve lood8,9.
Agroinfiltration is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana bladeren. Het proces omvat de infiltratie van bladeren met een suspensie van A. tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen binaire expressie van belang. Dit wordt bereikt via de toepassing van druk waardoor de vloeistof via de stoma, lucht in de intercellulaire ruimte verdringt, en te vervangen met de A. tumefaciens schorsing. De bacteriën worden de respectieve T-Ani overbrengen in het interieur van de plantencellen, resulterend in gelokaliseerde en voorbijgaande eiwituitdrukking in het weefsel geïnfiltreerde blad.
Terwijl elke binaire vector geschikt voor het genereren van transgene planten kan worden gebruikt voor tijdelijke expressie, gebruiken we de Cowpea Mosaic Virus CPMV afkomstige Hypertranslational (HT) eiwit expressie systeem10, 11. in dit systeem het gen van belang wordt geflankeerd door niet-vertaalde regio's (UTR) uit het CPMV RNA-2. De 5' UTR bevat wijzigingen wat resulteert in zeer hoge niveaus van proteïne vertaling met geen afhankelijkheid van virale replicatie12. Deze techniek heeft ontwikkeld tot de Easy-en-Quick (pEAQ) binaire vector serie waarin site-specifieke recombinatie klonen protocol-compatibele constructies (pEAQ -HT- DEST)10,11. Meeste pEAQ vectoren bevatten ook een tomaat borstelige stunt virus afkomstige P19 silencing suppressor gen13 binnen het T-DNA-gedeelte van de expressie cassette, die de noodzaak om een aparte P19-uitvoering stam coinfiltrate omzeilt en biedt zeer op hoog niveau eiwituitdrukking in de ontvangende plant cel10,11.
Gebruik van N. benthamiana als een expressie-host bepaalde voordelen heeft bij het werken met plant biosynthetic trajecten. De cel-architectuur ondersteunt intrinsiek passende mRNA en verwerking van eiwitten en goede brandcompartimentering, naast de noodzakelijke co-enzymen, reductases (voor CYP450s) en metabole precursoren. De koolstofbron is fotosynthese; aldus, kunnen de planten gewoon in goede kwaliteit compost, waarbij alleen water, CO2 (vanuit de lucht), en zonlicht als input worden gekweekt. Het platform is ook zeer handig voor co uitdrukking van verschillende combinaties van eiwitten, zoals dit facilely kan worden bereikt door de co infiltratie van verschillende stammen van A. tumefaciens, ontkenning van de noodzaak om te bouwen van grote multigene expressie -cassettes. Bovendien, het proces kan worden lineair en betrouwbaar aangepast gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment.
Eerdere werkzaamheden in ons laboratorium heeft het nut van dit platform voor voorbereidende schaal experimenten aangetoond. Dit opgenomen de voorbereiding van nieuwe triterpenen voor gebruik in topicale testen en schaal tot en met het bereiken van gram hoeveelheden van geïsoleerde product. Bovendien, de accumulatie van heterogene triterpene producten kan worden verhoogd verschillende vouwen door co uitdrukking van de vorm van een N-terminal-afgekapt, feedback-ongevoelig voor 3-hydroxy-, 3-methyglutary-co-enzym een reductase (tHMGR), een snelheidsbeperking upstream enzym in de mevalonate route8.
Sleutel tot dergelijke experimenten preparative-schaal is de mogelijkheid om een gunstige up-schaal de infiltratie-proces. In een typisch experiment, tientallen tot honderden van planten mogelijk moet bereiken de doelgroep hoeveelheid geïsoleerde product. Infiltrerend individuele bladeren met de hand (met behulp van een onnodig spuit) is operationeel veeleisende, en vaak onbetaalbaar tijdrovend, waardoor deze methode onpraktisch voor routine schaal-up. Vacuüm infiltratie biedt voordelen ten opzichte van de infiltratie van de hand, het is niet afhankelijk van het vaardigheidsniveau van de exploitant en de infiltratie van een grotere ruimte van het blad oppervlak laat. Deze procedure is commercieel gebruikt voor de grootschalige productie van farmaceutische eiwitten14. Dit protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, die kan worden opgebouwd uit onderdelen die commercieel verkrijgbaar. Hierdoor is de gelijktijdige infiltratie van maximaal 4 planten, bieden snelle en praktische batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd (Figuur 2a -2b). Het vacuüm infiltratie apparaat bestaat uit een vacuüm oven die de infiltratie kamer (figuur 2f vormt). De oven is verbonden met een pomp via een vacuüm reservoir. Dit vermindert de tijd die nodig is om de gewenste vacuüm in de zaal van de infiltratie. Planten zijn beveiligd in een op maat gemaakte houder en ondersteboven in een 10 L roestvrij stalen waterbad gevuld met A. tumefaciens schorsing (Figuur 2a -2 c). Volledige onderdompeling van de antenne delen van de planten is belangrijk voor efficiënte infiltratie. Het waterbad wordt dan geplaatst in de vergaderzaal van de infiltratie (figuur 2d -2e), en het vacuüm toegepast om te tekenen van de lucht uit de interstitiële ruimten van blad. Zodra de druk verminderd met 880 mbar (een proces dat duurt ongeveer 1 minuut) de infiltratie kamer aan atmosferische druk snel terug is gebracht 20-30 s door het openen van de oven ingangsafsluiter, waarna infiltratie is voltooid.
Vijf dagen na de infiltratie is het plantmateriaal klaar voor de oogst en de daaropvolgende extractie en isolatie van het/de gewenste product(en). Vanaf dit punt is het proces gewoon een natuurproduct extractie en zuivering van blad materiaal, een werkstroom die is bekend bij elke scheikundige natuurproduct. Er bestaan veel verschillende methoden voor de eerste extractie en zuivering van de daaropvolgende15. De meest geschikte keuze van methoden en de exacte voorwaarden gebruikt is sterk afhankelijk van de bijzondere chemische eigenschappen van de stof van belang, naast de beschikbaarheid van vaardigheden en/of apparatuur. Het is niet mogelijk om op te nemen in dit protocol een volledig gegeneraliseerd, stapsgewijze methode voor de downstream verwerking van geoogste blad plantmateriaal voor geïsoleerde product die blindelings kan worden gevolgd voor elk product van de triterpene van belang, noch zou het geschikt om te proberen om dit te doen. Dit protocol zal evenwel een overzicht van de Basiswerkstroom gebruikt in ons laboratorium en sommige methoden voor de vroege stadia van het proces, die in onze ervaring is gebleken dat generaliseerbaar voor meest zuurstofrijk aglyconen triterpene producten. Het gaat hierbij om twee relatief zeldzaam technieken, namelijk drukkend Solvent extractie (PSE), en een handige heterogene fase methode voor chlorofyl verwijderen met behulp van een sterk basische ionenwisseling hars.
PSE is een zeer efficiënte techniek voor de winning van kleine organische moleculen uit solide matrices. Extracties worden uitgevoerd onder druk (ca. 100-200 bar), het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om het gebruik van verlicht temperaturen die hoger zijn dan het koken punt van de extractievloeistof. Dit kan aanzienlijk verminderen de tijd en de hoeveelheid oplosmiddel die nodig is om een uitputtende extractie, in vergelijking met andere hete oplosmiddel technieken zoals eenvoudige maagzuur of Soxhlet extracties16. Commerciële bank-top PSE-instrumenten zijn beschikbaar, die gebruikmaken van verwisselbare extractie cellen en geautomatiseerde oplosmiddel behandeling, Verwarming en toezicht. Dit maakt deze techniek zeer geschikt. Het is ook duidelijk minder gevaarlijk, vooral voor exploitanten met een beperkte praktische chemie ervaring.
Verzeping van extracten van de ruwe blad onder terugvloeiing gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren is een gemeenschappelijke techniek voor de verwijdering van de bulk van chlorofylen voorafgaand aan latere zuivering of analyse. Echter, dit kan vaak worden operationeel eisen op grotere schalen. Bovendien kunnen detectie voor de interface, of verlies van de producten als gevolg van de vorming van emulsies problematisch zijn. Het gebruik van sterk basische ionenwisselaars uitvoeren van heterogene fase hydrolyse kan dienen als een geschikt alternatief. De gepigmenteerde gedeelte van de gehydrolyseerde chlorofyl blijft zelfklevend aan de hars en kan eenvoudig worden verwijderd door filtratie. Dit protocol maakt gebruik van een voorbereidende schaal aanpassing van een eerder gemelde analytische procedure17 die gebruikmaakt van een commercieel beschikbare fundamentele ionenwisseling hars.
Hieronder beschrijven we een gedetailleerde en snelle protocol voor de productie van de voorbereidende schaal van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Dit protocol is routinematig gebruikt in ons laboratorium voor bereiden tientallen tot honderden milligrammen van geïsoleerde triterpene product voor toepassingen die een structurele karakterisering met nucleaire magnetische resonantie (NMR), infraroodspectroscopie, en/of verder studeren in functionele testen.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &micro;L, 200 &micro;L, 100 &micro;L, 20 &micro;L, 10 &micro;L, and 2 &micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &micro;L, 200 &micro;L, 100 &micro;L, 20 &micro;L, 10 &micro;L, and 2 &micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&rsquo;5&rsquo;-dimethoxy-4&rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg;&nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin

voorbijgaande expressie in nicotiana benthamiana verlaat voor de productie van de triterpene op een voorbereidende schaal

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Groot aantal afgeleiden van de triterpene hebben aangetoond dat medisch relevante biologische activiteit bezitten. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen. Ondanks hun enorme diversiteit, triterpenen zijn allen afgeleid van een enkele lineaire voorloper, 2,3-oxidosqualene. Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in de N. benthamiana kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten die natuurlijk niet door deze host worden geproduceerd. Agro-infiltratie is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana. Het proces omvat infiltratie van bladeren van de plant met een suspensie van Agrobacterium tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen expressie van belang. Co infiltratie van een extra A. tumefaciens stam uitvoering resulteert in een expressie construct codering een enzym dat verhoogt de voorloper aanbod aanzienlijk verhoogt. Na een periode van vijf dagen, kan het geïnfiltreerde blad materiaal worden geoogst en verwerkt om te halen en te isoleren van de resulterende triterpene product(en). Dit is een proces dat is lineair en betrouwbaar schaalbaar, simpelweg door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment. Hierin is beschreven van een protocol voor snelle preparative-schaal productie van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Het protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, waardoor de gelijktijdige infiltratie van maximaal vier planten, waardoor batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd.

Typisch geïsoleerde opbrengsten zijn afhankelijk van de combinatie van enzym/enzym onder onderzoek, de chemische stabiliteit van de doel-verbinding en hoe uitdagend het zuiveringsproces was. We hebben eerder gemeld geïsoleerde opbrengsten van β-amyrin derivaten uit onze experimenten van de combinatorische biosynthese variërend van 0.12 tot 3,87 mg per gram droge N. benthamiana blad poeder. Deze verbindingen varieerden sterk in het niveau van oxidatie en onnatuurlijke combinaties van enzymen (Figuur 3)8opgenomen. Dit protocol wordt routinematig gebruikt in ons laboratorium te produceren tientallen of honderden milligrammen van gezuiverde product voor structurele karakterisering door NMR spectroscopie en downstream functionele testen. We hebben ook de voorbereidende nut van dit platform aangetoond door overlegging van de 0.8 g van de triterpene steiger β-amyrin op een zuiverheid van meer dan 98%. Dit experiment gebruikte 459 planten, en vertegenwoordigt een geïsoleerde rendement van 3,3 mg per gram droge N. benthamiana blad poeder8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figuur 1: schematische samenvatting. Schematische weergave van het proces van exploitatie van voorbijgaande expressie van biosynthetic enzymen in de N. benthamiana blad om af te leiden van endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de voorbereidende productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figuur 2: vacuüm infiltrant bouw en proces. een) Bespoke plant houder een vleugel los. b) maat plant houder vleugels verbonden. c) inversie en onderdompeling van planten. d) inbrengen van de infiltratie-bad. e) infiltratie bad in plaats in de vergaderzaal van de infiltratie. f) Complete vacuüm infiltrant: (1) vacuüm pomp (2) verbinding van vacuüm pomp vacuüm reservoir (3) vacuüm reservoir isolatie ventiel (4) verbinding tussen vacuüm reservoir en de infiltratie kamer (5) manometer (6) luchtinlaatklep (7) Infiltratie kamer (8) vacuüm reservoir. g) vertegenwoordiger vertrekt vanuit één plant geïnfiltreerd met een expressie-constructie voor de groen fluorescente proteïne (GFP) na vijf dagen na infiltratie groei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figuur 3: eerder gemeld representatieve resultaten voor de voorbereidende productie van β-amyrin-derivaten met behulp van dit protocol8. Deze tabel is gerangschikt op geïsoleerde opbrengsten. Kolommen zijn voorwaardelijk opgemaakte met kleurindicatie van relatieve waarde. Rood = hoog, groen = laag (hoewel tussenliggende geel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Dit protocol biedt een gemakkelijke preparatieve toegang tot triterpeenverbindingen voor gebruik in downstream-studies, zoals structurele karakterisering of het uitlopen van medisch relevante biologische activiteit. Het protocol is snel, schaalbaar en maakt het mogelijk om combinaties van enzymen te gebruiken door middel van co-infiltratie van verschillende stammen van Agrobacterium, waardoor de noodzaak om grote multi-gen-vectoren te construeren wordt geëlimineerd. Om te beginnen, inoculeert u een selectieve LB-agarplaat met strepen van de gewenste Agrobacterium tumefaciens-stammen uit glycerolstockcultures.Incubeer de plaat een nacht bij 28 graden Celsius in een stationaire incubator. De volgende dag, inoculeert u individueel 50 milliliter selectieve LB-media met een monster van elke Agrobacterium tumefaciens-stam. Incubeer de cultuur een nacht bij 28 graden Celsius in een schuddende incubator bij 200 rpm.Breng de 50-milliliter culturen individueel over naar 1.000 milliliter selectieve LB-media en incubeer een nacht bij 28 graden Celsius in de schuddende incubator bij 200 rpm. De volgende dag, pellet de Agrobacterium tumefaciens individueel uit de vloeibare culturen door centrifugatie bij 4.000 keer g. Na het weggooien van het supernatant, suspendeert u de pellets individueel in 50 milliliter vers bereid MMA-buffer.Incubeer de gesuspendeerde pellets bij kamertemperatuur in het donker gedurende één uur. Bepaal nu het juiste volume van elke Agrobacterium tumefaciens MMA-suspensie om een ​​finale OD 600 van minimaal 0,2 in een totaal eindvolume van 10 liter te produceren. Combineer de bepaalde volumes van elke suspensie.Voeg nu extra MMA-buffer toe aan de gecombineerde suspensies tot een eindvolume van één liter, om onmiddellijk te worden gebruikt voor vacuüminfiltratie. Breng de één liter infiltratiesuspensie en de één liter 10x sterke MMA-buffer over naar het infiltratiebad, gevolgd door een extra acht liter water. Verwijder de afneembare vleugels van de op maat gemaakte plantenhouder.Plaats vier vijf weken oude planten die zijn gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol, en bevestig de vleugels opnieuw. De infiltratiedekking is aangetast als de bladeren niet volledig ondergedompeld zijn in de infiltratiesuspensie. Dit probleem wordt geminimaliseerd door ervoor te zorgen dat het niveau van de suspensie de bovenkant van de plantenhouder bereikt voorafgaand aan de vacuümbehandeling.Keer de houder om en plaats deze bovenop het infiltratiebad zodat de bladeren in de infiltratiesuspensie worden ondergedompeld. Breng het infiltratiebad met ondergedompelde planten over naar de infiltratiekamer en sluit de deur. Zorg ervoor dat de luchtinlaatklep op de infiltrator gesloten is.Na het inschakelen van de vacuümpomp, opent u de vacuüminlaatklep op de infiltratiekamer. Zodra de druk in de infiltratiekamer met 880 millibar is verminderd, sluit u de vacuüminlaatklep en opent u de luchtinlaatklep. Bij terugkeer naar atmosferische druk, opent u de deur en verwijdert u het infiltratiebad.Hef nu de plantenhouder op totdat de planten niet langer ondergedompeld zijn in de infiltratiesuspensie. Schud vervolgens voorzichtig de houder om overtollig suspensie van de bladeren te laten lopen en terug in het infiltratiebad. Plaats ten slotte de houder terug in de rechtopstaande positie, verwijder de afneembare vleugels en verwijder de planten.Laat de geïnfiltreerde planten vijf dagen groeien bij 25 graden Celsius in 16 uur per dag licht met dagelijks water geven. Na vijf dagen groei, oogst u de bladeren en droog ze vervolgens zoals beschreven in het tekstprotocol. Maal de gedroogde bladeren tot een grove poeder via een handige methode, zoals het gebruik van een huishoudelijke keukenmachine of het handmatig pletten van de bladeren terwijl ze in een zak zijn bewaard.Meng het bladpoeder met kwartszand in een geschikte container. Dit fungeert als een dispersiemiddel en verbetert de efficiëntie van het extractieproces. Bereid nu vier extractiecellen voor het vullen voor door ze eerst om te keren.Voeg vervolgens het glasvezelfilter toe, gevolgd door de metalen frit en houderplug. Breng de extractiecellen terug in de rechtopstaande positie en voeg een laag van één centimeter diep kwartszand toe. Vul de extractiecellen met het bereide bladpoeder tot aan de vullijn.Als dat nodig is, comprimeert u het poeder licht tijdens dit proces om de toevoeging van een grotere hoeveelheid in elke extractiecel te vergemakkelijken. Voeg nu een kleine laag kwartszand toe aan de bovenkant van het gevulde poeder en plaats het bovenste cellulosefilter. Plaats de gevulde extractiecellen in het geperste solventextractie-instrument en voer de gewenste methode uit.Zodra de methode is voltooid, concentreert u de gecombineerde extractievloeistof tot droogte via rotair verdampen onder vacuüm, zoals beschreven in het tekstprotocol. Controleer op de verwachte uitvoer van een donkergroene slurry. Om de chlorofylen te verwijderen, gebruikt u basische ionenuitwisselingshars, lost u eerst het ruwe extract op in een minimale hoeveelheid ethanol.Voeg 50 milliliter basische ionenuitwisselingsharskralen toe aan de resulterende oplossing. Roer vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg elke 30 minuten een extra 50 milliliter basische ionenuitwisselingsharskralen toe totdat de reactie voltooid is.Aanvankelijk zijn de basische ionenuitwisselingsharskralen roze van kleur en de vloeibare fase is groen. Naarmate de reactie vordert, veranderen de harskralen in groen en de vloeibare fase in oranje of een troebele bruine kleur, afhankelijk van de schaal. Filtreer het reactiemengsel door een korte kolom diatomeeënaarde via een glazen flitschromatografiekolom, waarbij u handbellen gebruikt om druk toe te passen.Spoel de verzamelde harskralen met ethanol, gevolgd door één-op-één ethanol naar hexaan en ten slotte met hexaan. Gebruik een spoelvolume dat voldoende is om de kralen op de top van de diatomeeënaardekolom opnieuw te suspenderen. Combineer tenslotte het filtraat, de spoelingen en het concentraat tot droogte door rotair verdampen onder vacuüm.<p

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

We beschrijven een experimenteel ontwerp aanpak die kan worden bepaald en modelleren invloed van transgene regulerende elementen plantengroei en ontwikkeling parameters en incubatieomstandigheden de tijdelijke expressie van monoklonale antilichamen en reporter eiwitten in planten.

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Leer hoe je triterpenen produceert in Nicotiana benthamiana via voorbijgaande expressie met Agrobacterium-infiltratie. Dit protocol biedt een snelle, schaalbare methode voor preparatieve productie van waardevolle natuurlijke verbindingen.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Meer video's verkennen