Name: Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer een gevoelige en kosteneffectieve methode om Hepatitis B-virus DNA-integratie in gastheer-genomen te detecteren en te kwantificeren. Dit protocol maakt enkele-kopie detectie en enkele-basenpaar resolutie van virus-gastheer DNA-juncties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk ontvangen financiering uit het Duitse centrum voor infectie onderzoek (DZIF), TTU Hepatitis projecten 5.807 en 5.704, de TRR179 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (15 TP), en de Australian Centre voor HIV en Hepatitis Virologie onderzoek.
Wij zijn Professor William Mason dank verschuldigd voor zijn aandeel in de ontwikkeling van de oorspronkelijke methode van de invPCR en het demonstreren aan ons. We zouden graag bedanken Drs. Yi Ni en Florian A. Lempp voor reagentia (cellijnen en HBV entmateriaal). Wij erkennen Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt en Dr. Katrin Schöneweis voor technische bijstand. Wij zijn dankbaar aan Miriam Kleinig voor proeflezen, en professoren Nicholas Shackel en Ralf Bartenschlager voor continue ondersteuning.

1. cel infectie en DNA-extractie
<ol><li>Handhaven van gekweekte Huh7-NTCP cellen8,9 in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v foetale runderserum, 1 x penicilline/streptomycine, en 2 mM L-glutamine. Opmerking: Dit is eerder gemeld in detail40.</li>
	<li>Zaad 2 x 105 cellen/mL Huh7-NTCP cellen in een 12-well plaat met 1 mL DMEM.</li>
	<li>Als cel behandelingen (bijvoorbeeld HBV-remmers) wilt testen, toepassen op de cultuur supernatant 4 h na het zaaien (1 dag vóór de HBV-infectie). Voor een negatieve controle, gelden 200 nM Myrcludex B (een potente HBV vermelding remmer41).</li>
	<li>Heparine-kolom gezuiverd42 supernatant van HepAD3843 te gebruiken als een entmateriaal te infecteren cellen bij 1.000 VGE/cel in 500 µL van voedingsbodems (DMEM aangevuld met 10% (v/v): foetale runderserum, 1 x 2 mM L-glutamine, penicilline/streptomycine en 2,5% v/v DMSO), bevattende 4% w/v polyethyleenglycol 8000 [opgelost in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)].</li>
	<li>Cultuur van de cellen in een incubator van de 37 ° C (vastgesteld op 5% CO2 en 90% vochtigheid).</li>
	<li>Wassen van de cellen tweemaal met 1 mL steriele 1 x PBS op 16 – 24 h na infectie.</li>
	<li>Vervang de voedingsbodems elke 2 dagen na HBV-infectie tot oogst.</li>
	<li>Op dag 3 na infectie, behandelen de cellen met 5 µM Tenofovir disoproxil en 10 µM Lamivudine te beperken van de productie van HBV Dr. tussenproducten die amplifiable door invPCR.</li>
	<li>Op dag 5 na infectie, trypsinize van de cellen met 200 µL trypsine-EDTA en resuspendeer hen in 2 mL zuiver DMEM (aangevuld met 10% (v/v): foetale runderserum, 1 x penicilline/streptomycine, en 2 mM L-glutamine), ook met 5 µM Tenofovir disoproxil en 10 µM Lamivudine.</li>
	<li>De cel schorsingen overbrengen in een 6-well plaat voor het opwekken van een ronde van de mitose (die is gemeld voor het opwekken van verlies van HBV cccDNA44 en andere tussenproducten van HBV-DNA die amplifiable door invPCR).</li>
	<li>Op dag 7 na infectie, trypsinize de uitgebreide cellen in 400 µL trypsine-EDTA en resuspendeer de mengsel in 1 mL DMEM. Plaats de schorsing in een tube van 1,5 mL pellet de cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min en verwijder de bovendrijvende vloeistof door aspiratie.</li>
	<li>(Optioneel) De cel-pellets op-20 ° C worden opgeslagen totdat ze klaar voor DNA-extractie zijn.</li>
	<li>Pak het DNA uit de pellet van de cel met behulp van een DNA-extractie-kit, volgens de instructies van de fabrikant. De eindconcentratie van DNA met behulp van optische densitometrie schatten. Opmerking: De opbrengst van het DNA in een 100 μl elutievolume is over het algemeen ~ 250-400 ng/μL.</li>
</ol>2. de inversie van DNA
<ol><li>Aliquot ~1.5–2.5 μg van het totale DNA halen uit stap 1 in een 200 μl PCR buis. Voeg de juiste hoeveelheid restrictie-enzym meester-mix resulteren in een 40 μL reactie volume met 1 x digest reactie buffer (bv., CutSmart buffer) en 10 U Ncoik-HF.</li>
	<li>Meng de reacties en de spin naar beneden in een klein buisje centrifuge. Incubeer de restrictie-enzym-reactie in een PCR machine bij 37 ° C gedurende 1 uur voor optimale spijsvertering-efficiëntie.</li>
	<li>Inactivering van het beperkingsenzym door broeden bij 80 ° C gedurende 20 min.</li>
	<li>Overdracht van de gehele restrictie-enzym-reactie op een 1,5 mL-buis. Voeg 400 l 1 x T4 DNA ligase buffer en 500 U van T4 DNA ligase en meng het. Het volume van de grote reactie moedigt intra moleculaire (in tegenstelling tot onderling moleculaire) Afbinding van de verteerd DNA-fragmenten.</li>
	<li>Incubeer de afbinding reactie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om ervoor te zorgen volledige afbinding.</li>
	<li>Inactivering van de T4 DNA-ligase bij 70 ° C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Voeg toe 10 μL van 10% w/v natrium dodecyl sulfaat om ervoor te zorgen volledige inactivering van de T4 ligase.</li>
	<li>Meng de buizen door pulse vortexing en kort spin down de reactie mix. NaCl met een eindconcentratie van 100 mM en dextran (35 – 45 kDa) toevoegt aan een eindconcentratie van 90 µg/mL. Meng de buizen door pulse vortexing en kort spin down de reactie mix.</li>
	<li>Voeg 900 l 100% ethanol en meng door inversie. Neerslag het DNA bij-20 ° C's nachts.</li>
	<li>Pellet geprecipiteerde DNA door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant door aspiratie met een pipet P200. Het wassen van de pellet met 500 μL van 70% v/v ethanol en centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verwijder de ethanol door aspiratie met een pipet P200. De DNA-pellet bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten drogen.</li>
	<li>Los van de pellet in 20 μL van H2O. toevoegen 20 μL van een restrictie-enzym meester-mix resulteren in een 40 μL reactie volume met 1 x digest reactie buffer, 5 U van BsiHKAI en 5 U van Sph-HF. Incubate de restrictie-enzym-reactie in een Heat-blok bij 37 ° C (de optimale temperatuur voor SphHF) gedurende 1 uur.</li>
	<li>Kort spin down de reactie mix. Incubeer de restrictie-enzym-reactie in een warmte-blok bij 65 ° C (de optimale temperatuur voor BsiHKAI) gedurende 1 h.</li>
	<li>Kort spin down de reactie mix.</li>
	<li>Het omgekeerde DNA bij-20 ° C bewaren tot de volgende stap.</li>
</ol>3. genestelde PCR
<ol><li>Verwijderen van potentiële waarbij van een herbruikbare siliconen mat seal met behulp van een oplossing van DNA afbraak, spoel de mat grondig met DNA-gratis water en het drogen bij kamertemperatuur tijdens de voorbereiding van het PCR-mengsel.</li>
	<li>Bereiden 1 mL van een 1 x PCR mix met de buitenste vooruit (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') en omgekeerde (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') inleidingen bij een concentratie van 0,5 µM.</li>
	<li>Voeg toe 170 μL van de 1 x PCR mix aan putjes A1 en E1 in een 96-Wells PCR plaat.</li>
	<li>Voeg toe 120 μL van de 1 x PCR mix aan putjes B1 tot en met H1.</li>
	<li>Voeg toe 10 μL van de omgekeerde DNA uit stap 2 aan putjes A1 en E1 (2 verschillende omgekeerde monsters kunnen worden geanalyseerd op de dezelfde PCR-plaat). Mix de reactie in elk putje door zachtjes pipetteren elk ongeveer 10 keer met behulp van een ingesteld op 100 μl P1000.</li>
	<li>Serieel verdunde monsters van wells A1 tot D1 bij een verhouding van 1:3 door de overdracht van 60 μL bij elke stap. Meng de putten bij elke stap waarbij ze zachtjes over het 10 keer gebruik van een ingesteld op 100 μl P1000. Vermijd vormen van bubbels. Herhaal stap 3.6 voor goed E1, verdunnen tot goed H1.</li>
	<li>Aliquot 10 μl van het reactiemengsel met een meerkanaals-Pipet uit putten A1-H1 in putten A2-H2, A3-H3, enzovoort tot het bereiken van putjes A12-H12 van de 96-wells-plaat. De PCR afdekplaat met de droge silicon mat uit stap 3.1, stevig op te drukken.</li>
	<li>Plaats de plaat in een PCR-machine en voer het volgende programma: 10 min bij 95 ° C; 35 cycli van 15 bij 95 ° C, 15 s s op 54 ° C en 3 min bij 72 ° C; 7 min bij 72 ° C; Houd vervolgens, de plaat bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwarm de pinnen voor een 96-pin-replicator aan gloeiende met een bunsenbrander en vervolgens afkoelen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vul de putten van een tweede PCR-plaat met 10 μL van 1 x PCR mix (met een gel belasting-klaar buffer) en de innerlijke vooruit (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') en omgekeerde (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') op 0.5 µM.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de siliconen mat van de PCR-plaat van de 96-wells-plaat uit de eerste ronde PCR, en het voorkomen van kruisbesmetting tussen putten.</li>
	<li>Gebruik de afgekoelde replicator de PCR producten van de 96-wells-plaat van de eerste ronde PCR overbrengen naar de nieuw-aliquoted 96-wells-plaat. Verrichten de genestelde PCR met behulp van dezelfde voorwaarden als in stap 3.8, met uitzondering van de eerste denaturatie stap bij 95 ° C van 10 min omzetten in 2 min.</li>
</ol>4. PCR Product isolatie en Gel extractie
<ol><li>Analyseer de PCR producten door gelelektroforese een 96-Wells met 1,3% w/v agarose gel. Voor een 100 mL agarose gel, uitgevoerd bij 200 V voor 10-15 min.</li>
	<li>De DNA-bands uit de agarose gels wegwerp drinken rietjes met accijnzen. Voor elke PCR-product, plaatst u het stro en agarose gel sluit aan op een 1,5 mL-buis en het stro op maat knippen met een schaar. Opmerking: Het is voldoende om te isoleren van de bands alleen uit deze verdunningen waarin één PCR producten kunnen worden opgelost.</li>
	<li>(Optioneel) Bewaar de buizen bij-20 ° C voor later extractie.</li>
	<li>Werpen de agarose stekkers in elke buis door knijpen op het uiteinde van het stro fragment. 300 μL van gel extractie buffer en 5 μL van gel extractie glazen kraal drijfmest toevoegen aan elke buis.</li>
	<li>Pak de PCR producten volgens de instructies van de fabrikant voor de gel extractie kit (met uitzondering van half-volumes gebruiken voor het wassen van stappen) en elueer de DNA van de kralen met 30 μL van water.</li>
	<li>Indienen van het gezuiverde DNA voor Sanger sequencing (volgens de instructies van de leverancier) met de voorwaartse primer gebruikt in de tweede-ronde genest PCR.</li>
</ol>5. de sequentieanalyse
<ol><li>Virus-cel DNA kruispunten bevestigen door het uitvoeren van de nucleotide BLAST analyse (met behulp van standaardinstellingen uitlijnen aan de gehele nucleotide-collectie). Opmerking: Representatieve resultaten worden gedetailleerd beschreven in Figuur 3 hieronder.<ol>
<li>Als slechts gedeeltelijke aanpassing van de sequentie wordt waargenomen, trim de 5' HBV-DNA-sequentie voordat opnieuw een BLAST analyse worden uitgevoerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Strenge selectiecriteria om te bepalen of een bepaalde reeks een echte integratie junction als volgt aangeeft van toepassing:<ol>
<li>Bevatten alleen sequenties met > 20 bp voor een cellulaire sequence voor vertrouwen toewijzen aan het cellulaire genoom.</li>
		<li>Negeer alle sequenties die beperkingsplaatsen van elke enzymen gebruikt binnen 10 bp van de vermeende virus-cel integratie junction, als zij waarschijnlijk vertegenwoordigen in vitro afbinding gebeurtenissen in plaats van echte integratie kruispunten bevatten.</li>
		<li>Negeren alle sequenties met duidelijk ongelijke fluorescentie pieken aan weerszijden van de kruising van de vermeende integratie in sequencing chromatografen, zoals deze waarschijnlijk artefacten gegenereerd door kruisbesmetting tijdens de sequencing-reactie zijn of capillaire chromatografie.</li>
		<li>Unieke integratie gebeurtenissen definiëren als die met de exacte HBV en cellulaire sequenties op de kruising van de virus-cel. Opmerking: Herhaling van unieke integratie gebeurtenissen kan voortvloeien uit de klonale uitbreiding van cellen met deze integraties of kruisbesmetting tijdens de PCR (die kan worden getest met behulp van negatieve-control reacties, verder uitgewerkt in de representatieve resultaten Zie hieronder). Herhaalde integraties in specifieke cellulaire opeenvolgingen naar verwachting weer verschillende HBV terminal sites voor elke integratie, zoals niet-homologe einde-toetreding trajecten gebruikte15 zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereken de frequentie van de integratie door te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van omgekeerde DNA sjablonen door het aantal virus-cel kruispunten gedetecteerd bij die verdunning, gevolgd door normalisatie tot het bedrag van de totale input van het DNA in de inversie-reactie. In het algemeen, de frequentie van de integratie op de orde van 1:10 is4 cellen.</li>
</ol>

Vinden is een mede-aanvrager en de mede-uitvinder van octrooien bescherming van Myrcludex B als een HBV/HDV-post-remmer. T.T. verklaart geen belangenconflicten.

Voordat u het protocol uitvoert, is het belangrijk op te merken dat deze invPCR-test een zeer gevoelige techniek, geschikt is voor losse exemplaren van DNA sjabloon frequentiebanden te versterken. Beperking van de verontreiniging van PCR producten daarom van het allergrootste belang. Algemene strategieën te beperken van PCR product verontreiniging omvatten de volgende. (i) stellen fysiek gescheiden gebieden voor de verschillende stappen van de methode. Elk gebied moeten afzonderlijke labjassen en handschoenen moeten worden gewijzigd tijdens het verplaatsen tussen deze gebieden. Wij gemaakt bben deze gebieden hieronder in volgorde van meest tot minst waarschijnlijk besmet: PCR product extractie en sequencing reactie set-up gebied (post-PCR); PCR sjabloon toevoeging en gevlamd-pins overdracht gebied (we hebben PCR afzuigkappen met een decontaminating UV-lamp met goede resultaten gebruikt); DNA-extractie en inversie gebied (pre-PCR); en een "DNA sjabloon-vrije" ruimte gebruikt uitsluitend voor het voorbereiden van de voorraad en PCR oplossingen. (ii) worden zich bewust van de luchtstroom in het lab als een potentiële bestuurder van kruisbesmetting. Met name kruisbesmetting van PCR reacties tijdens de stap van de overdracht gevlamd pin hoogstwaarschijnlijk te laten plaatsvinden en zal leiden tot onjuiste kwantificering van integratie frequentie. PCR kappen kunnen worden gebruikt om te beperken deze cross-stromingen. Negatieve controle putten (bijvoorbeeld Myrcludex-B-behandelde monsters of geen sjabloon besturingselementen) in de PCR kunnen ook worden gebruikt om te testen voor kruisbesmetting. (iii) het beperken van potentiële verontreinigingen van de PCR op pipetten en oppervlakken werken door regelmatig vegen ze neer met een DNA-afbraak-oplossing.
Het protocol is opgegeven hier gerangschikt te sporen van de integratie van een bekende besmettelijke HBV kloon gegenereerd op basis van de HepAD38 cel lijn42. Indien het entmateriaal gebruikt een verschillende HBV-DNA-sequentie (bijvoorbeeld van patiënten serum), moet vervolgens het HBV genoom worden eerst sequenced Controleer de compatibiliteit van PCR inleidingen en inversie design. In eerder gepubliceerde studies19, hebben we 3 reeksen inleidingen die binden geconserveerde HBV-DNA-sequenties flankerend de verwachte site van HBV DNA integratie kruispunten gebruikt. Andere primer sequenties en protocollen zijn beschreven om te bepalen van de genomic opeenvolging van HBV44,45,46,47,48 en met succes kunnen functioneren.
Bovendien kunnen verschillende HBV-gevoelige cellen (bijvoorbeeld primaire menselijke hepatocyten, gedifferentieerde HepaRG, HepG2-NTCP cellen) worden gebruikt; we hebben echter gevonden dat cellen van de Huh7-NTCP de grootste signal-to-noise verhouding, bieden wanneer gezien het aantal virus-cel DNA kruispunten die worden versterkt ten opzichte van het virus tussenliggende DNA dat versterkte13is. In het bijzonder, ondergaan terminaal gedifferentieerde cellen zoals primaire menselijke hepatocyten of gedifferentieerde HepaRG geen efficiënt mitose, wat resulteert in een hoog niveau van amplifiable HBV DNA Dr. tussenproducten resterende binnen de cellen. We hebben gevonden dat ~ 90% van de versterkte sequenties vertegenwoordigen HBV DNA herschikkingen (en niet integratie evenementen) in terminaal-gesplitste cellen, ten opzichte van 70-50% in hepatoma cel lijnen13. Deze producten zijn over het algemeen HBV-DNA-genoom met grote verwijderingen in het oppervlak en de kern open frames lezen, of ze kunnen vertegenwoordigen HBV quasi-soorten met een extra Ncoik voorafgaand aan de Sphik site site. De versterking van deze HBV-soorten (met inbegrip van een schematisch diagram) zijn beschreven in detail eerder13.
Er zijn verschillende nadelen aan deze methode. Vanwege de moeizame en Meerdaags aard van dit protocol, is invPCR niet geschikt voor high-throughput analyses van een groot aantal monsters. Bovendien, als het gebaseerd is op beperking van verdunning titratie, onze methode is niet zeer nauwkeurige in kwantificering; Hoewel, het moet gemakkelijk meten Logniveau veranderingen in de frequentie van de integratie.
Bovendien, onze inversie-protocol alleen geschikt is om te detecteren integraties tussen de DR2 en DR1 regio van het genoom van HBV, zoals de meerderheid van de HBV integraties binnen deze regio49 plaatsvinden. NGS analyse van HBV geduldige weefsels is gebleken dat een grote minderheid (tot ~ 50%) kan zich ook voordoen buiten deze regio49. Nieuwe invPCR ontwerpen zijn theoretisch kundig voor speurder dit andere sites van integratie, hoewel ze niet (aan onze kennis) zijn nog uitgevoerd. Relatedly, als gevolg van de nodige restrictie-enzym sites vereist stroomafwaarts van de volgorde van de virus-cel kruising voor de inversie reactie, invPCR detecteert niet alle integraties die zich voordoen binnen de DR2 en DR1 regio's van de HBV-genoom (dat wil zeggen, wij hebben naar schatting ~ 10% van alle integraties aantoonbaar met behulp van in silico simulaties13). Echter, wanneer toegepast op een gericht aantal monsters met een klein aantal verschillende behandelingen, invPCR is een van de enige praktische methoden voor het opsporen van geïntegreerde HBV-DNA in een enkele basenpaar resolutie.
Wij daarom voorzien toepassingen van deze methode dienen een belangrijke rol bij het vinden van virale (via mutaties van de HBV entmateriaal), cellulaire (via knock-out of overexpressie van specifieke cellulaire genen, of door toepassing van verschillende drugs) en milieu ( bijvoorbeeld blootstelling aan oxidatieve stress) factoren die HBV DNA integratie veroorzaken. Met deze methode en de nieuw ontwikkelde systemen van HBV-infectie kunnen we ongekende beheersing van deze factoren zodat kunnen zij goed geïsoleerd en beter gekarakteriseerd. Wij verwachten ook dat dit tot een belangrijke begrip van de cellulaire gevolgen van HBV-DNA-integratie leiden zal, met inbegrip van welke mate virale antigenen (bijvoorbeeld HBx of HBsAg50) van de geïntegreerde vorm, wat regelt deze expressie, worden uitgedrukt en al dan niet HBV integratie aanzienlijk verandert het cellulaire fenotype tot een meer pro-oncogene staat. De resultaten van deze toekomstige studies zal een diepgaande invloed hebben op het therapeutische strategieën gebruikt voor de behandeling van chronische hepatitis B en de basiskennis van het virus zelf.

HBV is een double-stranded DNA-virus dat kan leiden tot levenslang chronische infectie, leidt tot levercirrose en hepatocellulaire carcinoom (HCC)1,2,3. Hoewel er meerdere moleculaire mechanismen rijden HBV persistentie4 (bijvoorbeeld hoge stabiliteit van de epigenetische virale transcriptionele sjabloon), ontduiking van immuun toezicht, en lage omzet van hepatocyten in de lever en de bijbehorende risico van HCC Inleiding5,6 (bijvoorbeeld chronische ontsteking en activering van cellulaire benadrukken trajecten), HBV DNA integratie in het ontvangende cel genoom (een gerapporteerde mechanisme voor beide van deze verschijnselen) slecht is onderzocht . Een belangrijke reden is het gebrek aan geschikte in vitro infectie systemen voor HBV waarmee betrouwbare detectie van integratie evenementen. Hier beschrijven we een onlangs ontwikkelde protocol voor zowel in vitro generatie en opsporing van HBV-DNA-integraties die kan worden gebruikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en de gevolgen daarvan.
HBV-replicatie en de vorming van HBV DNA integratie heeft eerder onderzocht in detail7. Kort, HBV treedt hepatocyten met behulp van het natrium Taurocholate Co-transporting Peptide (NTCP) als de belangrijkste cellulaire receptor voor infectie8,9. De HBV nucleocapsids het HBV-ontspannen circulaire DNA (rcDNA) met treedt genoom de kern, waar het rcDNA wordt omgezet in episomal covalent gesloten circulaire DNA (cccDNA). De nucleaire cccDNA fungeert als de transcriptionele sjabloon voor virale mRNAs en vooraf genomic RNA (pgRNA)10. HBV polymerase en pgRNA worden vervolgens verpakt in de nieuw gevormde nucleocapsids (opgebouwd uit HBV kern eiwit Dimeren). HBV pgRNA is omgekeerde-getranscribeerd binnen de nucleocapside, resulterend in het genoom van een rcDNA of een double-stranded lineaire DNA (dslDNA) genoom11,12. Deze volwassen nucleocapsids met HBV-DNA-genoom zijn definitief gehuld en geëxporteerd als virionen.
Infectie van hepatocyten door omhuld deeltjes met dslDNA moleculen kan resulteren in virale integratie in de ontvangende cel genoom13, wat leidt tot replicatie-incompetente vormen van HBV DNA7,14,15. HBV-DNA integratie vindt plaats op de site van chromosomale double-stranded DNA-einden15. Vergaren van bewijs suggereert dat elke gebeurtenis integratie in een in wezen willekeurige positie binnen de ontvangende cel genoom16,17. Daarnaast treedt HBV DNA integratie op enigszins zelden, tegen een koers van 1 per 104 cellen13,18,19,20. Belangrijke vragen met betrekking tot de integratie van het HBV DNA onbeantwoord, met name wat betreft de exacte moleculaire pathways betrokken, de afhankelijkheid van virale en gastheer factoren, de virale antigenen uitgedrukt van geïntegreerde vormen, en hun mogelijke bijdrage naar virale persistentie7. We hebben een in vitro model opgezet licht werpen op enkele van deze vragen.
De zeldzaamheid van HBV DNA integratie evenementen (zowel met betrekking tot integratie tarief per cel en het aantal van de kopie van elke unieke integratie) in in vitro HBV-infectie modellen maken hen uitdagend te detecteren. Cel mitose wordt beperkt in ons systeem in vitro als scheidslijn cellen geen efficiënte infectie ondersteunen. Dus, in tegenstelling tot in patiënt lever weefsels waar aanzienlijke klonale uitbreiding van hepatocyten18,19,plaatsvindt20, zeer dat weinig (1 tot 2) exemplaren van elke integratie aanwezig zijn in een bepaalde pool van cellen besmet in vitro . We hebben ook geconstateerd dat de integratie voornamelijk tijdens de eerste infectie van hepatocyten (en niet voortdurend in hepatocyten chronisch geïnfecteerd)13 optreedt. Dienovereenkomstig, HBV-DNA-integratie kan niet worden verhoogd door de cellen gewoon te kweken voor een langere periode.
In het algemeen, vlek eerder methoden voor het detecteren van geïntegreerde HBV-DNA, met inbegrip van zuidelijke hybridisatie21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , cassette-gemedieerde afbinding PCR28en hele genoom sequencing29,30,31,32,33, hebben niet de gevoeligheid om te detecteren single-kopieën van de integraties. Wij en andere onderzoekers hebben gebruikt inverse genest PCR (invPCR) voor het detecteren van hepadnaviral DNA integratie in eend, marmot en menselijke besmette levers13,14,18,19, 34,35,,36. Andere hebben procedurele wijzigingen aan de invPCR-techniek die kunnen veranderen van de generatie van vals-positieve signalen en beperken de mogelijkheid voor kwantificering37ingevoerd. Als de bepaling wordt uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol, vertegenwoordigt invPCR een specifieke en gevoelige test die identificeert en kwantificeert (in absolute moleculen) meerdere HBV DNA integraties. De kruising van de HBV-cel DNA is sequenced met een single-basenpaar resolutie, waardoor bioinformatical studies van virale en gastheer-DNA sequenties op de sites van integratie13.
Wij hebben eerder beschreven38 resultaten uit invPCR op DNA van HBV-geïnfecteerde weefsel geëxtraheerd uit een groot aantal bronnen, inclusief de module-bevroren lever weefsels, lever secties paraffine-ingebedde en uiterst kleine weefselsteekproeven geïsoleerd door Laser-microdissection19. Dit protocol beschrijft een bijgewerkte versie van een bepaling van de invPCR gebruikend DNA geëxtraheerd uit cel cultuur afkomstige weefsels na besmetting in vitro , in die laag kopie aantallen integraties (1 – 2 kopieën per integratie) worden gegenereerd. De HBV DNA integraties gevormd in vitro lijken op die gevonden in de weefsels van de patiënt met betrekking tot de verdeling ervan over de cellulaire genoom en de kruising binnen de virale volgorde die is geïntegreerde13,16, hetgeen wijst op een vergelijkbare weg naar binnen een besmette lever.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Voor gebruik verwarmen om te inactiveren</td></tr><tr><td>Penicillin, 10.000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100&times;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,5 mg/mL; EDTA, 0,22 mg/mL, 1&times;</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td>Bewaar op 40% w/v in 1xPBS, autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>DMSO voor spectroscopie</td><td>Merck</td><td>102950</td><td></td></tr><tr><td>Tenofovir disoproxil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS021622</td><td>Oplossen in DMSO</td></tr><tr><td>Lamivudine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1295</td><td>Oplossen in DMSO</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.250</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>Dextran (35-45 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1662-10G</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>BsiHKAI</td><td>NEB</td><td>R0570L</td><td></td></tr><tr><td>SphI-HF</td><td>NEB</td><td>R3182L</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold Taq kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331816</td><td>Gebruik voor eerste nest PCR</td></tr><tr><td>Silicon sealing Mats voor 96-Well PCR Plates</td><td>Biorad</td><td>2239442</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6509 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>96-pin replicator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi PCR kit</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>Gebruik voor tweede nest PCR, gebruik groene buffer voor gemakkelijk laden van agarosegel</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal dna gevormd door in vitro hepatitis b-infectie

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B-Virus (HBV) is een gemeenschappelijk bloed overdraagbare pathogeen leverkanker en levercirrose ten gevolge van chronische infectie veroorzaken. Het virus repliceert in het algemeen door middel van een episomal DNA tussenliggende; echter, integratie van HBV-DNA-fragmenten in het genoom van de host geconstateerd, hoewel dit formulier niet nodig voor virale replicatie is. Het exacte doel, de timing en de mechanism(s) door welke HBV-DNA integratie plaatsvindt is nog niet duidelijk, maar recente gegevens blijkt dat het heel vroeg na de infectie plaatsvindt. Hier, worden het in vitro generatie en opsporen van HBV DNA integraties in detail beschreven. Ons protocol specifiek losse exemplaren van virus-cel DNA integraties versterkt en zowel absolute kwantificering en single-basenpaar resolutie van de junction-reeks. Deze techniek is vereffend met verschillende HBV-gevoelige celtypes (inclusief primaire menselijke hepatocyten), diverse HBV mutanten, en in combinatie met verschillende belichtingen van de drug. Wij voorzien deze techniek steeds een cruciale test om te bepalen van de moleculaire mechanismen van dit klinisch relevante fenomeen.

Een schematische weergave van de invPCR-techniek is afgebeeld in Figuur 1. Een voorbeeld van een succesvolle invPCR aan de agarose gelelektroforese is afgebeeld in Figuur 2 vóór en na het PCR product isolement. Figuur 3 toont de output analyse BLAST vanaf stap 5.1 in de gevallen van (i) versterking van virus-cel DNA junction en (ii) versterking van Dr. tussenstof HBV DNA.
Verwachte resultaten van positieve controle: Huh7-NTCP-cellen geïnfecteerd met heparine-gezuiverd HBV voorraden zoals beschreven hierboven (Figuur 1) kunnen dienen als positieve controle. In dit geval moeten één PCR producten worden bereikt door de tweede of derde 1:3-verdunning van elk monster (overeenkomend met ~ 104 cel equivalenten per verdunning, Figuur 2). In deze verdunningen vertegenwoordigt ongeveer 50% van de producten waar virus-cel DNA kruispunten, terwijl de andere helft versterking van HBV DNA tussenproducten (Figuur 3 vertegenwoordigt).
In vorige studies13, hebben we enkele exemplaren van herhaalde virus-cel kruispunten, suggereren geen cellulaire genomic sites van preferentiële integratie van HBV-DNA gevonden. Ook vinden we dat 80% van de >van virus-cel kruispunten tussen nucleotiden 1732 en 1832 (volgens de nucleotide nummering van HBV genotype D, GenBank toetreding #U95551.1) optreden, waarbij de laatste staat voor de rechter eindpunt van het HBV dslDNA formulier. Sequenties van ware virus-cel kruispunten gevonden door onze methode in in vitro experimenten zijn openbaar-beschikbaar op GenBank (toetreding getallen MH057851 naar MH058006).
Verwachte resultaten van negatieve controles: niet-geïnfecteerde cellen van de Huh7-NTCP of Huh7-NTCP geënt vooraf behandeld met Myrcludex B cellen kunnen fungeren als negatieve controles. InvPCR analyse van DNA geëxtraheerd uit deze cellen moet geen PCR producten produceren. Deze negatieve controlemonsters waarop de dezelfde PCR plaat als positieve monsters zorgt voor het testen van kruisbesmetting tijdens het genest-PCR. De meest strenge test voor kruisbesmetting is het uitvoeren van een negatief-controlemonster in putten A-D en de positief monster in putten E-H op een 96-wells-plaat. In dit geval wordt de meest geconcentreerde verdunning van de positief monster uitgevoerd in een rij direct aan de minst geconcentreerde verdunning van het negatief monster. Als versterking producten worden waargenomen in negatieve controlemonsters, Instituut de maatregelen die zijn voorgesteld in de discussie om te minimaliseren van kruisbesmetting gebeurtenissen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Figuur 1: Schematische afbeelding van het invPCR-proces te detecteren HBV DNA integraties. Nadat HBV-infectie, slechts een minderheid van Huh7-NTCP cellen bevatten HBV dslDNA (rood) geïntegreerd in het ontvangende cel genoom (rood), afgebeeld in het bovenste gedeelte. Vervolgens is totale DNA geëxtraheerd uit de cellen (stap 1), omgekeerd (stap 2) en versterkt door genestelde PCR (stap 3). Getoond worden de relatieve posities van de restrictie-enzym-sites (Ncoik en BsiHKAI) van het kruispunt dat verwijderde virus-cel DNA. De figuur wordt aangepast van een eerdere publicatie13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Figuur 2: Agarose gel elektroforese en latere gel extractie van een succesvolle invPCR. "M" vertegenwoordigt DNA marker ladder. Elke rij van 12 geeft technische wordt gerepliceerd in een enkele verdunning op de PCR-plaat. Twee omgekeerde DNA-monsters kunnen worden uitgevoerd per PCR plaat/agarose gel. De PCR-producten voor elke verdunning moeten Titreer uit in een ~ 1:3 verhouding. Extractie van de producten van de twee minst geconcentreerde verdunningen waar enkele bands gemakkelijk geïsoleerd worden kunnen is over het algemeen voldoende, zoals HBV DNA integratie wordt bepaald door titratie van het eindpunt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Figuur 3: BLAST analyse van invPCR product sequenties. Zoals lange stukken volgorde worden gegenereerd vanuit Sanger sequencing, de bron van DNA-sequenties in het algemeen ondubbelzinnig is. Sterke aanpassing aan HBV en cellulaire genomen in verschillende gebieden van het FASTA reeks bestand gegenereerd op basis van Sanger wordt waargenomen in het bovenste netdeel, suggereren een kruispunt waar virus-cel DNA sequencing. In het onderste paneel lijnt de volgorde alleen naar fragmenten van het HBV genoom, een product dat is gegenereerd door de versterking van een andere volgorde HBV-DNA-genoom suggereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We beschrijven hier de in vitro generatie HBV DNA via een Hepatitis B-virus infectie-systeem en de zeer gevoelige detectie van de integratie van de (1 – 2 kopieën) met behulp van inverse genest PCR.

Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in hepatitis B virologie te beantwoorden, zoals het vinden van cellulaire of virologische factoren die de HPV-DNA-integratie beïnvloeden. Er zijn meerdere voordelen aan deze techniek. Het is relatief goedkoop, en gemakkelijk uit te voeren, analyse van de resultaten is eenvoudig, en het is zeer gevoelig, tot enkele kopieën.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in HBV-integratie, kan deze ook worden gebruikt voor andere virussen die in het genoom van de gastheercel worden geïntegreerd, zoals HIV, HTLV-1 of HPV. Om de cellen te infecteren, zaad 200.000 cellen per milliliter in een twaalf put plaat, met 1 milliliter D-mem. Op de volgende dag, gebruik Heparin kolom gezuiverd su-per-na-din van HEP-AD 38 als inentingsmiddel om de cellen te infecteren op 1,000 VGE per cel, in 500 microliters van cultuurmedium.Dan, cultuur de cellen op 37 graden Celsius. Vervolgens, op de volgende dag, was de cellen twee keer met een milliliter steriele een keer PBS. Vervang vervolgens het kweekmedium om de 2 dagen, tot de oogst.Behandel de cellen op dag 3 na infectie met 5 micromolar tenofovir disoproxil en 10 micromolar Lamivudine om de productie van HBV-replicatieftemiddelen te beperken die kunnen worden versterkt door inverse PCR. Op dag 5, na infectie, trypsinize sommige cellen met 200 microliters van Trypsin EDTA en opnieuw opschorten ze in 2 milliliter D-mem met 5 micromolar Tenofovir disoproxil en 10 micromolar Lamivudine. Breng vervolgens de celsuspensies over naar een zes putplaat, om één ronde mitose te induceren.Op dag 7 na infectie, trypsinize de uitgebreide cellen in 400 microliters van Trypsin EDTA en schort het mengsel in 1 millileter van D-mem. Breng de vering vervolgens over in een buis van 1,5 milliliter. Pellet de cellen door centrifugatie op 500 keer G, gedurende vijf minuten.En verwijder de Su-per-na-din door aspiratie. Haal het DNA uit de celpellet met behulp van een DNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor DNA-inversie, toewijzen 1,5 tot 2,5 microgram van het totale DNA-extract in een 200 microliter PCR buis.Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid beperkingsenzym master mix toe om te resulteren in een 40 microliter reactievolume, met 1 keer de digestiereactiebuffer en 10 eenheden NCO-1HF. Broed de beperking enzymreactie in een PCR machine op 37 graden Celsius gedurende een uur, voor een optimale spijsvertering efficiëntie. Activeer vervolgens het beperkingsenzym door het 20 minuten lang 80 graden Celsius uit te broeden.Breng de volledige beperking enzym reactie op een 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens 400 microliters van 1 keer T4 DNA ligase buffer en 500 eenheden T4 DNA ligase toe en meng grondig. Het grote reactievolume moedigt intramoleculaire ligatie van de verteerde DNA-fragmenten aan.Broed de ligatiereactie 2 uur lang bij kamertemperatuur om volledige ligatie te garanderen. Na 2 uur activeer je de T4 DNA-ligase op 70 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens 10 microliter van 10 Natrium Dodedecyl Sulfaat toe om volledige inactivatie van de T4 ligase te garanderen.Voeg natriumchloride toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 millimolar en Dextran tot een uiteindelijke concentratie van 90 microgram per milliliter. Meng door puls vortexing, en kort spin vaststelling van de reactie mix. Voeg vervolgens 900 microliter van 100 ethanol toe en meng door inversie.Precipitate het DNA bij negatieve 20 graden Celsius 's nachts. En pellet het neergeslagen DNA door centrifugatie op 14000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder daarna de Su-per-na-dine door aspiratie.Was de pellet met 500 microliter van 70 ethanol. En centrifugatie op 14000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens de ethanol door aspiratie en droog de DNA-pellet 20 minuten op kamertemperatuur.Los de pellet op in 20 microliter water en voeg 20 microliter van beperken enzym master mix om te resulteren in een 40 microliter reactievolume, met 1 keer spijsvertering reactie buffer, 5 eenheden BSIHK-1, en 5 eenheden van SPH-1HF. Nest, broed de beperking enzym reactie in een warmteblok op 37 graden Celsius, gedurende 1 uur. Draai de reactiemix kort naar beneden, broed de reactie van het beperkingsenzym in een warmteblok bij 65 graden Celsius gedurende 1 uur uit.Verwijder in deze procedure potentiële amplicons uit een herbruikbare siliconenmatafdichting met behulp van een DNA-afbraakoplossing. Spoel de mat grondig af met DNA-vrij water en de lucht droogt deze op kamertemperatuur. Bereid vervolgens een millileter van 1 keer PCR-mix met de buitenste voorwaartse en omgekeerde primers bij een concentratie van 0,5 micromolar.Voeg 170 microliters toe als de 1 keer PCR-mix naar putten A-1 en E-1, in een 96 goed PCR-plaat. Voeg vervolgens 120 microliters van de 1 keer PCR-mix toe aan putten B-1 en H-1. Voeg daarna 10 microliter van het omgekeerde DNA toe aan putten A-1 en E-1.Meng de reactie in elke put, door zachtjes pipetteren elk, ongeveer 10 keer met behulp van een P-1000 ingesteld op 100 microliters. Verdun de monsters van putten A-1 tot D-1 in serie, met een verhouding van 1:3 door bij elke stap 60 microliters over te brengen. Meng de putten bij elke stap door ze voorzichtig pipetting ongeveer 10 keer met behulp van een P-1000 ingesteld op 100 microliters.Vermijd het vormen van bellen, herhaal de procedure voor goed E-1, verdunnen tot goed H-1. Vervolgens, toewijzen 10 microliters van het reactiemengsel, met behulp van multichannel pipet, van Wells A-1, H-1, in putten A-2, H2, A-3, H-3 en ga zo maar door, tot het bereiken van putten A-12, H-12 van de 96 goed plaat. Bedek de PCR-plaat met een droge siliconenmat en druk stevig.Plaats vervolgens de plaat in een PCR-machine en voer het aangegeven programma uit voordat u de plaat op kamertemperatuur zet. Verwarm daarna de pinnen van een 96-pins replicator tot roodgloeiend met een Bunsen-brander en koel vervolgens minstens 5 minuten af bij kamertemperatuur. Vul de putten van een tweede PCR-plaat met 10 microliters van 1 keer PCR-mix, met een gel load ready buffer, en de binnenste voorwaartse en omgekeerde op 0,5 micromolar.Verwijder voorzichtig de siliconenmat van de PCR-plaat van de 96 putplaat uit de eerste ronde PCR en voorkom kruisbesmetting tussen putten. Gebruik de gekoelde replicator om de PCR producten van de 96 put plaat, van de eerste ronde PCR, over te dragen aan de nieuw toegewezen 96 put plaat. Voer de geneste PCR uit, met behulp van de aangegeven voorwaarde.Om de PCR producten te isoleren, analyseren ze door gel elektroforese, met behulp van een 96 put plaat, met 1.3 Agarose gel. Voor een 100 milliliter Agarose gel, draaien op 200 volt gedurende 10 tot 15 minuten. Daarna, accijns de DNA-banden van de Agarose gels, met behulp van wegwerp drinkrietjes.Voor elk PCR-product, plaats het stro en Agarose gel plug in een 1,5 milliliter buis, trim het stro op maat met een schaar. Daarna, uitwerpen van de Agarose stekkers in elke buis, door knijpen op het einde van het stro fragment. Voeg vervolgens 300 microliter gelextractiebuffer en 5 microliter gelextractieglaskralen toe aan elke buis.Haal de PCR-producten per fabrikant instructies voor de gel extractie kit, en verdun het DNA uit de kralen met 30 microliters van water. Dien het gezuiverde DNA voor Sanger sequencing, met de voorwaartse primer gebruikt in de tweede ronde geneste PCR. Een voorbeeld Agarose gel elektroforese van succesvolle omgekeerde PCR, vóór en na DE productisolatie van PCR, wordt hier getoond.M vertegenwoordigt DNA marker laatste, elke rij van 12 vertegenwoordigt de technische replica's bij een enkele verdunning op de PCR-plaat. In dit geval moeten afzonderlijke PCR-producten worden bereikt door de tweede of derde 1:3 verdunning van elk monster. Bij deze verdunningen zal ongeveer 50% van de producten echte dna-knooppunten van viruscellen vertegenwoordigen.Terwijl de andere helft vertegenwoordigt versterking van HBV DNA tussenproducten. Deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om HPV DNA-integratie in zeer gecontroleerde in-vitro infectiesystemen te verkennen. Aanvullende methoden, zoals biothematische analyse, kunnen worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden.Bijvoorbeeld als HPV-DNA-integratie plaatsvindt in specifieke gebieden in het cellulaire genoom. Vergeet niet dat het werken met infectie Hepatitis B-virus, kan gevaarlijk zijn en passende infectie controles, zoals bio veiligheid kasten en voorafgaande vaccinatie, moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

detection-low-copy-number-integrated-viral-dna-formed-vitro-hepatitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

This video demonstrates an in vitro technique to detect hepatitis B virus (HBV) infection via a recombinant HBV reporter system. Upon infecting host cells, the recombinant viral genome expresses the luciferase reporter enzyme, which produces bioluminescence upon oxidizing its substrate — helping detect viral infection.

An In Vitro Recombinant Virus Reporter System for the Detection of Viral Infection

Hepatitis C Virus (HCV) is een belangrijk humaan pathogeen dat leveraandoeningen veroorzaakt, inclusief cirrose en kanker. Een HCV-infectieus celkweeksysteem is essentieel voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme van HCV-replicatie en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Hier beschrijven we een protocol om verschillende stadia van de HCV-replicatiecyclus te onderzoeken.

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).

Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Real-time polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus (HBV)-DNA is een gevoelige en nauwkeurige methode voor het diagnosticeren en bewaken van HBV-infectie. Hier presenteren we een protocol voor HBV-DNA-detectie en de viral load-meting van een monster.

Real-time polymerasekettingreactie-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus-DNA

Er is geen standaard virusneutralisatietest beschikbaar voor het Hepatitis E-virus (HEV), een niet-cytopathisch positief strengs RNA-virus. Hier wordt een fluorescentie-reductie-neutralisatietest (FRNT) beschreven op basis van kwantificering van fluorescerend gelabeld viraal capside-eiwit om de effectiviteit van anti-HEV-antilichamen te evalueren.

Hepatitis E Virus Fluorescentiereductie Neutralisatietest voor het meten van neutraliserende antilichaamtiters

Leer een gevoelige en kosteneffectieve methode om Hepatitis B-virus DNA-integratie in gastheer-genomen te detecteren en te kwantificeren. Dit protocol maakt enkele-kopie detectie en enkele-basenpaar resolutie van virus-gastheer DNA-juncties mogelijk.

Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Meer video's verkennen