Name: Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Leer hoe je ionconcentratie meet in de ongemengde grenslaag met open patch-clamp pipet. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van vloeistofstroommetingen voor elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de Pioneer Research Center Program (2011-0027921), door fundamentele wetenschap onderzoeksprogramma's (2015R1C1A1A02036887 en NRF-2016R1A2B4014795) door de National Research Foundation Korea gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & Toekomst Planning, en door een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (HI15C1540).

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele richtsnoeren van Konkuk Universiteit.
1. Agarose zout bruggen tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode
Opmerking: Agarose 3M KCl zout bruggen worden geproduceerd zoals eerder beschreven12 met kleine variaties.
<ol><li>Vorming van bruggen<ol>
<li>Buig de brand glazen capillaire buizen vormen een U-vormige zo nodig. De binnendiameter van de haarvaten moet groot genoeg zijn voor het verminderen van de serie weerstand bij het opnemen van grote ion stromen. Buizen met een binnendiameter van 2-5 mm zijn meestal acceptabel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van agarose 3 M KCl oplossing<ol>
<li>Bereiden van 100 mL 3 M KCl oplossing (1 M of 2 M is ook acceptabel).</li>
		<li>Weeg 3 g van agarose.</li>
		<li>Los de agar in 100 mL KCl (dat wil zeggen, 3% agarose) op een hete plaat tussen 90 en 100 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden van de bruggen met 3 M KCl agarose<ol>
<li>Dompel de U-vormige glazen bruggen in de agarose-KCl oplossing voor het eenvoudig laden. Opmerking: Het is gemakkelijk te graven uit de bruggen van glas als de agarose-KCl oplossing is opgenomen in een ondiep en breed container.</li>
		<li>Houd ze 's nachts bij kamertemperatuur (RT) voor de agarose instellen en harden.</li>
		<li>Zorgvuldig graven uit de agarose-KCl-loaded glas bruggen uit de reeks/gehard agarose-zout.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opslaan van de bruggen<ol>
<li>Genoeg volume voor te bereiden (dat wil zeggen, 500 mL) van de 3 M KCl oplossing in een fles met brede hals.</li>
		<li>Bewaar de bruggen agarose-zout bereid in de fles in een koelkast.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. toepassing van vloeistofstromen Shear kracht naar cellen in een kamer Patch-klemmen
Opmerking: Een schematisch diagram van de experimentele opstelling van patch-clamp is weergegeven in Figuur 1.
<ol><li>Plaats een container geladen met zwemwater oplossing (volume en hoogte moeten reeds worden gemeten) boven de patch-clamp-zaal.</li>
	<li>Vul de patch-clamp-zaal met de zwemwater-oplossing door het suctioning van de buis.</li>
	<li>Om te stoppen met de vloeistofstromen, illustraties van de buis aan de zijkant van de container voor het blokkeren van de vloeistofstromen en illustraties van de buis aan de zuiging kant om te stoppen met de zuiging op hetzelfde moment. Dit is de voorwaarde "stationair" controle.</li>
	<li>Om toe te passen vloeistofstromen schuintrekken kracht, opent u beide buizen op de zijkanten van de container en zuig op hetzelfde moment.</li>
	<li>Voor of na de vloeistofstromen schuintrekken kracht op de cel toe te passen, meten de stroomsnelheid in mL/min.</li>
	<li>Het debiet berekenen door het meten van de afname van de vloeistof volume na verloop van een bepaalde tijd.</li>
	<li>Van de gemeten debiet en meetkunde (structuur) van de kamer van de Baden, moet de kracht van de shear die naar de cel door de vloeistofstromen worden geschat (zie sectie discussie).</li>
	<li>Anderzijds om te bepalen van de stroomsnelheid (voor stappen 2.3-2.6), gebruik een perfusie pomp. In dit geval, wees voorzichtig om ervoor te zorgen een constante in plaats van een gepulseerde stroom.</li>
</ol>3. meten van veranderingen in Liquid-Metal Junction potentieel door vloeistofstromen tussen Bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode (figuur 3A)
<ol><li>Gebruik de Ag/AgCl-elektrode of pellet, die beschikbaar is vanaf de kant en klare producten, zonder de agarose zoutbrug.</li>
	<li>Een normale fysiologische zout zout voorbereiden op de zwemwater-zaal (b.v., 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0.5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose, pH aangepast aan 7.4 met NaOH).</li>
	<li>Plaats een patch-pipet met een 3 M KCl oplossing in de zaal om te minimaliseren van de potentiële verschuiving van de kruising tussen de pipet en Baden oplossingen.</li>
	<li>Bevestigen van de spanning-clamp versterker aan de huidige modus van de klem ("ik = 0" of "CC").</li>
	<li>Meet na het ontkrachten van de eerste verschoven potentieel, veranderingen in spanning geïnduceerd door verschillende debiet.</li>
	<li>Om te verifiëren dat de veranderingen in spanning vloeistof/metaal-kruising potentieel zijn, het effect van vloeistofstromen op het potentieel van de kruising met de agarose-zout-brug tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode opnieuw te onderzoeken.</li>
</ol>4. experimentele schatting van de concentratie van de echte Cl- in de ongemengde laag grenzend aan Ag/AgCl-elektrode onder rusttoestand (figuur 3B)
<ol><li>Uit de resultaten van stap 3, trekken de kruising potentieel-debiet relaties en schatting van de waarde van de maximale (verzadigen) junction potentiële variatie door het debiet van supra-vloeistof.</li>
	<li>Bereiden van oplossingen met verschillende concentraties van Cl (dat wil zeggen, 50, 99, 147, 195 en 288 mM van NaCl).</li>
	<li>Door het veranderen van de Cl- concentratie in de vloeistof van Baden, tekent u de relatie junction potentiële-[Cl-]. Merk op dat de vloeistof tarief constant en hoog genoeg moet (> 30 mL / min) om te voorkomen dat de daling van de concentratie van de Cl- met die van de aangrenzende Ag/AgCl-elektrode.</li>
	<li>Schatten van de relatie van de twee bochten, de veranderingen in de concentratie van de Cl- van de gemeten junction potentiële verschuiving.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes%3A+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit onderzoek aangetoond we een methode voor het meten van echte Cl- -concentratie in de ongemengde laag grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode door bepaling van de potentiële vloeistof-metaal-kruising met een open patch-clamp pipet gevuld met een hoge KCl concentratie. De veranderingen in de concentratie van de Cl- in de grenslaag kan resulteren in een verschuiving van kruising potentieel Wanneer overschakelen van statisch naar vloeistof-stromingscondities. Eenvoudig met behulp van een agarose KCl br...

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-cue waarmee veel fysiologische en pathologische processen zoals fluid flow-geïnduceerde vasodilatatie en vloeistof schuintrekken kracht-afhankelijke vasculaire remodeling en ontwikkeling1,2, 3,4,5. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistofstromen schuintrekken kracht niet helemaal begrepen zijn, gaat men ervan uit dat de fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating kritisch tot de vloeistof stroom-geïnduceerde reacties5 bijdragen kan , 6 , 7 , 8. bijvoorbeeld de activering van het endotheel innerlijke gelijkrichter Kir2.1 en Ca2 +-geactiveerde K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalen na Ca2 + toestroom door vloeistofstromen heeft gesuggereerd om bij te dragen tot vloeistof stroom-geïnduceerde vasodilatatie6,7,8. Daarom veel ionenkanalen, vooral mechanisch-geactiveerde of -geremde kanalen, zijn bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met de patch-clamp techniek6,9,10 , 11. afhankelijk van het experimentele protocol taakuit patch-clamp opnemen, uitkomsten en interpretatie van de gegevens op de vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen kunnen echter foutieve10,11.
Een bron van vloeibare stroom-geïnduceerde artefacten in patch-clamp opname is vanaf de samenvloeiing potentiële tussen de Badvloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode11. Het is algemeen aangenomen dat de vloeistof/metaal-kruising potentieel tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode constant, is zoals de Cl- -concentratie van de vloeistof zwemmen blijft constant, gelet op de chemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode te zijn:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (vergelijking 1)
Echter, in een geval waar de totale elektrochemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode (vergelijking 1) opbrengst van links naar rechts, de concentratie van de Cl- van de Baden vloeistof grenzend aan de Ag/AgCl verwijzing elektrode (ongemengde grenslaag12,13,14,15) wellicht veel lager dan die in de bulk van het zwemwater oplossing, tenzij genoeg convectional transport te waarborgen. Het gebruik van een oude of niet-ideale Ag/AgCl-elektrode met inadequate chlorering van Ag kan dergelijk risico verhogen. Deze vloeistof stroom-gerelateerde artefact op de referentie-elektrode, in feite, kan worden uitgesloten door het simpelweg plaatsen van een conventionele agarose-zout-brug tussen de Baden vloeistof en referentie-elektrode, aangezien het artefact is gebaseerd op wijzigingen in de reële Cl- concentratie grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode11. Het protocol gepresenteerd in deze studie beschrijft hoe te voorkomen van de mogelijke wijzigingen van de stroom-gerelateerde junction en meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag.
Na het plaatsen van een agarose KCl brug tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, is er een andere cruciale factor die u moet overwegen: net zoals de verwijzing Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl- -elektrode, de ionenkanalen ook kunnen functioneren zoals een ion-selectieve elektrode. De situatie van een ongemengde grenslaag tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode ontstaat tijdens de beweging van ionen tussen de extracellulaire en intracellulaire oplossingen via het membraan ionenkanalen. Dit impliceert dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer de interpretatie van het Reglement van ion kanalen door vloeistofstromen. Zoals besproken in onze eerdere studie11, de beweging van ionen via een oplossing waarin een elektrochemische gradiënt aanwezig is via drie verschillende mechanismen kan optreden: diffusie, migratie en convectie, waar diffusie de beweging is geïnduceerd door verloop van de concentratie, migratie is de beweging gedreven door elektrische verloop en convectie is het verkeer door middel van vloeistof-flow. Onder deze drie vervoer mechanismen, draagt convectie modus bij de meeste aan de beweging van ionen11 (> 1.000 keer groter is dan de verspreiding of migratie onder gebruikelijke patch-clamp-instellingen). Dit vormt de theoretische basis van waarom junction potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode kan zeer onder verschillende voorwaarden voor statische en vloeistof-flow11.
Volgens de hypothese voorgesteld hierboven, sommige facilitatory effecten van vloeistofstromen op de huidige ionkanaal kunnen worden afgeleid uit de convectie restauratie van echte ion concentraties grenzend aan de inlaat van kanaal aan de oppervlakte van het membraan (ongemengde grenslaag) 10. In dit geval de vloeistof stroom-geïnduceerde effecten op ion kanaal stromingen zijn eenvoudigweg ontstaan uit elektrochemische gebeurtenissen, niet van het Reglement van ion kanaal gating. Een soortgelijk idee was eerder voorgesteld door Barry en collega's12,13,14,15 op basis van strenge theoretische overwegingen en experimenteel bewijs, ook bekend als de ongemengde laag of vervoer nummer effect. Als sommige ionenkanalen voldoende voordoen enkellijns geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd om te zorgen voor voldoende vervoer tarieven via de kanalen (vervoer sneller in het membraan dan in het ongemengde membraan oppervlak), een grenslaag effect . Dus, de convectie-afhankelijke vervoer kan bijdragen tot de uiteindelijke vloeistof-stroom-geïnduceerde faciliteiten van ion huidige10,12,13,14,15.
In deze studie, benadrukken wij het belang van het gebruik van een agar of agarose zout-brug terwijl het bestuderen van vloeistof-stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. We bieden ook een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode en membraan ionenkanalen. Bovendien, de theoretische interpretatie van vloeistof stroom-geïnduceerde modulatie van ion kanaal stromen (dat wil zeggen, convectie hypothese of ongemengde vervoer nummer laageffect) kunnen waardevolle inzichten voor het ontwerpen en het interpreteren van onderzoeken op de shear kracht-regulatie van ionenkanalen. Volgens het ongemengde grenslaag vervoer nummer effect voorspellen we dat ion kanaal stromen via alle soorten membraan ionenkanalen kunnen worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen, onafhankelijk van hun biologische gevoeligheid voor vloeistofstromen schuintrekken kracht, maar alleen als de ionenkanalen hebben voldoende enkellijns geleidingsvermogen en open-lang. Hogere ion kanaal huidige dichtheden kan verhogen de ongemengde grenslaag effect op het oppervlak van de celmembraan.

<table><tbody><tr><td>RC-11 open bath chamber</td><td>Warner instruments, USA</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl elektrodepellet</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Voltage-clamp versterker</td><td>HEKA, Duitsland</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>Voltage-clamp versterker</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Vloeistof pomp</td><td>KNF Flodos, Zwitserland</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van de concentratie van de ion in de ongemengde grenslaag met open patch-clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door fluid flow

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-stimulans waarmee veel fysiologische en pathologische processen, zoals vloeibare stroom-geïnduceerde vasodilatatie. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistof stroom/schuifspanning kracht niet volledig begrepen worden, kan kritisch fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating bijdragen. Daarom, fluid flow/schuifspanning kracht gevoeligheid van ionenkanalen is onderzocht met behulp van de patch-clamp techniek. Afhankelijk van het experimentele protocol, kunnen de resultaten en de interpretatie van gegevens echter onjuist. Hier presenteren we experimentele en theoretische bewijzen voor fluid flow-gerelateerde fouten en voorzien in methoden voor het schatten, preventie en het corrigeren van deze fouten. Veranderingen in junction potentiële tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof werden gemeten met een open pipet gevuld met 3 M KCl vloeistofstromen kan dan verschuiven de vloeistof/metaal junction potentiële tot ongeveer 7 mV. Omgekeerd, door het meten van de verschuiving van de spanning geïnduceerd door vloeistofstromen, geschat we de ion-concentratie in de ongemengde grenslaag. In de rusttoestand, kunnen de echte ion concentraties grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode of ion kanaal inlaat aan het celmembraan oppervlak bereiken zo laag als ongeveer 30% van die in de voorwaarde van de stroom. Plaatsen van een agarose 3 M kan KCl brug tussen de zwemwater-vloeistof en referentie-elektrode hebben verhinderd indien dit probleem van het verschuiven van potentiële junction. De ongemengde laageffect grenzend aan het oppervlak van de celmembraan kan echter niet worden vastgesteld op deze manier. Hier bieden we een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag met een pipet open patch-clamp, wijzend op het belang van het gebruik van een agarose zout-brug terwijl het bestuderen van de vloeistof stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. Dus, deze nieuwe aanpak, waarin rekening wordt gehouden met de reële concentraties van ionen in de ongemengde grenslaag, nuttig inzicht kan verschaffen over de proefopzet en interpretatie van de gegevens aan vloeistof schuifspanning verordening van ionenkanalen gerelateerde .

Hele cel spanning-afhankelijke L-type Ca2 + kanaal (VDCCL)-stromingen werden geregistreerd in de mesenterische arteriële myocytes enzymatisch verspreide rat, als eerder beschreven11. De arteriële myocytes waren dialyzed met een Cs-rijke Pipetteer oplossing onder de configuratie van nystatine-geperforeerd met divalente kationen-gratis zwemmen oplossing ter vergemakkelijking van de huidige stroom door VDCCL11<s...

Mechanosensitive ionenkanalen worden vaak bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met patch-clamp opname. Afhankelijk van het experimentele protocol, kan de uitkomst op vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen echter onjuist. Hier, bieden wij methoden voor het voorkomen en corrigeren van dergelijke fouten met een theoretische basis.

Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Dit indienen kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de elektrofysiologische sfeer, zoals de vloeistofstroom in alleen de regelgeving van ionkanalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de werkelijke ionenconcentratie in de ongeerdateerde grenslaag van het membraanoppervlak kan schatten voor gegevensinterpretatie met betrekking tot vloeistofstroomregulatie van ionenkanalen. Om deze procedure te beginnen, buigt u de vuurglas capillaire buis om een U-vorm te vormen.De binnendiameter van de capillaire moet groot genoeg zijn om de serieweerstand te verminderen bij het opnemen van grote ionenstromen. Los vervolgens drie gram agarose op in 100 milliliter kaliumchloride van drie molaire en leg het op een hete plaat tussen 90 en 100 graden Celsius. Laad vervolgens de brug met de kaliumchloride agarose, door het onderdompelen van de glazen brug in de oplossing.Houd het 's nachts op kamertemperatuur voor de agarose in te stellen en uit te harden. De volgende dag, zorgvuldig graven uit de agarose kalium chloride geladen glazen brug van de geharde agarose zout. Bewaar de brug in een fles met drie kiezen kaliumchloride in de koelkast.Plaats in deze procedure een container geladen met badoplossing, boven de patch-klemkamer. Vul vervolgens de patchklemkamer met de badoplossing door de buis af te zuigen. Om de vloeistofstroom te stoppen, klemt u de buis aan de kant van de container om de vloeistofstroom te blokkeren.Knip vervolgens de buis aan de zuigkant om de zuigkracht tegelijkertijd te stoppen. Dit is de stationaire controle voorwaarde. Om vloeistofstroomschuifkracht toe te passen, opent u beide buizen tegelijkertijd op de container en de zuigkanten.Bereken voor of na het toepassen van de vloeistofstroomschuifkracht op de cel de stroomsnelheid in milliliter per minuut door de afname van het vloeistofvolume over een bepaalde tijd te meten. Om veranderingen in het splitsingspotentieel van vloeibaar metaal te meten, bereidt u een normale fysiologische zoutoplossing voor de badkamer voor en vergelijkt u deze bij afwezigheid en aanwezigheid van agarkaliumchloridebrug. Plaats vervolgens een patchpipet met drie-molaire kaliumchlorideoplossing in de kamer, om de verbindingspotentieel tussen de pipet en badoplossingen te minimaliseren.Stel vervolgens de spanningsklemversterker in op de huidige klemmodus. Na het tenietdoen van het initiële compensatiepotentieel, meet u de veranderingen in spanning die worden veroorzaakt door de stroomsnelheden te variëren. Om te controleren of de veranderingen in spanning vloeistof-metaal knooppunt mogelijkheden zijn, opnieuw onderzoeken van het effect van de vloeistofstroom op de kruising potentieel, met behulp van de agarose zout brug tussen het bad oplossing en de referentie-elektrode.Met de resultaten van de veranderingen in het vloeistof-metaal knooppunt potentieel, trek de functie potentiële stroomsnelheid relaties, en schat de verzadigende waarde van knooppunt potentiële verschuiving door de supra-vloeistof stroomsnelheid. Verander vervolgens de chlorideconcentratie in de badvloeistof en trek de relatie met de chlorideconcentratie aan. Houd er rekening mee dat de vloeistofsnelheid constant en voldoende hoog moet zijn om de daling van de chlorideconcentratie tot die van de aangrenzende zilverzilvere chloridereferentieelektrode te voorkomen.Schat uit de twee relatiecurven de veranderingen in de chlorideconcentratie van de gemeten verbindingspotentieelverschuiving. VDCC-L stromen werden opgenomen in de enzymatisch verspreide rat mesenteriale arteriële myocyten, met nystatine geperforeerde patch-clamp opname. Met agarose kaliumchloride brug, de kruising potentieel tussen de referentie-elektrode en badoplossingen kan worden geminimaliseerd, en de vloeistofstroom verhoogde de VDCC-L stroom spanning onafhankelijk.Echter, toen de zilverzilvere chloride referentieelektrode rechtstreeks was aangesloten op de badvloeistof, zonder een agarose kaliumchloridebrug, verschoof de IV-relatie in aanwezigheid van vloeistofstroom naar rechts, vergeleken met die van de VDCC-L-stromen onder een statische toestand. De vloeistofstroom-geïnduceerde toename van Kerr 2.1 stromen, die werden geregistreerd in rat basofiele leukemiecellen met de agarosebrug, kan worden verklaard door het ongestoorerde laageffect. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in de over-elektrofysiologie.Dus het is voor de regulering van de vloeistofstroom in de ionenkanaalstromen. In termen van elektrochemische verschijnselen, in de ongestedte grenslaag aan het celmembraanoppervlak.

measurement-ion-concentration-unstirred-boundary-layer-with-open

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Membraaneiwit functie wordt geregeld door de celmembraan lipide samenstelling. Deze video-artikel wordt beschreven hoe u een patch met bilaag pleister elektroden, evenals het gebruik van gramicidine kanalen als verslaggevers van veranderde membraan eigenschappen te vormen.

Single Molecule methoden voor monitoring van veranderingen in bilaag elastische eigenschappen

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.

Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes

Dit manuscript beschrijft hoe intacte dorsale wortelganglia voor patch clamp-opnames kunnen worden voorbereid. Deze voorbereiding behoudt de micro-omgeving voor neuronen en satellietgliacellen, waardoor de fenotypische en functionele veranderingen die worden gezien bij gebruik van gedissocieerde DRG-neuronen, worden vermeden.

Patch Clamp Recordings op intacte ganglia van volwassen ratten

Leer hoe je ionconcentratie meet in de ongemengde grenslaag met open patch-clamp pipet. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van vloeistofstroommetingen voor elektrofysiologisch onderzoek.

Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow (Video) | JoVE Journal

Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Meer video's verkennen