Name: Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer hoe je lage-dichtheid neutrofielen isoleert uit peritoneale spoelvloeistof om NET-vorming en tumorcelbinding te visualiseren. Deze methode onthult mechanismen van tumorimmunologie en metastase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken mevrouw J. Shinohara en I. Nieda voor technische en administratieve werkzaamheden. Wij danken ook, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta Kentaro Kurashina en Kazuya Takahashi voor hun samenwerking voor monster acquisitie in de operatiekamer. Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, wetenschap, sport, en cultuur van Japan en de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (17K 10606).

LDN patiënten ingeschreven in deze studie werden verkregen en zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Jichi medische universiteit.
1. isolatie van LDN uit de buikholte Lavages en netto detectie
<ol><li>Monster overname<ol>
<li>Infundeer 1000 mL normaal steriele zoutoplossing rechtstreeks in de buikholte vóór afsluiting van de wond bij patiënten die een abdominale chirurgie als gevolg van gastro-intestinale maligniteit hebben ondergaan. Opmerking: Monsters zijn verkregen van patiënten die onderging een Gastrectomie, colectomy of esophagectomy zonder vooringenomenheid op basis van leeftijd of geslacht. Saline werd overgebracht naar een container en gegoten in de hele buik binnen één minuut. Dit is routinematig uitgevoerd als een postoperatieve peritoneale wassen zonder aanzienlijke gevolgen voor de patiënten.</li>
		<li>Lavage de buikholte uitgebreid voor minstens 1 min. Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de geïnfundeerd vloeistof langzaam wordt geroerd met de surgeon's handen zodat de monsters uniform zijn.</li>
		<li>Herstellen van 200 mL lavage vloeistof met vier spuiten van 50 mL. Opmerking: Soms wordt een rubber-connector gebruikt tot het nemen van de vloeistoffen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuivering van peritoneale LDN granulocyt specifieke mAb, CD66b16gebruiken uitvoeren Opmerking: Omdat de tussenliggende laag na dichtheid kleurovergang centrifugeren vele mononucleaire cellen bevat, positieve selectie van polymorf neutrofiele granulocyten met behulp van mAb CD66b werd uitgevoerd.<ol>
<li>De vloeistof peritoneale lavage overbrengen in een tube van 50 mL. Opmerking: In deze stap passeren de vloeistoffen een 100 µm nylon filter voor het verwijderen van onzuiverheden.</li>
		<li>Centrifugeer het buikvlies vocht bij 270 x g gedurende 7 min op RT.</li>
		<li>Resuspendeer de pellets in 5 mL PBS met 0,02% EDTA.</li>
		<li>Zorgvuldig bedekken de 5 mL celsuspensie op een dichtheid van de kleurovergang oplossing in 3 mL.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1700 x g gedurende 15 minuten op RT zonder alle einden.</li>
		<li>Oogst de ~ 2-3 mL oplossing met de tussenliggende lagen (figuur 1A) met behulp van een precisiepipet en meng dit met 10 mL PBS met 0,02% EDTA.</li>
		<li>Centrifugeer het buikvlies vocht bij 400 x g gedurende 7 min op RT en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg een ander 10 mL PBS met 0,02% EDTA en centrifuge bij 270 x g gedurende 7 min op RT. Discard het supernatant.</li>
		<li>Los de cel pellet (1 x 107) in 60 µL van buffer voor de magnetische cel scheiding kit.</li>
		<li>Voeg toe 20 µL van Fc blok aan de pellets en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Voeg 20 µL van de anti-CD66b geconjugeerd met microbeads en incubeer gedurende een extra 10 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Wassen en resuspendeer de pellets in 500 µL van MACS buffer.</li>
		<li>De celsuspensie van toepassing op een magnetische kolom in het magnetisch veld van een geschikt magnetische scheidingsteken en verzamelen de doorstroming met CD66b(-) cellen door het wassen van de kolom met 15 mL buffer.</li>
		<li>Verwijder de kolom uit de magnetische scheidingsteken en onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde CD66b(+) cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom. Opmerking: De CD66b(+)-celpopulatie bestaat meestal uit neutrofielen zoals bepaald door FACS analyse waaruit blijkt dat > 95% van de CD66(+)-fractie zijn voor CD11b, CD15 en CD16 positief, maar negatief voor de CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generatie van netten<ol>
<li>Na centrifugeren bij 270 x g gedurende 7 min op RT, resuspendeer de geïsoleerde LDN (5 x 106) in 1 mL RPMI1640 met 10% FCS.</li>
		<li>Cultuur de LDN op een 6-well poly-L-lysine beklede plaat (6 cm diameter) gedurende 2 uur op 37 ˚C in 5% CO,2.</li>
		<li>De groen fluorescente counterstain (een membraan-ondoordringbare kleurstof om vlek de celkern en de chromosomen) op de uiteindelijke concentratie van 5 µM toevoegen.</li>
		<li>Onmiddellijk observeren de morfologie van netten (de extracellulaire DNA componenten de LDN onder fluorescentie microscopie uitgezet).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kleuring van tumorcellen met rode fluorescerende cel Linker kleurstof
<ol><li>Bereiden menselijke kanker cellijnen, MKN45, NUGC en OCUM-1.</li>
	<li>Wassen van 1 x 107 cellen met PBS + 0,02% EDTA in een tube van 15 mL en centrifuge op 270 x g gedurende 7 minuten op RT.</li>
	<li>Voeg 1 mL van oplossing voor kleurstof vlekken aan de pellets en Pipetteer zachtjes.</li>
	<li>4 µL van rood fluorescerende cel Linker kleurstof in 1 mL van oplossing voor vlekken los en meng met de celsuspensie uit stap 2.2.</li>
	<li>Incubeer de pellets voor 4 min op RT.</li>
	<li>Voeg 4 mL DMEM (10% FBS) om te stoppen met de kleuring reactie.</li>
	<li>Centrifugeer 270 x g gedurende 7 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Herhaal stap 2.6 en 2.7 tweemaal.</li>
	<li>Neem contact op met een fluorescentie Microscoop (excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm) dat de tumorcellen rood worden gekleurd.</li>
</ol>3. analyse van Tumor cel adhesie aan netten
<ol><li>Resuspendeer de rode fluorescerende gebeitst tumorcellen (1 x 106) in 1 mL RPMI 1640 aangevuld met 0,1% BSA.</li>
	<li>De tumorcellen aan de LDN cultuur dat de netten geproduceerd zoals beschreven in stap 1.3 toevoegen.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 min op 37 ˚C, waarmee de tumorcellen contact opnemen met de netten. Opmerking: Lange incubatie induceert tumor cel adhesie LDN of aan de platen.</li>
	<li>Verwijder het medium en zachtjes was de putjes goed door toevoeging van 2 mL voorverwarmde media (0,1% BSA + RPMI 1640) en zwenken van de schotel.</li>
	<li>Herhaal de procedure wassen in stap 3.4 tweemaal. Opmerking: Sinds netten zwak hechten aan de plaat, zo voorzichtig mogelijk om verwijdering van de netten zich wassen moet worden gedaan.</li>
	<li>Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen op een eindconcentratie van 5 µg/mL voor visualisatie van de netten.</li>
	<li>Observeren van de netten en aangesloten tumorcellen met behulp van de juiste filters (groen, excitatie = 504 nm, uitstoten = 523 nm; rood, excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm).</li>
	<li>Het samenvoegen van de cijfers om aan te tonen van de tumorcellen die zijn gevangen door de netten. Opmerking: In sommige experimenten, DNA afbraak enzym is toegevoegd aan de LDN cultuur (eindconcentratie van 100 U/mL) 5 min vóór co incubatie gedurende 5 min.</li>
</ol>4. time Lapse Video-analyse van de gevangen tumorcellen
<ol><li>Cultuur de peritoneale LDN in een 35 mm ronde schotel bedekt met poly-L-lysine zoals beschreven in stap 1.3.</li>
	<li>Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen te visualiseren netten zoals beschreven in stap 1.3.</li>
	<li>Verwijder het medium na 1 min van incubatie, en voeg 2 mL 0,1% BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Verwijder de media en voeg onbevlekt 1 x 106 MKN45 cellen gesuspendeerd in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubeer gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Verwijder eventuele niet-vastgemaakte tumorcellen door voorzichtig wassen zoals beschreven in stap 3.4 en DMEM met 10% FCS aangevuld met 100 u/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine toevoegen.</li>
	<li>Monteren van de schotel van cultuur in een systeem voor de observatie van uitzicht op de gehele cel en selecteert u het desbetreffende veld in welke tumor cellen zijn gevangen door de netten.</li>
	<li>Blijven samen cultuur voor een extra 2 dagen en nemen continue foto's van het veld elke 6 min onder normaal licht en fluorescentie, die MKN45 cellen en netten, respectievelijk detecteert.</li>
	<li>De beelden op elk timepoint superponeren en time-lapse video's met behulp van Image Viewer software te bouwen.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Eerdere studies hebben gemeld dat circulerende tumorcellen kan worden gevangen door netto substraten in vivo10,11. Metastatische borstkanker kankercellen is gebleken stimuleren neutrofielen en vorming van netten, die in de groei van de cel van de tumor in de target orgel17 helptinduceren. Daarnaast vonden we dat op korte termijn culturen van LDN van postoperatieve lavage vloeistof geproduceerd enorme netten die efficiënt tumorcell...

Polymorf nucleaire neutrofielen in het bloed circuleren zijn het meestal gescheiden van mononucleaire cellen via de dichtheid kleurovergang voorbereiding methode. Sommige neutrofiele granulocyten bekend als low-density neutrofiele granulocyten (LDN), met CD11b(+), CD15(+), CD16(+) en CD14(-) fenotypen, zijn echter mede gezuiverde met mononucleaire cellen. Het relatieve aantal LDN aanzienlijk verhoogt in verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune ziekten1,2, sepsis3en kanker4,5. Eerdere studies hebben aangetoond dat LDN een fenotypische en functioneel verschillend soort neutrofielen6. Opgemerkt moet worden dat LDN in het circulerende bloed hebben meer kans op produceren neutrofiele extracellulaire vallen dan normale dichtheid neutrofielen2,7(netten). Netten zijn web-achtige structuren samengesteld van nucleïnezuren, histonen, proteasen en korrelig en cytosolische eiwitten, en ze kunnen efficiënt vangen en het vernietigen van ziekteverwekkers8.
Onlangs, netten zijn gebleken om vast te leggen niet alleen microben, maar ook bloedplaatjes en circulerende tumorcellen die bij trombose vorming9 en tumor uitzaaiingen10,11 helpen kunnen. De moleculaire mechanismen achter de zelfklevende interacties tussen netten en bloedplaatjes of tumorcellen zijn echter nog onduidelijk. Meer recentelijk, een hechting in vitro assay geopenbaard dat myeloïde leukemie cellen (K56212) en Long carcinoom cellen (A54913) aan netten via β1 en β3 integrins hechten. De auteurs gebruikt NET voorraad geïsoleerd van neutrofielen en geactiveerd door phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als de hechting substraat14. Hoewel deze test maakt de ontdekking van echte interactie met netto componenten in de afwezigheid van neutrofiele granulocyten, is het betwistbaar of de "cel-vrij NET voorraad" geïsoleerd door middel van centrifugeren high-speed behoudt de molecuulstructuur identiek aan netten geproduceerd in vivo. Onlangs, vonden we dat peritoneale lavage vloeistof na abdominale heelkunde vervatte veel volwassen LDN, die enorme netten gegenereerd en gekoppeld aan tumorcellen peritoneale metastasen15veroorzaakt. In deze studie onderzochten we met succes de hechting van de tumorcellen aan intact netten zonder enige fysieke manipulatie. Hier, laten we details van een techniek voor het detecteren van zelfklevende interacties tussen netten en gratis tumorcellen.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, ZWEDEN</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Whole Blood CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetic Separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, Japan</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td><td>gibco by life technologies, Mexico</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder, &ge;96% (agarose gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>fluorescein stereomicroscope</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japan</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Whole view cell observation system</td><td>Nikon, Kanagawa, Japan</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 human gastric cancer cell line</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 human gastric cancer cell line</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 human gastric cancer cell line</td><td>Osaka City University, Japan</td><td>N/A</td><td>Gift van Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrofiele extracellulaire traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale lavage vloeistof bemiddelen tumor celgroei en bijlage

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Geactiveerd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die kunnen vangen en microben te vernietigen. Recente studies suggereren dat de netten zijn betrokken bij verschillende ziekteprocessen, zoals auto-immune ziekte, trombose en tumor uitzaaiingen. Hier, laten we een gedetailleerde in vitro -techniek netto activiteit tijdens de vangst van gratis tumorcellen, die na gehechtheid aan netten groeien detecteren. Ten eerste, wij lage dichtheid neutrofiele granulocyten (LDN) van postoperatieve peritoneale lavage vloeistof van patiënten die onderging laparotomies verzameld. Op korte termijn kweken van LDN resulteerde in enorme netto formatie die werd gevisualiseerd met groen fluorescent nucleaire en chromosoom-counterstain. Na een incubatieperiode van Co van menselijke maagkanker cellijnen MKN45, OCUM-1 en NUGC-4 met de netten, werden vele tumorcellen opgesloten door de netten. Vervolgens de bijlage volledig werd afgeschaft door de afbraak van netten met DNase I. tijd-tijdspanne video geopenbaard dat tumorcellen gevangen door de netten niet sterven, maar in plaats daarvan krachtig groeide in een continue cultuur. Deze methoden kunnen worden toegepast op de detectie van zelfklevende interacties tussen netten en verschillende soorten cellen en materialen.

In de 2-uur-cultuur, CD66b(+) LDN afgeleid van peritoneale lavage vloeistof toonde tekenreeks structuren gekleurd met groen-fluorescerende kleurstof voor nucleaire en chromosoom (figuur 1B), terwijl CD66b(-) mononucleaire cellen niet (Figuur 1 c). Echter, wanneer de LDN culturen werden voorbehandeld met 100 U/mL DNase ik, de karakteristieke structuur was vernietigd (Figuur 1 d), die aangeeft dat zij ...

Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van neutrofielen subpopulaties in de tumorimmunologie, met name over de mechanische betrokkenheid van neutrofiel extracellulaire trappen, of NETs, bij tumormetastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de visualisatie van de adhesieve interacties van tumorcellen tot intacte NETs mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de therapie van kanker.Aangezien NETs afgeleid van specifieke neutrofil subpopulaties tumormetastase kunnen bevorderen. Het demonstreren van de procedure zal Junko Shoniohara uit ons laboratorium zijn. Om de neutrofielen te verkrijgen, infundeer eerst een liter normale steriele zoutoplossing direct voor het sluiten van de wond rechtstreeks in de buikholte van een patiënt die net een buikoperatie heeft ondergaan vanwege gastro-intestinale maligniteit en spoel de buikholte minstens een minuut lang uitgebreid.Roer vervolgens de zoutoplossing in de holte en verzamel 200 milliliter van het gespoelde vocht met vier 50-milliliter spuiten. Breng in het laboratorium het peritoneale spoelvocht over door een 100 micrometer nylonfilter in individuele 50 milliliterbuizen voor centrifugatie. Suspensieer de pellets opnieuw in 5 milliliter PBS aangevuld met 0,02% EDTA en leg elke celsuspensie voorzichtig op drie milliliter dichtheidsgradiëntoplossing.Na dichtheidsgradiëntscheiding oogst twee tot drie milliliter van de tussenlaag uit elke buis en was de peritoneale vloeistofmengsels in 10 milliliter verse PBS plus EDTA per buis. Verzamel de pellets in 10 milliliter verse PBS plus EDTA voor een extra wassing en verdun de cellen tot een eenmaal 10 tot de zevende cellen per 60 microliters van magnetisch geactiveerde celsortering, of MACS, bufferconcentratie. Blokkeer eventuele niet-specifieke binding met 20 microliter Fc-blok gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius gevolgd door de toevoeging van 20 microliter anti-CD66b magnetische kralen.Na 10 minuten bij vier graden Celsius was en suspendeer de cellen in 500 microliters MACS-buffer en voeg de cellen toe aan een geschikte magnetische kolom binnen het magnetische veld van een geschikte magnetische scheider. Wanneer alle CD66b-negatieve cellen door de kolom zijn gegaan, voeg 15 milliliter verse MACS-buffer toe aan het kolomreservoir en breng de kolom over van de magnetische scheider in een nieuwe kegelvormige buis. Dompel vervolgens onmiddellijk de kolom in om de magnetisch gelabelde CD66b-positieve in de buis te spoelen.Na centrifugatie suspendeer de geïsoleerde lage dichtheidsneutrofielen bij een vijfmaal 10 tot de zesde cellen per milliliter RPMI1640-medium aangevuld met FBS-concentratie en zaai 1 milliliter neutrofielen per putje op de zes putjes poly-L-lysine gecoate plaat. Na twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide kleurt u de cellen in elke put met een geschikte fluorescerende membraan-impermeable nucleaire en chromosomale kleurstof volgens de instructies van de fabrikant en observeert u onmiddellijk de morfologie van de NETs door middel van fluorescentiemicroscopie. Om de tumorceladhesie aan de NETs te beoordelen, suspendeer de met de contrasterende fluorescente kleurstof gekleurde maagtumorcellen bij een eenmaal 10 tot de zesde per milliliter RPMI1640 aangevuld met 0,1% bovijn serumalbumineconcentratie en voeg een milliliter tumorcellen toe aan elk putje van de lage dichtheidsneutrofilculturen.Verwijder na vijf minuten bij 37 graden Celsius het supernatant uit elk putje en was de cellen voorzichtig twee keer met 2 milliliter voorverwarmd RPMI1640-medium aangevuld met BSA per wassing. Een vijf minuten durende incubatie is lang genoeg voor het detecteren van NET-specifieke binding. Voeg het verwarmde medium langzaam toe aan de zijkant van elk putje, draai voorzichtig de plaat en verwijder het supernatant met een afzuiger.De NETs en de aangehechte tumorcellen kunnen vervolgens worden waargenomen door middel van fluorescentiemicroscopie. Voor een time-lapse videoanalyse van de gevangen tumorcellencultuur en kleur de peritoneale lage dichtheidsneutrofielen in een 35 millimeter schaal, poly-L-lysine gecoate schaal, zoals aangetoond gevolgd door een korte wassing in twee milliliter 0,1% BSA plus RPMI1640. Vervang het medium door een eenmaal 10 tot de zesde ongekleurde maagtumorcellen opgehangen in twee milliliter RPMI aangevuld met BSA voor een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie spoelt u de cellen in twee milliliter vers RPMI aangevuld met BSA gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur gevolgd door voorzichtig draaien om eventuele niet-bevestigde tumorcellen te verwijderen. Vervang vervolgens het supernatant door DMEM aangevuld met FBS en antibiotica en monteer de schaal in een geheel beeldcelobservatiesysteem voor time-lapse analyse van tumorcelvangst door de NETs. Na twee uur cultiveren vertonen CD66b-positieve lage dichtheidsneutrofielen afkomstig van peritoneal spoelvocht stringstructuren door groen fluorescerende nucleaire en chromosomale kleuring, terwijl CD66b-negatieve mononucleaire cellen dat niet doen.Wanneer de lage dichtheidsneutrofilculturen worden voorbehandeld met 100 eenheden per milliliter DNAse I, worden de karakteristieke structuren echter vernietigd, wat aangeeft dat de structuren zijn samengesteld uit extracellulair DNA dat uit de neutrofielen is uitgestoten. Wanneer de lage dichtheidsneutrofielen worden gekweekt op ongecoate plastic platen, kunnen veel NET-clusters worden waargenomen die zweven in het medium met weinig NETs die aan de bodem van de schaal zijn bevestigd. Na vijf minuten incubatie met een fluorescent gelabelde maagtumorcellijn hechten veel tumorcellen zich aan de neutrofielen binnen de NETs, een fenomeen dat niet wordt waargenomen na voorbehandeling met DNAse I. Soortgelijke adhesiepatronen worden ook gezien voor andere tumorcellen.OKUM-1 en NUGC-4. Interessant is dat terwijl de NETs geleidelijk verdwijnen binnen enkele uren van verlengde tumorcelco-cultuur, beginnen de door de NETs gevangen tumorcellen krachtig te prolifereren na NET-vrijlating. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat omdat de NETs zwak aan de plaat plakken, de was

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

In this video, we describe the procedure for isolating low-density neutrophils, or LDNs, from the peritoneal lavage fluid of a postoperative human patient. The LDNs thus obtained can be used in further downstream experiments to understand their role in tumor growth and progression.

Peritoneal Low-density Neutrophil Isolation: A Technique to Obtain Low-density Neutrophils from Peritoneal Lavage Fluid Using Magnetic Activated Cell Sorting

This video demonstrates the fluorescent staining of neutrophil extracellular traps (NETs), the extracellular DNA components expelled by neutrophils. This technique enables the visualization of adhesive interaction between cancer cells and NETs.

Fluorescence Microscopy of Neutrophil Extracellular Traps or NETs: A Technique to Observe Adhesive Interaction Between Cancer Cells and NETs

In this video, we analyze the post-adhesion behavior of cancer cells trapped in neutrophil extracellular traps (NETs) by co-culturing low-density neutrophils and gastric cancer cells. The time-lapse video analysis helps monitor various cellular events and study the role of NETs in pathological conditions.

Time-lapse Fluorescence Microscopy of Neutrophil Extracellular Traps or NETs: A Technique to Analyze Post-adhesion Interaction between Cancer Cells and NETs

This video demonstrates an in vitro technique to generate and isolate neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils are isolated from peripheral blood and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) to produce NETs. During incubation, the neutrophils undergo a process of cell death (NETosis) to release NETs comprising decondensed chromatin mixed with granular cytoplasmic proteins.

An In Vitro Technique to Generate Human Neutrophil Extracellular Traps

In this video, we demonstrate an assay utilizing fluorescence microscopy to detect the adhesion of cancer cells to neutrophil extracellular traps (NETs). In the test wells, there is a notable increase in the number of fluorescently labeled cancer cells adhering to NETs, whereas wells treated with DNase exhibit reduced cancer cell adhesion to NETs.

In Vitro Adhesion Assay to Detect the Adherence of Cancer Cells to Neutrophil Extracellular Traps

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Er wordt een reeks methoden beschreven, waaronder de isolatie van lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) uit menselijk plasma, differentiatie van HL-60-cellen in neutrofielenachtige cellen, bereiding van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in aanwezigheid van LDL, en stimulatie van menselijke aorta-endotheelcellen met een mengsel van NET en LDL.

Stimulatie van vasculaire endotheelcellen met behulp van neutrofiele extracellulaire vallen in aanwezigheid van lipoproteïne met lage dichtheid

Leer hoe je lage-dichtheid neutrofielen isoleert uit peritoneale spoelvloeistof om NET-vorming en tumorcelbinding te visualiseren. Deze methode onthult mechanismen van tumorimmunologie en metastase.

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage (Video) | JoVE Journal

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Meer video's verkennen