Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

Deze methode kan helpen bij het bestuderen van richtingen van eiwitten met lipidemembranen. In ons geval, gebruik het om de calciumafhankelijke binding van annexins te analyseren aan negatief geladen fosfolipiden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het label vrij, gevoelig, kwantitatief, en dat interacties kunnen worden waargenomen in real time.

Aldus waardoor directe analyse van de werkelijke resultaten mogelijk is. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de interactie van meer complexe micromolecule assemblages of zelfs cellen. Gebruik duidelijke vijf millimolar lipide oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Combineer de opgeloste lipiden in de gewenste kiesverhouding in 10 milliliter glazen buizen. Verdamp de organische oplosmiddelen met behulp van een droge stroom stikstof. Laat het lipidemengsel drie uur op een hoog vacuümlyofielsysteem om eventuele restsporen van de oplosmiddelen te verwijderen.

Nu, resuspend de lipide film in een milliliter citraat buffer. Broed de lipide suspensie bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten in een waterbad, vortexing het krachtig om de vijf minuten. Deze temperatuur ligt rond de 10 graden Celsius boven de faseovergangstemperatuur van de hoogste smeltende lipide in het mengsel.

Verwarm ondertussen de extruder voor met een porie met een diameter van 50 nanometer die 30 minuten boven de overgangstemperatuur ligt. Laad de multilamellar vesicle suspensie in de voorverwarmde extruder. Steek het mengsel voorzichtig 31 keer door het polycarbonaatmembraan om kleine unilamellar vedels of SUV's te vormen.

Houd de temperatuur boven de overgangstemperatuur. Breng de SUV-ophanging over op een twee milliliter kunststof reactievat en voeg de citraatbuffer toe om het uiteindelijke volume op twee milliliter te brengen. Incubeer vier sensoren die gedurende ten minste 30 minuten in een polytetrafluorethyleenhouder in een 2%SDS-oplossing worden geplaatst.

Was ze vervolgens uitgebreid met ultra zuiver water om de SDS volledig te verwijderen en ze te proberen met behulp van een stroom van droge argon of stikstof. Gebruik een plasmareinigingssysteem om eventuele verontreinigingen volledig te verwijderen. Plaats hiervoor de droge sensoren in de plasmareinigingskamer, evacueer de kamer en spoel deze drie keer door met zuurstof.

Zet vervolgens de plasmareiniger aan. Gebruik vacuüm, hoog radiofrequentievermogen en 10 minuten procestijd. Na de reinigingsrun schakelt u de machine uit en schakelt u de sensoren uit.

Leg de plasma gereinigde sensoren voorzichtig aan in de vier stroomkamers met een pincet. Vermijd druk op of torsie van de kamers en buizen die kunnen leiden tot lekken. Spoel het systeem 10 minuten door met citratebuffer in de open flow-modus.

Start het programma. Begin met het registreren van eventuele veranderingen in de frequentie en afvoer van de eerste fundamentele toon en boventonen met behulp van de software totdat de frequentie en dissipatie baselines stabiel zijn. Wanneer de basislijnen stabiel zijn, past u de SUV-vering toe in citrate buffer.

Verwijder met behulp van een reactievat 1,5 milliliter van het dode volume en sluit het systeem vervolgens in de lusstroommodus. Nota van de frequentieafvoerverschuiving voor nog eens 10 minuten. Wanneer de SLB stabiel is, moet u het systeem gedurende 40 minuten in evenwicht brengen met een lopende buffer bij de vereiste calciumconcentraties in een open flow-modus.

Voeg het eiwit toe aan de lopende buffer met calcium. Voer de toepassing van het eiwit uit in een lusstroommodus totdat een evenwichts steady state is bereikt. Nu, dissociaal het gebonden eiwit door chelating calcium ionen met vijf millimolar EGTA in de lopende buffer in open flow mode.

Regenereer het microbalanssysteem met 50 milliliter dubbel gedestilleerd water in een continue open flow-modus. Haal de buizen uit de watercontainer en laat het systeem droog lopen. Verwijder de kristalsensor voorzichtig en maak deze schoon met een 2%SDS-oplossing met behulp van de polytetrafluorethyleenhouder.

Droog de zichtbare delen van het binneninterieur van de stroommodule waar de sensor is geplaatst. Hier getoond, is de registratie van de frequentiecurve en dissipatie verschuivingen. De prominente daling van de frequentie bij de toevoeging van de liposomen, geeft hun absorptie aan omdat de met buffer gevulde vesikels niet stijf maar viscoelastisch zijn, de dissipatie neemt toe.

Vervolgens scheuren de samensmeltende akels. De gelijktijdige afgifte van de buffer in de vesicles vermindert de adsorberende massa totdat een stabiel plateau is bereikt. De binding van bijlage A2 aan de lipiden voegt massa toe zoals blijkt uit de duidelijke frequentieverschuiving, maar verstoort niet de bilayerstructuur zoals aangegeven door de enige kleine verandering in dissipatie.

Wanneer calciumion door het chelaatvormer wordt verwijderd, scheidt EGTA, bijlage A2 zich van de lipidefilm. De frequentie en de dissipatie-opnamen verschuiven naar de niveaus die bij de bilayer worden gezien en die alleen de bijlage in A2-binding aangeeft, is volledig afhankelijk van het calciumion en dat de lipidefilm intact blijft. Hier wordt een representatief negatief controleexperiment weergegeven.

Wanneer fosphatidylserine afwezig is, zijn er geen veranderingen in frequentie of dissipatie zichtbaar na toevoeging van bijlage A2 in aanwezigheid van het calciumion. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om een goede bilayer formatie te waarborgen. Gebruik de liposomen onmiddellijk, anders zullen de kleine aluikels smelten in grotere met minder oppervlaktespanning die kan leiden tot een onstabiele basislijn.

Na deze procedure kan een kwantitatieve beschrijving van een membraaneiwitinteractie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals coöperatieve versus niet-coöperatieve binding.