Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen van fundamentele immunobiologie en inflammatoire darmziekte onderzoek met betrekking tot de adhesie cascade van immuuncellen die nodig zijn voor homing aan perifere organen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een handige en eenvoudige aanpak is voor het beantwoorden van functionele vragen in de context van celhechting onder stroomomstandigheden. Hoewel deze methode is ontwikkeld voor het verkennen van het mechanisme van celpoietische anti-integrin antilichamen in inflammatoire darmziekten, kan het worden gewijzigd om soortgelijke problemen in andere instellingen voor ontstekingsziekten te analyseren.

Begin met het uitrekken van een stuk rubberen buizen aan de ene kant met een kleine schaar om het inbrengen van een rechthoekige capillaire ongeveer 0,5 centimeter in de buis mogelijk te maken. Sluit dan de verbinding met paraffinefilm af. Bedek de capillaire met 20 microliter van de addressin van belang en verzegel de kant die niet is verbonden met de slang met plastic paraffinefilm gedurende ten minste een uur incubatie bij 37 graden Celsius.

Verwijder aan het einde van de incubatie de plastic paraffinefilm en laat de vloeistof uit de capillaire weken op een papieren handdoek om de slang te legen. Blokkeer dan capillair met 20 microliters van blokkerende oplossing minstens één uur bij 37 graden Van Celsius. Het is zeer belangrijk om de blokkering direct na het verwijderen van de coating op de capillaire aan te brengen om te voorkomen dat de capillaire opdroogt, omdat dit de functionaliteit van de gecodeerde eiwitten kan aantasten.

Terwijl de capillaire wordt geblokkeerd, voeg 18 milliliter antistollingsbloed van een 50 milliliter buis en verdun het bloed tot een totaal volume van 35 milliliter met PBS. Laag 10 milliliter dichtheidsgradiënt medium onder de bloedoplossing en isoleren de perifere bloedcellen door dichtheidgradiëntcentrifugatie. Breng aan het einde van de scheiding de perifere bloedmononucleaire cellen over van de interface van het dichtheidsgradiëntmedium naar een nieuwe buis van 50 milliliter.

En breng het totale volume in de buis tot 50 milliliter met verse PBS. Na centrifugatie, resuspend de pellet in 10 milliliter verse PBS voor het tellen en vlek de cellen met een geschikte cel tracking kleurstof volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel aan het einde van de kleuring incubatie de cellen door centrifugatie en zet de pellet 1,5 keer 10 tot 10 tot 10 tot de zes cellen per milliliter van volledige RPMI-mediumconcentratie opnieuw op.

Dan zaad een milliliter cellen in zo veel putten van een 48 goed plaat als er voorwaarden zijn. En voeg het juiste volume anti-integrin antilichaam toe aan de juiste putten voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een P1000 pipet om de cellen meerdere keren opnieuw op te zetten voordat u de cellen overdraagt in individuele twee milliliterbuizen.

Spoel elk goed met een milliliter PBS en pool de wasbeurten in de juiste twee milliliter buizen. Na het tellen, pellet de cellen door centrifugatie en resuspened de cellen in het juiste volume van hechting buffer te verkrijgen 1,5 keer tien tot de zesde cellen per milliliter suspensaties. Voeg vervolgens het juiste volume mangaanchloride toe aan elke buis aan een uiteindelijke concentratie van één millimolar.

Wanneer de cellen klaar zijn, schakelt u de microscoop in en selecteert u de juiste filters en lasers, de objectieve en de acquisitiemodus. Verwijder de plastic paraffinefilm van de punt van de capillaire en gebruik een schaar om een stuk rubberen buizen van vijf centimeter uit te rekken om de capillaire op de kleinere buis te kunnen aansluiten. Verzegel de verbinding tussen de capillaire en de buis met plastic paraffinefilm.

En monteer de capillaire op een fixatielade. Plaats de lade op de ladehouder van de microscoop, zodat de capillaire is in focus. En steek de rubberen buizen in de overeenkomstige inkeping van de peristaltische pomp.

Plaats het ongebonden uiteinde van de slang in de eerste monsterbuis met de celsuspensie. En steek de korte buis aan de andere kant van de capillaire in een 15 milliliter buis om stroom te verzamelen door. Laat de slang vullen met een 500 microliter per minuut stroomsnelheid totdat de cel suspensie bijna de capillaire bereikt.

Laat vervolgens de capillaire vullen met een stroomsnelheid van 100 microliter per minuut. Wanneer het capillair is gevuld met cellen, pas de stroomsnelheid aan op 10 microliter per minuut en leg time lapse-beelden vast van de cellen die langzaam door de capillaire langs de binnenkant van de met addressin bedekte wand bewegen gedurende een totaal van drie minuten. Zodra de celsuspensie de binnenkant van de capillaire bereikt, is het van cruciaal belang om elke onderbreking van de stroom te voorkomen, omdat dit zal leiden tot statische integrin-inwerking die de meting mogelijk kan beïnvloeden.

Voordat u de beek door het oculair van de microscoop verwijdert, moet ervoor worden gezorgd dat de sectie die op het scherm wordt waargenomen representatief is. Bevrijd de slang van de pomp en laat de resterende vloeistof terug lopen in de twee milliliter buis. Koppel vervolgens de capillaire en de slang los van de fixatielade en beeld de volgende capillaire zoals net aangetoond.

Als u de time lapse-opnamen wilt evalueren, opent u de eerste reeks in de juiste analysesoftware en exporteert u de eerste en laatste drie afbeeldingen als TIFF-bestanden. Open de drie beginafbeeldingen in ImageJ en selecteer afbeelding, type en 32-bits om de afbeeldingen om te zetten naar 32-bits. Selecteer vervolgens afbeeldings-, kleur- en samenvoegkanalen om de afbeeldingen samen te voegen tot één afbeelding en de samengestelde afbeelding om te zetten in RGB voor opslaan als TIFF-bestand.

Nadat u de laatste drie afbeeldingen op dezelfde manier hebt geconverteerd, telt u de witte cellen die zichtbaar zijn in het begin en het beëindigen van samengestelde afbeeldingen. En trek het aantal witte cellen in de beginafbeelding af van het aantal witte cellen in de eindafbeelding. De perfusie van haarvaten bedekt met ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, maar niet Isotype Fc chimera met menselijke PBMCs leidt tot duidelijke hechting wanneer een van de drie adressins aanwezig is.

De remming van integrin-adres in interacties met neutraliserende antilichamen leidt daarentegen meestal tot een duidelijke afname van dynamische hechting die afwezig is wanneer isotypecontroleantilichamen worden toegevoegd. Verder leidt de behandeling van CD4-menselijke T-cellen met specifieke chemokines tot een verhoogde hechting aan adresseren in vergelijking met onbehandelde menselijke cellen. Tijdens het proberen van deze procedure, is het zeer belangrijk om te onthouden dat verschillende factoren bijdragen aan dynamische celhechting in vivo die niet volledig kan worden samengevat in deze test.

Het is echter mogelijk om de test aan te passen om zeer complexe vragen aan te pakken. Om aanvullende vragen over het differentiële hechtingsgedrag van het testen van celtypen aan te pakken, is het ook mogelijk om concurrerende hechtingstesten uit te voeren met verschillende celtypen met verschillende celtrackingkleurstoffen. Na de ontwikkeling ervan stelde deze techniek ons in staat om de effecten van de verschillende anti-integrin antilichamen te onderzoeken die worden gebruikt of die momenteel in ontwikkeling zijn voor de behandeling van inflammatoire darmziekten.