Name: Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer exponentiële groeikinetiek van Saccharomyces cerevisiae in batchcultuur om ademhalings- en fermentatiemetabolisme te analyseren. Deze methode ondersteunt high-throughput screening van stoffen die fermentatie en mitochondriale ademhaling beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gesteund door subsidies van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (subsidie nummer 293940) en Fundación TELMEX-TELCEL (subsidie nummer 162005585), zowel IKOM.

1. cultuurmedia en entmateriaal voorbereiding
<ol><li>Bereiden van 100 mL vloeibare voedingsbodem van 2% gist extract-pepton-dextrose (YPD) (1 g gist extract, caseïne pepton, 2 g en 2 g glucose aan 100 mL gedestilleerd water toevoegen). Breng 3 mL van de media in 15 mL steriliseerbare conische buizen. Autoclaaf de media gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 1,5 psi. Opmerking: De media kunnen worden opgeslagen voor maximaal een maand bij 4-8 ° C.</li>
	<li>Inoculeer een conische buis gevuld met 3 mL cool steriele 2% YPD bouillon met 250 μL van S. cerevisiae cellen bewaard in glycerol bij-20 ° C. Na een nacht bebroeden in een roteerschudapparaat bij 30 ° C met agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Streak in een petrischaal (60 x 15 mm2) gevuld met steriele 2% YPD agar (Voeg toe 10 g gist extract, caseïne pepton, 20 g 20 g glucose, en 20 g van bacteriologische agar aan 1000 mL gedestilleerd water) met de cellen die zijn geteeld in de conische buis met behulp van een steriele lus. Incubeer de petrischaal bij 30 ° C tot de geïsoleerde kolonies groei vertoont.</li>
	<li>Voorbereiding van de pre entmateriaal door het enten van een enkele geïsoleerde kolonie in een conische buis gevuld met 10 mL cool steriele 2% YPD Bouillon en Incubeer het 's nachts bij 30 ° C met continue agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.</li>
</ol>2. cultuurmedia en groeikrommes in Microplate
<ol><li>Bereiden van 10 mL van de 1% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,1 g van glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen), 10 mL 2% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0.2 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen) , en 10 mL 10% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, pepton, 0.2 g en 1 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen). Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi. Opmerking: De voedingsbodems dient als een controle van fermenterende groei.</li>
	<li>10 mL van 2% gist extract-pepton-ethanol (YPE) Bouillon en 10 mL van 2% gist extract-pepton-glycerol (YPG) Bouillon voorbereiden. Voor 2% YPE: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL ethanol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Voor 2% YPG: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL glycerol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi. Opmerking: Glycerol en ethanol zijn bronnen van niet-fermenteerbare koolstof die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling. Om deze reden worden ze gebruikt als een respiratoire groei-besturingselementen. In deze stap, kunnen de aard en de concentratie van koolstofbron in de cultuur-media worden gewijzigd om te testen van de effecten op groei fenotype met behulp van gist extract-pepton (YP) Bouillon (10 g gistextract en 20 g van caseïne pepton in 1000 mL gedestilleerd water) als basis. Om te testen de effecten van andere voedingsstoffen naast koolstof, wordt synthetische compleet (SC) medium aangevuld overeenkomstig het doel van het experiment. De basis voor SC medium is 1,8 g gist stikstof basis zonder aminozuren, 5 g ammoniumsulfaat [(NH4)2SO4], Mononatrium Fosfaat (NaH2PO4), 1.4 g en 2 g van drop-out mix in 1000 mL gedestilleerd water. Een aanvulling op de media met een koolstofbron en extra stikstofbron in de benodigde concentraties.</li>
	<li>145 μL van geschikte voedingsbodems voor de proefopzet toevoegen aan elk putje van een steriele microplate (10 x 10-well) met een deksel en enten ze met 5 μL van de pre entmateriaal. Opmerking: Als het doel is om het scherm van de invloed van stoffen/verbindingen op de energetische stofwisseling van de gist, dat stof/samengestelde moet worden toegevoegd tijdens deze stap. Ook moet elk soort microplate met een deksel nuttig zijn.</li>
	<li>Incubeer de multi goed plaat in een microplate lezer bij 30 ° C met constante agitatie bij 200 t/min voor 48 h. maatregel de optische dichtheid (OD) op 600 nm elke 30 of 60 min. Opmerking: Als de microplate-lezer niet de optie om te broeden de microplate hoeft, kan het worden geïncubeerd in een roteerschudapparaat op dezelfde voorwaarden tussen elke meting van de OD.</li>
</ol>3. groeikrommes in geschud erlenmeyers
<ol><li>4.8 mL van de geschikte voedingsbodems toevoegen aan 20 mL Erlenmeyerkolven en autoclaaf. Inoculeer elke kolf met 200 μL van de cultuur van de pre entmateriaal bij OD600nm ~ 2 in koele, steriele 2% YPD Bouillon. Incubeer hen bij 30 ° C met constante agitatie bij 250 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur. Opmerking: Als de incubatietijd hoger dan 24 h is, 12 mL van de geschikte voedingsbodems aan conische kolven van 50 mL en autoclaaf toevoegen. Inoculeer hen met 500 μL van de pre entmateriaal. Het is ook belangrijk om te overwegen de fermenterende groei (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol).</li>
	<li>Neem 100 μl van de geschud erlenmeyer cultuur en Verdun het in 900 μL van gedistilleerd water in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL en zachtjes Meng door pipetteren. Meten van de OD op 600 nm met behulp van een spectrofotometer elke 2 h. Voor het verkrijgen van de echte OD, vermenigvuldigt u het resultaat met tien.</li>
</ol>4. verwerking van de gegevens en de berekening van de kinetische Parameters
<ol><li>
Maak een nieuw projectbestand in het statistisch pakket-software. In de sectie van "nieuwe tabel en grafiek", de "XY" -optie te selecteren.
	<ol>
<li>Selecteer de optie: 'Start met een leeg gegevenstabel' in de sectie "Sample data" .</li>
		<li>Selecteer de "Punten en aansluitende lijn" type van de grafiek. De sectie van de "X" in het segment van de "Subcolumns voor replicatieonderzoeken of foutwaarden" uitgeschakeld laten, en in de "Y" sectie Kies de optie: "Voer (10) repliceren waarden in subcolumns naast elkaar en plot gemiddelde en fout SD". Klik op de knop maken. Opmerking: De tabelindeling heeft een X-kolom en meerdere Y-kolommen, elk met de 10 subcolumns eerder gekozen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schrijf de tijd op welke OD metingen werden genomen in de X-kolom (bijvoorbeeld 0, 30, 60, 90 min of 0, 1, 1.5, 2 h). In de Y-kolommen, schrijft de OD-waarden, verkregen uit de culturen.</li>
	<li>Het identificeren van de fase van de exponentiële groei de Y kolomgegevens omzetten in logaritmen. Klik op de knop "Analyseren" , kies het "Transformeren" -analyse, selecteer Y-waarden met behulp van Y = Log(Y). Ga naar de "Galerij van resultaten", selecteer "Transformeren" gegevenstabel, klikt u op "Analyseer" , en kies de "Lineaire regressie" analyse. Uitsluiten van de OD-waarden die een lineair gedrag niet volgen. Als u wilt uitsluiten van waarden, selecteert u deze in de gegevenstabel en typ "Ctrl + E". Opmerking: Het is belangrijk om uit te sluiten van de waarden die niet de exponentiële fase, volgen omdat de exponentiële groei vergelijking goed bij de exponentiële fase past.</li>
	<li>Selecteer de gegevenstabel in de "Gegevenstabellen galerij", "gegevens 1". Klik op de knop "Analyseren" en kies de "Niet-lineaire regressie (kromme fit)"-analyse onder de "XY analyses".</li>
	<li>Selecteer de volgende gegevensverzamelingen moeten analyseren en klik op de knop "OK" . Kies in het tabblad "Fit" de sectie "Exponentiële vergelijking" en selecteer de "exponentiële groei vergelijking" (, waar X cel concentratie is, X0 is cel concentratie tegelijkertijd nul μ is van de specifieke groeisnelheid, en t is tijd). Gebruiken van de "kleinste kwadraten" als een passende methode en de interpolate sectie uitgeschakeld laten. Klik op de knop "OK" . Opmerking: Het tabblad met de niet-lineaire fit resultaten is in de "Galerij van resultaten". De software berekent verdubbeling tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (μ). De software toont μ als K op het tabblad resultaten.</li>
	<li>Open een nieuw projectbestand en selecteer in de sectie "nieuwe tabel en grafiek" de kolom keuze. Kies de optie "Start met een leeg gegevenstabel" en selecteer de gewenste grafiek. Kiezen voor het uitzetten van het gemiddelde met de SD.-Selecteer de knop "Create" .</li>
	<li>De μ of Dt waarden uit het niet-lineaire fit resultaten tabblad dat is in de "Galerij van resultaten" kopiëren en plakken in een kolom. Tot slot Selecteer de knop "Analyseren" en kies de gewenste analyse in de sectie "Kolom analyses" om te vergelijken de kinetische parameters van de verschillende nutrimental voorwaarden. Opmerking: De kinetische parameters verkregen de fermenterende groei besturingselementen (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol) helpt de drempel van fermenterende en mitochondriale ademhaling, stand respectievelijk. Vergelijken van de kinetische parameters van de voeding voorwaarde en stof/compound vehiculumcontrolegroep met de Ademhalings- en fermenterende groei helpen bij het identificeren van mogelijke effect op de luchtwegen of fermenterende metabolisme.</li>
</ol>

<ol><li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li>
<li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li>
<li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect%3F+A+review+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li>
<li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+effect%3A+a+regulatory+system+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
<li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+and+Warburg+effects%3A+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li>
<li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells%3A+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).</li>
<li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.03.100149.002103">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li>
<li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022247X07002260">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li>
<li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).</li>
<li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een lange tijd verstreken is sinds J. Monod10 uitgedrukt dat de studie van de groei van bacteriële culturen de basismethode van de microbiologie is. De komst van de moleculaire tools vertraagt het gebruik en de studie van de groei als een techniek. Ondanks de complexiteit van groei, waarbij tal van onderling samenhangende processen, kunnen de onderliggende mechanismen worden beschreven met behulp van wiskundige modellen11. Dit is een robuuste benadering die kan worden gebru...

Saccharomyces cerevisiae groei heeft gediend als een waardevol instrument te identificeren van tientallen fysiologische en moleculaire mechanismen. Groei is gemeten voornamelijk op drie manieren: seriële verdunningen voor ter plaatse testen, kolonie-vormende unit tellen en groeikrommes. Deze technieken kunnen alleen of in combinatie met een verscheidenheid aan substraten, omgevingsfactoren, mutanten en chemicaliën te onderzoeken specifieke antwoorden of fenotypen worden gebruikt.
Mitochondriale ademhaling is een biologisch proces waarin groei kinetiek met succes toegepast is voor het ontdekken van onbekende mechanismen. In dit geval de suppletie van groei media met niet-fermenteerbare koolstof bronnen zoals glycerol, lactaat of ethanol (die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling), omdat de enige bron van koolstof en energie voor de evaluatie van zorgt de respiratoire groei, die belangrijk is voor de opsporing van verstoringen in oxidatieve fosforylatie activiteit1. Aan de andere kant, is het ingewikkeld om groei kinetische modellen te gebruiken als een methode voor het ontcijferen van de mechanismen achter gisting.
De studie van gisting en mitochondriale ademhaling is essentieel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen achter bepaalde fenotypen zoals de Crabtree en Warburg effecten2,3. Het effect van de Crabtree wordt gekenmerkt door een toename van glycolytic flux, onderdrukking van mitochondriale ademhaling, en de oprichting van gisting als de primaire route voor het genereren van ATP in aanwezigheid van hoge concentraties van fermenteerbare koolhydraten (> 0,8 mM)4,5. Het Warburg effect is metabolisch analoog naar de Crabtree-effect, met het verschil dat bij zoogdiercellen het belangrijkste product van de gisting lactaat6 is. Inderdaad, het Warburg effect wordt tentoongesteld door een verscheidenheid van kankercellen, triggering van de glucose-opname- en consumptie zelfs in aanwezigheid van zuurstof7. Aldus, heeft bestuderen van de moleculaire basis van de overstap van ademhaling om gisting in het effect van de Crabtree zowel de biotechnologische gevolgen (voor de productie van ethanol) en de potentiële effecten in kankeronderzoek.
S. cerevisiae groei mogelijk een geschikt hulpmiddel om te bestuderen van de Crabtree en Warburg effecten. Dit idee is gebaseerd op het feit dat in de exponentiële fase van gist, de centrale trajecten gebruikt voor de productie van ATP zijn mitochondriale ademhaling en gisting, die essentieel is om groei te ondersteunen. Bijvoorbeeld, is de groei van S. cerevisiae nauw verwant met de functie van ATP genererende trajecten. In S. cerevisiae, de mitochondriale ademhaling produceert ongeveer 18 ATP-moleculen per molecuul glucose, overwegende dat vergisting alleen 2 ATP-moleculen genereert, vandaar de verwachting is dat de groei nauwe banden met de stofwisselingsroutes heeft het produceren van ATP8. In dit opzicht, wanneer de gisting is de belangrijkste route voor het genereren van ATP, compenseert de gist de lage productie van ATP door het optrekken van het steunpercentage van de glucose-opname. Integendeel, is de glucose consumptie door gistcellen die gebruikmaken van mitochondriale ademhaling als de hoofdbron van ATP laag. Dit geeft aan dat het belangrijk is voor de gist om zin koolhydraten beschikbaarheid voordat er wordt bepaald hoe ATP zal worden gegenereerd. Dus, de beschikbaarheid van glucose speelt een belangrijke rol in de switch tussen gisting en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae. In de aanwezigheid van grote hoeveelheden glucose verkiest de gist gisting als de centrale route voor het genereren van ATP. Interessant is dat wanneer de gist is fermenteren, wordt de specifieke groeisnelheid gehandhaafd op zijn maximum. Aan de andere kant onder lage niveaus van de glucose produceert S. cerevisiae ATP mitochondriale ademhaling, met behoud van lagere groeicijfers. Aldus, variatie in de concentratie van glucose en het gebruik van andere bronnen koolstof veranderingen bij de gist de voorkeur tussen fermenterende en respiratoire groei veroorzaken. Rekening houdend met dit feit met de vergelijking van exponentiële groei, kan men de biologische betekenis van kinetische parameters zoals de verdubbeling van de tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (µ) verkrijgen. Lagere waarden µ bleken bijvoorbeeld wanneer de gist mitochondriale ademhaling als het primaire traject gebruikt. Integendeel, onder voorwaarden die gisting gunst, hogere waarden µ bleken. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van de waarschijnlijke mechanismen van elke chemische stoffen op het gebied van fermentatie en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae.
Het doel van deze paper is voor te stellen een methode gebaseerd op de kinetiek van de groei voor het screenen van de effecten van een bepaalde stof/samengestelde op mitochondriale ademhaling of gisting.

<table><tbody><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>4353</td><td>Voor inoculum incubatie of kegelvormige fask culturen</td></tr><tr><td>Bioscreen&nbsp;</td><td>Groeicurves</td><td>C MBR</td><td>Voor batch culturen in microplates</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7021</td><td>Voor YPD bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Pepton van caseïne, enzymatisch verteerd</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>82303</td><td>Voor YPD bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>09182-1KG-F</td><td>Voor YPD bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Bacteriologische Agar</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5306</td><td>Voor YPD agar bereiding</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S8282</td><td>Voor SC bouillon bereiding</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4418</td><td>Voor SC bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Gist stikstofbasis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1251</td><td>Voor SC bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Gist synthetische drop-Out medium supplementen</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1501</td><td>Voor SC bouillon bereiding</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat korrelig</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-R</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R5010</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7903</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>Absolut ethanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>J.T. Baker</td><td>2136-01</td><td>Voor medium aanvulling voorbeeld</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Voor data-analyse</td></tr><tr><td>Honeycomb microplates</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502550</td><td>Voor microplate culturen</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae exponentiële groei kinetiek in batch cultuur voor het analyseren van de ademhalings- en fermenterende metabolisme

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cellen in de exponentiële fase groei hun wordt aangewezen door het produceren van ATP door middel van fermentatie en/of mitochondriaal ademhaling. De fermenteerbare koolstofconcentratie regelt voornamelijk hoe de gistcellen genereren ATP; Dus, de variatie in fermenteerbare koolhydraten niveaus rijdt de energetische stofwisseling van S. cerevisiae. Dit witboek beschrijft een methode van de high-throughput gebaseerd op exponentiële gist groei te schatten van de effecten van veranderingen van de concentratie en de aard van de koolstofbron op ademhalings- en fermenterende metabolisme. De groei van S. cerevisiae is gemeten in een microplate of geschud conische kolf door bepaling van de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Vervolgens is een groeicurve gebouwd door plotting OD tegen de tijd, waardoor identificatie en selectie van de exponentiële fase, en is uitgerust met de vergelijking van exponentiële groei te verkrijgen van de kinetische parameters. Lage specifieke groeisnelheden met hogere verdubbeling keer vertegenwoordigen in het algemeen een respiratoire groei. Daarentegen geven hogere specifieke groeisnelheden met lagere verdubbeling keer fermenterende groei. Drempelwaarden van een verdubbeling van de tijd en de specifieke groeisnelheid worden geschat met behulp van bekende respiratoire of fermenterende aandoeningen, zoals niet-fermenteerbare koolstof bronnen of hogere concentraties van fermenteerbare suikers. Dit percentage wordt verkregen voor elke specifieke soort. Tot slot worden de berekende kinetische parameters vergeleken met de drempelwaarden vast te stellen of de gist fermenterende en/of respiratoire groei toont. Het voordeel van deze methode is de relatieve eenvoud voor inzicht in de effecten van een stof/samengestelde op fermenterende of luchtwegen metabolisme. Het is belangrijk om te benadrukken dat groei een ingewikkelde en complexe biologische proces is; Daarom moet de voorlopige gegevens van deze methode worden bevestigd door de kwantificering van zuurstofverbruik en accumulatie van bijproducten van gisting. Daarmee is deze techniek kan worden gebruikt als een oriënterende van verbindingen/stoffen die kunnen storen of verbetering van fermenterende of luchtwegen metabolisme.

Groeikrommes kunnen worden gebruikt om preliminair discrimineren tussen ademhalings- en fermenterende fenotypen in de S. cerevisiae gist. Dus we batch culturen van S. cerevisiae (BY4742) uitgevoerd met verschillende glucose concentraties die zijn gemeld voor het opwekken van fermenterende groei: 1%, 2% en 10% (m/v)9. Culturen waaruit een fermenterende fenotype hebben een kleine vertraging-fase en een exponentiële fase met een hoog groeipercentage ...

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op biotechnologische en biomedische gebieden, zoals wat de moleculaire basis zijn achter de Warburg en de Crabtree-effecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de hoge doorvoer studie van de effecten van bepaalde stoffen in de luchtwegen en fermentatieve metabolisme mogelijk maakt. Begin met het inenten van een 15-milliliter conische buis met drie milliliter koele, steriele 2%gist extract peptone dextrose, of YPD bouillon, met 250 microliter s.cerevisiae gistcellen bewaard in glycerol bij negatieve 20 graden Celsius.Incubeer de gist 's nachts in een orbitale shaker bij 30 graden Celsius en 200 rpm. voor strepen op een 60-milliliter, 2%YPD agar gevuld petrischaal de volgende ochtend. Kweek het gerecht op 30 graden Celsius tot geïsoleerde kolonies worden waargenomen.Dan inenten een enkele geïsoleerde kolonie in een nieuwe conische buis met 10 milliliter koele, steriele 2%YPD bouillon voor 's nachts cultuur op 30 graden Celsius met schudden. Voor microplate groei-curve setup, voeg 145 microliters van een geschikt experimenteel cultureel medium aan elke put van een steriele 10-bij-10 goed microplaat met een deksel en inenting elk goed met vijf microliter van de nachtelijke cultuur. Vervolgens incubeer de multi-well plaat in een microplate lezer op 30 graden Celsius met constante agitatie bij 200 rpm gedurende 48 uur, het meten van de optische dichtheid op 600 nanometer om de 30 of 60 minuten.Voor geschud conische kolf groei-curve setup, inenting 20 milliliter conische kolven met 4,8 milliliter van een geschikte steriele cultuur media met 200 microliters van pre-inoculum cultuur op een 600 nanometer optische dichtheid van twee voor incubatie bij 30 graden Celsius en 250 rpm. Agitatie bij 250 omwentelingen per minuut is van cruciaal belang om een geschikte groei in lage concentraties van koolstofbronnen die ademhalingsgroei uit te oefenen als we hebben waargenomen een verminderde gistgroei in ademhalingsaandoeningen bij lagere agitatie snelheden te bereiken. Om de optische dichtheid gedurende 24 uur elke twee uur meten van de optische dichtheid op 600 nanometer mogelijk te maken, verdunt u 100 microliters van de geschude conische kolfcultuur in 900 microliter gedestilleerd water in een spectrofotometer cuvette van één milliliter en meng voorzichtig door pipet.Voor gegevensverwerking maakt u in een geschikte statistische pakketsoftware een nieuw projectbestand, opent u de nieuwe tabel- en grafiekmenu en selecteert u XY. Selecteer onder het voorbeeldgegevensmenu beginnen met een lege gegevenstabel en een punten- en verbindingsregelgrafiek. Laat de sectie X niet geselecteerd in subcolumns voor replica's of foutwaarden. Selecteer in de sectie Y 10 repliceren waarden in subkoloms naast elkaar en plot gemiddelde en fout-SD. Klik vervolgens op maken.Voer het tijdstip in waarop de OD-metingen zijn verkregen in de kolom X en de OD-waarden die zijn verkregen uit de culturen in de kolom Y. Als u de exponentiële groeifase wilt identificeren die de kolomgegevens van de Y omzet in logaritmen, klikt u op analyseren en selecteren van de transformatieanalyse. Gebruik Y is gelijk aan logboek Y om de Y-waarden te selecteren en de galerij met resultaten te openen.Selecteer de transformatiegegevenstabel, klik op analyseren en selecteer de lineaire regressieanalyse, met uitzondering van de optische dichtheidswaarden die geen lineaire trend volgen door de waarden in de tabel te selecteren en het besturingselement en E.In de tabelgalerie te deprimeren, de gegevens één tabel te selecteren en op analyseren te klikken. Selecteer de niet-lineaire regressiecurve-fit-analyse en de gegevenssets die u wilt analyseren en klik op OK. Pas vervolgens de minste vierkanten toe die passen bij de gegevens, waardoor de interpolatiesectie niet is geselecteerd en klik op OK. Open vervolgens een nieuw projectbestand en selecteer in het nieuwe tabel- en grafiekmenu de kolomkeuze, begin met een lege gegevenstabel en de gewenste grafiek. Stel de grafiek in om het gemiddelde met de standaarddeviatie te plotten en klik op maken.Kopieer de gemiddelde of deltatijdwaarden uit de resultatentabel niet-lineaire passen in de galerie met resultaten en plak de gegevens in een kolom. Klik tot slot op analyseren en selecteer de analyse van de interesse in het menu kolomanalyses om de kinetische parameters van de verschillende nutrimental-voorwaarden te vergelijken. De kinetische groeidrempelwaarden variëren per sterkte en moeten worden geëvalueerd op basis van de voorwaarden die we in de analyse gebruiken.Culturen die een fermentatief fenotype aantonen, hebben een kleine vertragingsfase en een exponentiële fase met een hoge groeisnelheid. Culturen die energie verkrijgen voornamelijk door oxidatieve fosforylatie vertonen een langere vertragingsfase met een langzame groei tijdens de exponentiële fase. Berekening van de specifieke groeisnelheid en verdubbelingstijd van de groeicurven met behulp van de exponentiële groeivergelijking maakt het mogelijk om drempels vast te stellen voor de ademhalings- en fermentatieve groeiwaarden.Bijvoorbeeld, in deze representatieve experimenten, de effecten van verschillende resveratrol concentraties op S.cerevisiae BY4742 cellen onthullen de wijziging van de cel energetische status in reactie op verschillende glucoseconcentraties. Hier, suppletie met 10%glucose toont aan dat lagere concentraties van ammonium gunst fermentatieve metabolisme zoals blijkt uit een uitgebreide exponentiële groeifase in deze culturen, terwijl een hogere concentratie induceert een respiro-fermentatieve metabolisme zoals blijkt uit een uitgebreide vertraging fase en een tragere groei tijdens de exponentiële fase. Ten slotte kunnen robuuste verschillen in fermentatieve verdubbelingstijdwaarden worden waargenomen tussen deze twee verschillende giststammen die onder dezelfde omstandigheden worden geteeld, waarbij de noodzaak wordt benadrukt om de verdubbelingstijddrempel voor elke geanalyseerde stam te valideren.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat dit protocol alleen wordt gebruikt om fenotype screenen. De specifieke effecten op de ademhaling en fermentatie moeten worden bevestigd door respectievelijk de tests van het zuurstofverbruik of door de accumulatie van fermentatiebijproducten.

saccharomyces-cerevisiae-exponential-growth-kinetics-batch-culture-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Het steady state niveau van specifieke mRNA's wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA's kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wij presenteren een methode voor het kwantificeren van groeifenotypes van individuele gistcellen, aangezien zij groeien in kolonies op vaste media met behulp van tijdlapse microscopie, één-celdubbelevaluatie van levende arrays van gist (ODELAY). Bevolkings heterogeniteit van genetisch identieke cellen die in kolonies groeien, kunnen direct worden waargenomen en gekwantificeerd.

ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Mitochondriale ademhaling in gistcellen is een waardevolle indicator van de bio-energetica van cellen. Hier presenteren we een protocol om dit fenotype te kwantificeren dat van toepassing is op verschillende gistsoorten.

Kwantificering van mitochondriale ademhaling in hele gistcellen

Dit protocol maakt gebruik van een bioluminescente reporter, waardoor metingen van transcriptionele activiteit in Saccharomyces eubayanus mogelijk zijn om de overgang van glucose naar maltose te volgen, waardoor real-time analyse van metabole aanpassingen mogelijk is en stamoptimalisatie voor industriële fermentatie onder diverse omstandigheden wordt ondersteund.

In vivo Monitoring van transcriptionele activiteit tijdens metabole overgang met behulp van een bioluminescente reporter in gist

Leer exponentiële groeikinetiek van Saccharomyces cerevisiae in batchcultuur om ademhalings- en fermentatiemetabolisme te analyseren. Deze methode ondersteunt high-throughput screening van stoffen die fermentatie en mitochondriale ademhaling beïnvloeden.

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme (Video) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Meer video's verkennen