Micropuncture van Bowman ruimte in muizen vergemakkelijkt door 2 foton microscopie

Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over single-nephron fysiologie, met inbegrip van de glomerulaire filtratie tarieven van systemische eiwitten en metabolieten en hun bijdragen aan buisvormige fysiologie. Het belangrijkste voordeel van deze micropunctietechniek is dat het toegang geeft tot Bowman's ruimte en de corticale nephron in alle muizen. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben omdat het correct uitgevoerde voorbereidingsstappen vereist.

Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, breng zalf op de ogen en gebruik tape om de ledematen van een 20 tot 25 gram volwassen muis te immobiliseren. Gebruik een ontharingscrème om al het haar aan de linkerkant van het dier te verwijderen en gebruik de milt om de linkernier via de huid te lokaliseren aan de rug- en staartzijde van de milt. Maak een incisie van 0,5 centimeter in de huid, gevolgd door een kleinere incisie in het buikvlies net groot genoeg voor de nier te worden geduwd door.

Extrudeer de nier met zachte druk en plaats een polysiloxane nierstabilisatorvorm rond het weefsel. Lijn de nier met de spacer zodanig dat de lateralmost oppervlak van de nier zich uitstrekt dan de stabilisator met ongeveer een millimeter, en bevestig de nier aan de vorm met cyanoacrylaat lijm. Lijm een kopplaat aan de stabilisatorvorm en monteer de hoofdplaat op de basisplaat.

Vul vervolgens de put in de polysiloxane-ondersteuning met een procent agarose-oplossing en houd een 10 millimeter afdek slip op de top van de vorm totdat de agarose stevig is. Verzegel de afdekking slip op de hoofdplaat met lijm en maak een ring rond de cover slip met tandcement. Injecteer vervolgens 100 tot 150 microliter FITC-Dextran retro-orbitaal en verplaats de muis en fixatieplaat snel naar de twee-fotonmicroscoopfase.

Na handmatig scherp te stellen op het nieroppervlak, overschakelen naar de niet-scannen twee-foton-modus en verken de beeldvorming venster om een doel glomerulus dat is groter dan 30 micrometer onder de cover slip en minder dan 400 micrometer van de laterale nier capsule lokaliseren. Nota van de laterale en verticale afstand tot het doel glomerulus. Neem vervolgens de x-, y- en z-fasecoördinaten op voor de glomerulus.

En tot slot, verhoog het objectieve brandpunt ongeveer een millimeter in de waterkolom zonder de x- en y-fasecoördinaten te veranderen. Rij de pipetpunt in de waterkolom en zet de DAPI-excitatie aan. Verplaats de pipet in de x- en y-afmetingen naar het puntje van maximale fluorescentie van de punt.

Dit zal het middelpunt van het doel zijn. Verander de x citatie instelling in rood fluorescerend eiwit en visualiseer de pipet met de oculair om nauwkeurige centrering in de oculaire weergave mogelijk te maken. Schakel terug naar twee-foton om de pipet te vinden onder de live twee-foton weergave en plaats de tip precies in het midden van het beeld, dit is de registratiepositie.

Sla vervolgens een afbeelding van de pipet op en registreer het podium en de coördinaten van de micropipetcontroller. Verwijder de pipet uit de waterkolom in de x-as zonder de y- en z-as te bewegen en verplaats de pipet z naar de doelglomerulus z-coördinaat en de rand van de nier. Let op het stadium x en bereken de nierrand pipet x met behulp van de offset van de registratiefase x.

Verhoog het stadium x om het podium naar de pipet te verplaatsen totdat de rand van de nier ver aan de linkerkant van het scherm is, terwijl het zichtbaar blijft. Snel vooraf de pipet tot ongeveer 100 micrometer verwijderd van de nier rand pipet X heeft net berekend. Verhoog de rode winst en begin langzaam de pipetpunt naar de nierrand onder live twee-foton beeldvorming te bevorderen terwijl het toezicht op de rode pixel histogram.

Rijd de pipet in de x-as langzaam naar de glomerulus doel pipet x, waarbij een oogje op het podium x. Bij het bereiken van de glomerulus, documenteer de positie met een z-stack. Met de pipet in positie, zet de micropomp te injecteren 100 nanoliters van perfluorodecalin meer dan twee minuten.

Om de patency van de pipet te garanderen en om het verstoren van het aansluiten van pipette tijdens binnenkomst te verminderen. Stel na vier tot zes minuten filtratie de micropomp in om tot 300 nanoliter aan te trekken met een snelheid tot 50 nanoliter per minuut. Deze prachtige, nabij oppervlak glomerulus toont gunstige beeldvorming als gevolg van de oppervlaktepositie van de glomerulus op 20 micrometer onder de niercapsule.

De glomerulus is echter te dicht bij het oppervlak voor microinjectie, omdat de pipet de afdekslip zou raken. Deze glomeruli zijn optimaal gepositioneerd met de laterale randen 250 micrometer naar rechts en lijken minder scherp vanwege de breking veroorzaakt door hun 70 micrometer diepte van de capsule. Beide factoren die de glomeruli toegankelijk maken.

In deze typische nierinvoerafbeelding onthult een gemiddelde intensiteitsprojectie van een z-stack met orthogonale weergaven de pipetpunt in bowmans ruimte, let op de rode pipetpuntspectrale artefact van de extreem heldere fluorescentie van de quantum dots gerangschikt op het kegelvormige gedeelte van de tip. Hier, een volume weergave van een z-stack verworven na de positionering van een pipet in de ruimte van Bowman, toont de pipet tip in de ruimte naast de capillaire bosjes. Als een pipet met een te grote opening wordt gebruikt, kan de niercapsule breken waardoor subcapsulaire bloedingen en binnenkomst van het bloed in de pipetlumen.

Met behulp van deze methode, 17 eiwitten, voornamelijk van laag moleculair gewicht, zijn geïdentificeerd uit een minimum van twee unieke peptiden per eiwit. In combinatie met deze methode kunnen andere methoden zoals maspectroscopie, iongevoelige elektrodemetingen en fluorescerende antilichaaminjectie worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de rol van luminale oplosmiddelen in buisvormige en glomerulaire fysiologie.