Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de zelftherapie van het oog, zoals wat de werkzaamheid is van een speciaal ontworpen bio-geengineerd weefsel in vivo. Met deze techniek bieden we een methode voor het produceren en contureren van het retinale weefsel, evenals een strategie voor het verwerken van het weefsel voor implantatie in het oog in een diermodel. Begin met het wassen van een tot vier stukken van 30 bij 30 mm menselijk amnionmembrane, of hAM.

Bevestig een nylon schaal twee keer in 80ml van PBS per wasbeurt in een 250ml fles op een schudder, op hoge snelheid gedurende vijf minuten. Na de tweede wasbeurt, voeg 40ml van werkende Thermolysine oplossing toe aan elke fles, en schud de flessen twee keer gedurende vijf minuten op 450 rpm, gevolgd door 30 seconden van vortexing. Na de tweede ronde van Thermolysine behandeling, was de stukken nog twee keer met 80ml van PBS per wasbeurt, zoals gedemonstreerd.

Gebruik vervolgens lange steriele forceps om de hAMs individueel over te brengen naar een 10cm kweekschaal, die 10ml van PBS bevat. Plaats vervolgens een membraan met de nylon naar beneden in een tweede 10cm kweekschaal van PBS, en los twee van de vier clips die het membraan aan het nylon bevestigen. Plaats de kleinere ring van de kweekinzet tussen de nylon en het membraan, en zorg ervoor dat het membraan de kleinere ring volledig bedekt.

Bevestig het tweede deel van de kweekinzet aan de bovenkant van het membraan zodat het basement membraan van de hAM met de goede kant naar boven in de kweekinzet zit en los de laatste twee clips. Gebruik vervolgens steriele schaar om eventueel membraan buiten de kweekinzet weg te knippen indien nodig. Gebruik vervolgens forceps om het membraan over te brengen naar een putje van een 12-putjesplaat, die PBS bevat voor opslag bij 37 graden Celsius en 5%CO2.

Voor het zaaien, verwarm cryo vials die eenmaal 10 tot de zesde RPE cellen bevatten in 3ml van RPE medium in één 15ml conische buis per fles. Wanneer de cellen zijn ontdooid, pipet om een eencellige suspensie in elke buis te verkrijgen, en tel het aantal levensvatbare cellen door tri pan blauwe exclusie. Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellets op een concentratie van zeven keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in vers RPE medium.

Zuig vervolgens het PBS uit elke put van de voorbereide 12-putjesplaat en voeg 500 microliter cellen toe aan het centrum van elke kweekinzet, en 1ml van RPE medium aan de bodem van elke put. Plaats vervolgens de plaat terug in de cellenkweekincubator gedurende 30 dagen, ververs het medium twee keer per week tot het einde van de kweek. Op kweekdag 30, verwarm een 8%gelatine oplossing in een 37 graden Celsius waterbad, gedurende 30 minuten.

Vul vervolgens de interne kamer van een vibratoom met vier graden Celsius CO2 onafhankelijk medium. Gebruik een scalpel om een blok van 5cm bij 5cm te snijden uit een 20%gelatineblok dat is opgeslagen bij vier graden Celsius. Bevestig de bovenkant van het blok aan de ondersteuning met een geschikte kleefstof.

Plaats vervolgens een nieuw mes in de vibratoom. Pas de blok aan tot het op hetzelfde niveau is als het scheermes, en vul het bad rond de ondersteuning met vers vier graden Celsius CO2 onafhankelijk medium. Snijd het blok met een gemiddelde snelheid tot het blok uniform is gesneden met een gladde voorkant en stel de positie op nul.

Zuig vervolgens het medium rond de gelatine totdat de gelatine volledig droog is. Gebruik vervolgens forceps om voorzichtig een RPE gezaaide kweekinzet bovenop het blok te openen. Gebruik schaar om alle membraan buiten de inzetring te verwijderen, en zuig het gehele volume restmedium op.

Voeg tot 1ml van 8%vloeibare gelatine oplossing toe aan het membraan tot het bedekt is. Verwijder voorzichtig eventueel overtollig gelatine. Voeg na vijf tot acht minuten vers vier graden Celsius CO2 onafhankelijk medium toe aan het bad totdat het gesolidifieerde membraan is bedekt.

En met de vibratoom op de 100 micron positie, snijd een sectie van het membraan met een gemiddelde snelheid, zorg ervoor dat de oriëntatie van het weefsel wordt behouden. Snijd een hoek van de sectie met een scalpel om de oriëntatie van de sectie te kunnen identificeren. Gebruik vervolgens een spatel om het gelatine-ingebedde membraan over te brengen naar één van een zes-putjesplaat, gevuld met vier graden Celsius conserveringsmedium.

De oriëntatie van de snede kan worden omgekeerd vanwege vrije beweging voordat de hoek wordt gesneden. Zorg er dus voor om de positie van de snede direct na het snijden veilig te stellen. De grootte van het implantaat kan vervolgens worden aangepast aan de grootte van het ontvangende oog onder een chirurgische microscoop, vóór transplantatie.

Typisch blijven een paar dode cellen op het oppervlak van het membraan achter na fixatie op de kweekinzet, maar deze cellen worden geëlimineerd wanneer het kweekmedium wordt ververst. De vezels van het basement membraan zijn zichtbaar bij hogere vergroting wanneer er geen cellen meer aanwezig zijn, wat aangeeft dat de Thermolysine behandelingsperiode is geoptimaliseerd. Het retinale epitheel wordt gemakkelijker zichtbaar onder een microscoop, naarmate het volwassen wordt en een complete kasseien-achtige monolaag vormt na drie weken.

Na vier weken is het epitheel voldoende volwassen om voor implantatie te worden voorbereid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de toestand van de gelatine afhankelijk is van de temperatuur. Zorg er dus voor om strikt de aanbevolen temperaturen te volgen.

Na de ontwikkeling, baant deze techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van stamceltherapie, om het therapeutische potentieel van een bio-geengineerd weefsel in een diermodel van retinitis pigmentosa te verkennen. Hoewel deze methode