Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Deze methode biedt een hoog doorvoerplatform voor de screening van Salmonella en Shigella. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is herhalen, specifiek, gevoelig en hoge doorvoer. Deze techniek combineert NAAT snelle methode en cultuur waarin real-time PCR screening werd toegepast eerste, en vervolgens positieve degenen werden verzonden voor bacteriën cultuur en identificatie.

Hoewel deze methode zich richt op Salmonella en Shigella screening, kan het ook worden toegepast op andere ziekteverwekkers zoals Vibrios, Staphylococcus, E.Coli, en et cetera. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de selectie van de juiste kolonie moeilijk is vanwege achtergrondflora in monsters. Om te beginnen, voeg drie milliliter voedingsbouillon aan elk monster.

Dan, incubeer de monsters op 36 graden Celsius voor zes uur. Daarna, centrifuge de pre-verrijking cultuur op 800 gs gedurende twee minuten. Breng de supernatant vervolgens over op een nieuwe buis en vercentrifuge het opnieuw gedurende vijf minuten op 12.000 gs.

Voeg na het weggooien van de supernatant 100 microliters DNA-extractieoplossing toe aan de pellet. Dan, draai de buis voor een minuut. Verwarm vervolgens het monster op 1.000 graden Celsius in het droge bad.

Na het herhalen van de centrifugatie, verzamel de supernatant in een nieuwe buis. Maak eerst het reactiemengsel en stel het fietsprogramma in volgens het tekstprotocol. Voer vervolgens real-time PCR uit op een fluorescerende real-time PCR-machine.

Voeg eerst 100 microliter van de pre-verrijkingscultuur toe aan vijf milliliter selenietkristalmedium. Vervolgens, broeden de cultuur op 36 graden Celsius voor 18 tot 24 uur. Verzamel vervolgens een lus van de cultuur en verspreid deze op een bord.

Vervolgens, incubeer de plaat op 36 graden Celsius voor 18 tot 24 uur. Selecteer na incubatie verdachte kolonies en breng ze over naar een bord. Broed de plaat 18 tot 24 uur op 36 graden Celsius.

Identificeer vervolgens de verdachte kolonie met behulp van een geautomatiseerd microbiële identificatiesysteem. Om te beginnen O-antigeen karakterisering, voeg een druppel van de O-antigeen polyvalente sera aan een schone dia. Breng een lus van de kolonie naar de glijbaan en maal het in de sera.

Als de bacteriën eruit zien als stromend zand, herhaal dan de vorige behandeling met O-antigeen monovalente sera totdat het antigeen wordt gekenmerkt. Om te beginnen H-antigeen karakterisering, voeg een druppel H-antigeen polyvalente sera aan een schone dia. Verzamel vervolgens een lus vol van de kolonie en raster deze in de sera.

Gebruik H-antigeen monovalente sera om de behandeling te herhalen totdat het specifieke H-antigeen wordt gekenmerkt. Om de cultuur te scheiden, verzamel je een lus van de pre-verrijkingscultuur en verspreid je deze op een bord. Dan, incubeer de plaats op 36 graden Celsius voor 18 tot 24 uur.

Na incubatie, het verzamelen van een verdacht uitziende kolonie op een bord. Broed de plaat 17 tot 24 uur op 36 graden Celsius. Onderwerp de kolonie vervolgens aan biochemische identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbiële identificatiesysteem.

Breng vervolgens een druppel Shigella-soorten polyvalente sera aan op een schone glijbaan. Gebruik vervolgens een micro-lus om een aantal van de bacteriën te verzamelen en het in de sera te malen. Ten slotte, als de sera lijken op stromend zand, gebruik Shigella soorten monovalente sera om verder te karakteriseren van de bacteriën.

Met behulp van dit protocol werden ontlastingsmonsters van patiënten gescreend op Salmonella- en Shigella-soorten. Met behulp van real-time PCR was er een succesvolle versterking in het HEX-kanaal, wat aangeeft dat het monster positief was voor Salmonellasoorten. Verdere real-time PCR gaf aan dat monster twee positief was voor Salmonella en werd gekozen voor geleide Salmonella soortencultuur.

In de geleide cultuur van Salmonella soorten, werden de roze en paarse kolonies afzonderlijk verguld en onderworpen aan biochemische identificatie. De resultaten gaven aan dat de kolonies uit monster twee Salmonella paratyphi B. Met behulp van real-time PCR, was er succesvolle versterking in het FAM-kanaal, wat aangeeft dat het monster positief was voor Shigella-soorten. Verdere real-time PCR gaf aan dat monster 10 positief was voor Shigella en werd gekozen voor begeleide cultuur.

In de geleide cultuur van Shigella soorten, werden de roze-rode en kleurloze kolonies afzonderlijk verguld en onderworpen aan biochemische identificatie. De resultaten gaven aan dat monster 10 Shigella sonnei fase II bacteriën bevatte. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om de beperking van de methode als gevolg van sequentievariatie onthouden.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals directe cultuur, worden uitgevoerd om valse negatieve real-time PCR-resultaten te voorkomen. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van Salmonella en Shigella detectie, omdat het nieuwe protocol het positieve tarief met tweelediging zou kunnen verhogen en de werklast en TAT aanzienlijk zou kunnen verminderen. Vergeet niet dat het werken met Salmonella en Shigella uiterst gevaarlijk kan zijn, en de persoonlijke beschermingsmiddelen, PPE, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.