Name: Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Leer een protocol om axonale groeiconusinstorting te visualiseren bij muizeneuronen na amyloïde-β behandeling. Deze methode helpt onderzoekers vroege pathologische mechanismen van Alzheimer te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door onderzoekssubsidies uit JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan en Kobayashi farmaceutische Co., Ltd., Japan.

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren in de Sugitani Campus van de Universiteit van Toyama en goedgekeurd door het Comité voor Animal Care en gebruik van proefdieren in de Sugitani Campus van de Universiteit van Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. ineenstorting Assay
<ol><li>Poly-D-lysine coating<ol>
<li>8-well cultuur dia's met 400 μL van 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) jas in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en hen bij 37 ° C na een nacht bebroeden.</li>
		<li>Verwijder de PDL-oplossing en was de putjes goed 3 keer met gedestilleerd water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neuron cultuur24<ol>
<li>Gehakt vers geïsoleerde cerebrale cortices van embryonale dag 14 (E14) ddY muizen met microscissors in neuron kweekmedium dat 12% paard serum, 0,6% glucose en 2 mM L-glutamine (medium A). Voeg geen antibiotica. Opmerking: In dit protocol, de ddY muis wordt gebruikt. Dit is een outbred soort gebruikte in Japan. Dit protocol neuron cultuur kan ook worden toegepast voor rat corticale neuronen7,25.</li>
		<li>Centrifugeer de weefsels bij 87 x g gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant. Vervolgens naar de pellet, voeg toe 2 mL 0,05% trypsine en incubeer gedurende 15 minuten bij 37° C. Meng door te tikken op elke 5 min.</li>
		<li>Voeg 4 mL medium A en mix door te onttrekken.</li>
		<li>Centrifugeer de weefsels bij 178 x g gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en Incubeer de weefsels met 600 U/mL DNase ik en 0,3 mg/mL soja trypsine remmer ontbonden in PBS gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Meng door te tikken op elke 5 min.</li>
		<li>Voeg na incubatie, 4 mL medium A en mix door te onttrekken.</li>
		<li>Centrifugeer de weefsels bij 178 x g gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Na het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Voeg 4 mL medium A en triturate van de weefsels met een gepolijste Pipet van Pasteur.</li>
		<li>Filter de triturated weefsels met een maaswijdte van 70 µm porie-grootte. Bereken de dichtheid van cellen met een hemocytometer na filtratie.</li>
		<li>Cultuur de cellen in de 8-well cultuur schuif op 0,8 x 104 cellen per putje met medium A en houden hen in een incubator CO2 met een bevochtigde sfeer van 10% CO2 bij 37 ° C.</li>
		<li>Na 4 uur van kweken, vervangt u het kweekmedium aan één met 2% toeslag voor neuronale cultuur, 0,6% glucose en 2 mM L-glutamine (medium B). Opmerking: De zuiverheid van neuronen was ongeveer 75%, zoals eerder beschreven26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instorting assay27<ol>
<li>Los commercieel verkregen full-length amyloïde β1-42 (Aβ1-42) in gedestilleerd water met een concentratie van 0,5 mM en Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 dagen. Na de incubatie, bewaren de geaggregeerde Aβ1-42-oplossing in een vriezer van-30 ° C tot gebruik. Opmerking: Deze incubatie is nodig voor aggregatie en toxiciteit van Aβ27,28,29,30.</li>
		<li>Na 4 dagen van neuronale cultuur, behandelen de putjes met 100 μl van het nieuwe medium B, geaggregeerde bevattende 0,5 μM Aβ1-42 of voertuig oplossing (gedestilleerd water) gedurende 1 uur. Opmerking: Effecten van Aβ1-42 waren dosis-dependently verhoogd van 0,1 tot 5 μM, en 0,5 μM zoals eerder beschreven27bedroeg. Vergelijkbare resultaten kunnen worden waargenomen wanneer door Aβ1-42 behandeling voor 1 h na 3 dagen van neuronale cultuur31.</li>
		<li>Verwijder het kweekmedium en onmiddellijk het herstellen van de neuronen met 4% paraformaldehyde met 4% sacharose in PBS gedurende 1 uur bij 37 ° C op een hete plaat.</li>
		<li>Na fixatie, wassen van de neuronen 3 keer met PBS en monteer ze met een waterige montage medium. Droog het medium van de montage bij 4 ° C voor 2-4 dagen.</li>
		<li>Het hele gebied (7,8 x 9 mm2) vastleggen van elk putje met een 20 X droge objectief op een omgekeerde Microscoop.</li>
		<li>Classificeren de langste neurites van elk neuron in fase 3 of 4 als axonen, als eerder beschreven32,33.</li>
		<li>Classificeren van groei kegels volgens de volgende criteria: 1) axonale groei kegels ontbreekt lamellipodia of 2) bezitten van minder dan drie filopodia worden beschouwd als samengevouwen groei kegels, zoals eerder beschreven17. Opmerking: Gezonde groei kegels worden gescoord als 0 punt; samengevouwen groei kegels zijn als 1 punt scoorde. Leiden tot ineenstorting scores worden berekend voor elke behandeling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. amyloïde β immunokleuring
<ol><li>Cultuur muis corticale neuronen voor 3 dagen, zoals beschreven in stap 1,2.</li>
	<li>Behandelen met geaggregeerde Aβ1-42 (5 μM) of een voertuig gedurende 4 uur bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .</li>
	<li>Zonder het verwijderen van het medium, voeg een gelijk volume 4% paraformaldehyde met 4% sacharose in PBS aan elk putje en behouden van de cultuur bij 37 ° C op een hete plaat voor 5 min.</li>
	<li>Vervang de oplossing met 400 μL van 4% paraformaldehyde met 4% sacharose in PBS en handhaven bij 37 ° C op de hete plaat voor 1 h. Dit protocol fixatie werd vanaf een vorige verslag34gewijzigd.</li>
	<li>Wassen van de neuronen 3 keer met PBS.</li>
	<li>Blok met 5% normale geit serum in PBS.</li>
	<li>De neuronen met muis anti-amyloid β immunoglobuline G (IgG) (1:50) en 1% bovien serumalbumine in PBS bij 4 ° C na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Wassen van de neuronen 3 keer met PBS.</li>
	<li>Incubeer de neuronen met een fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam (1:400) en 1% bovien serumalbumine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
	<li>Wassen van de neuronen 3 keer met PBS en bevestig ze met een waterige montage medium.</li>
	<li>Fluorescentie beelden en heldere veld beelden met schuine verlichting vangen met behulp van een 40 X droge objectief op omgekeerde Microscoop B.</li>
</ol>3. axonale immunokleuring27
<ol><li>De neuronen 3 keer met PBS na gekweekte neuron fixatie, wassen, zoals beschreven in stap 1.3.3.</li>
	<li>Incubeer de neuronen met muis anti-tau-1 IgG (1:500), konijn anti-microtubulus geassocieerde eiwit 2 (MAP2) IgG (1:500) in normale geit serum van 5% en 0,3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol in PBS bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Wassen van de neuronen 3 keer met PBS.</li>
	<li>Incubeer de neuronen met fluorescentie-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:400) en 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol in PBS bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
	<li>Wassen van de neuronen 3 keer met PBS en monteren met behulp van een waterige montage medium.</li>
	<li>Fluorescentie en differentiële interferentie contrast (DIC) beelden vastleggen met behulp van een droge objectief van 20 × op omgekeerde Microscoop A.</li>
</ol>4. levende cel Imaging27
<ol><li>Jas gerechten op basis van glas met 500 μL van PDL (5 μg/mL), zoals beschreven in stap 1.1.1. Opmerking: In dit protocol, zelfgemaakte glas gebaseerde gerechten werden gebruikt. Verkrijgbare glas gebaseerde gerechten kunnen ook worden gebruikt voor levende imaging. Zelfgemaakte glas gebaseerde gerechten bereid waren als volgt: 1) Maak een gat van ongeveer 1.4 mm diameter in het midden van een 35-mm-schotel met een hand punch, en 2) Bevestig een glazen dekglaasje aan (diameter van 22 mm) aan de achterkant van de schotel met silicone.</li>
	<li>Spoel de platen met gedestilleerd water, zoals beschreven in stap 1.1.2, en cultuur van de corticale neuronen in de schotel op basis van glas in 3 x 104 cellen/schotel met middellange A, zoals beschreven in stap 1,2.</li>
	<li>Na 4 dagen van de cultuur van de cel, vervangt het medium door 2 mL nieuw medium B, en de overdracht omgekeerde de schotel aan Microscoop A. behouden de cultuur in een bevochtigde sfeer van 10% CO2 bij 37 ° C.</li>
</ol>5. endocytose Experiment
<ol><li>Cultuur de muis corticale neuronen zoals beschreven in stap 1,2.</li>
	<li>Vier dagen later, wordt het medium vervangen door 100 μl van nieuw medium B met 20 μM fluorescentie membraan sonde voor 1 min.</li>
	<li>Voeg 1 μL van 0,05 mM geaggregeerde Aβ1-42 (laatste 0,5 μM) of voertuig (gedestilleerd water) oplossing en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 20 min.</li>
	<li>Verwijder het medium en was de putjes goed tweemaal met medium B dat voorverwarmde tot 37 ° C. geweest</li>
	<li>Repareren, wassen en monteren van de neuronen, zoals beschreven in stappen 1.3.3 en 1.3.4.</li>
	<li>TL en DIC beelden met een 63 X olie objectief op omgekeerde Microscoop A. vastleggen</li>
	<li>Kwantificeren van de dichtheid van de fluorescentie membraan sonde-positieve gebied in elke gezonde groei kegel met behulp van de software van een afbeelding.</li>
</ol>6. Gene transfectie
<ol><li>Corticale neuronen bereiden zoals beschreven in stap 1,2. Centrifugeer de neuronen bij 178 x g gedurende 3 minuten na het voltooien van de stappen 1.2.1 aan 1.2.10.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg 4 mL Ca2 +-gratis en Mg2 +-vrije Hanks evenwichtige zout oplossing (CMF-HBSS), en meng door pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 178 x g gedurende 3 minuten.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen, Voeg 4 mL CMF-HBSS en meng door pipetteren. Vervolgens berekent de celdichtheid, zoals beschreven in stap 1.2.10.</li>
	<li>5 x 106 cellen overbrengen in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 1.677 x g gedurende 1 minuut.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen, voeg 100 μl van transfectie oplossing met supplement en 3 μg van DNA plasmide codering EGFP of EGFP-AP180 C-terminus, en meng door pipetteren.</li>
	<li>De bovenstaande oplossing (stap 6.6) overbrengen naar een gecertificeerde cuvette en transfect met een electroporator, volgens de fabrikant protocol.</li>
	<li>Onmiddellijk na de transfectie, voeg 500 μL van medium A in de meetcel en breng de oplossing over in een tube 1.5-mL met een gecertificeerde pipet. Vervolgens berekent de celdichtheid, zoals beschreven in stap 1.2.10.</li>
	<li>Cultuur van de cellen in een dia 8-well cultuur op 0,8 x 104 cellen/well, zoals beschreven in stappen 1.2.11 en 1.2.12.</li>
	<li>Na 4 dagen van celkweek, voert u een ineenstorting test zoals beschreven in stap 1.3.</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Het protocol beschreven in deze studie ingeschakeld de waarneming van vroege verschijnselen in axonale groei kegels na behandeling van de Aβ1-42. Aβ1-42 geïnduceerde endocytose in axonale groei kegels binnen 20 min en groei kegel ineenstorting werd waargenomen binnen 1 uur van behandeling. Deze endocytose was waarschijnlijk gemedieerd door clathrin. Met behulp van dit protocol, werd de remming van clathrin-gemedieerde endocytose bevestigd om te voorkomen dat Aβ1-42-geïnduceerde groei kegel ineenstorting en axonale degene...

Amyloid-β (Aβ) deposito's zijn te vinden in de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer (AD) en worden beschouwd als een kritische oorzaak van AD1 die verstoren neuronale netwerken, wat leidt tot geheugen waardeverminderingen,2,,3,4. Veel klinische drugkandidaten hebben aangetoond dat effectief voorkomen amyloid-β (Aβ) productie of verwijderen Aβ deposito's. Echter, hebben geen geslaagd in de verbetering van de geheugenfunctie in AD patiënten5. Aβ is al gestort in de hersenen voorafgaand aan de inleiding van geheugen waardeverminderingen6; afnemende Aβ niveaus in de hersenen van patiënten kunnen exposerende geheugen waardeverminderingen dus ondoeltreffend. Aβ afzetting is aanwezig in preklinische AD patiënten; deze patiënten presenteren echter zelden met neuronale degeneratie en geheugen tekorten6. Er is een tijdsverschil tussen Aβ afzetting en geheugen waardeverminderingen. Daarom is een belangrijke strategie voor de preventie van AD blokkeren Aβ toxiciteit signalering tijdens de vroege stadia van AD, voorafgaand aan de ontwikkeling van geheugen tekorten. Aβ afzetting induceert axon degeneratie7,8,9,10,11,12,13, hetgeen tot een verstoring van leiden kan neurale netwerken en permanente schending van de geheugenfunctie. Vele studies hebben onderzocht de mechanismen van Aβ toxiciteit; de ontaarde axonen van AD muizen hersenen hebben bijvoorbeeld aangetoond dat toegenomen autophagy14. Calcineurin-activering is gemeld als een mogelijk mechanisme van axonale degeneratie Aβ-geïnduceerde15; de directe trekker van axonale degeneratie blijft echter onbekend.
Deze studie richt zich op de ineenstorting van axonale uitgangen groei kegels genoemd. De ineenstorting van axonale groei kegels kan worden veroorzaakt door axonale groei insectenwerende middelen, zoals semaphorin-3A en ephrin-A516,17,18,19,20. Instorten-achtige Dystrofe axonale uitgangen zijn waargenomen in de hersenen van AD patiënten21,22. Daarnaast kan een gebrek aan groei kegel werking axonale degeneratie23provoceren. Het is echter onbekend of Aβ induceert groei kegel ineenstorting. Deze studie presenteert daarom een nieuw protocol om te observeren van de vroege gevolgen van Aβ in gekweekte neuronen en onderzoeken Aβ-geïnduceerde groei kegel ineenstorting.

<table><tbody><tr><td>ddY muizen</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eight-well cultuurschuif</td><td>Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>poly D lysine</td><td>Wako</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurmedium, Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Huis serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsine</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>Sojaboon trypsine inhibitor</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Filter met 70 &micro;m maaswijdte, celstrainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid &beta;1-42</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&nbsp;</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Waterige montage medium, Aqua-Poly/Mount</td><td>polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop A</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>Verbonden met AxioCam MRm, verwarmingseenheid XL S, CO2 Module S1, en TempModule S1</td></tr><tr><td>Objectief Plan-Apochromat 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>Objectief Plan-Apochromat 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>Objectief, CFI Plan Apo Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anti-tau-1 IgG</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloïde &beta; antilichaam</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>clone 11A1</td></tr><tr><td>normaal geitenserum</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>runde serum albumine</td><td>Wako</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-octylfenoxypolyethoxyethanol</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>geiten anti-muis IgG geconjugeerd met AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>geiten anti-konijn IgG geconjugeerd met AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>NISSIN</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr><td>dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>35 mm schotel</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Silicone RTV</td><td>Shin-Etsu</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>hand punch</td><td>Roper Whitney</td><td>No. XX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemembraan sonde, FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- en Mg2+-vrije Hanks' gebalanceerde zout oplossing</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie oplossing, Nucleofector oplossing</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator, Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop B</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Beeld software, ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

visualiseren van axonale groei cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-β (Aβ) zorgt ervoor dat geheugen bijzondere waardeverminderingen in de ziekte van Alzheimer (AD). Hoewel therapeutics is aangetoond dat het verminderen Aβ niveaus in de hersenen van patiënten van de advertentie, verbeteren dit geheugen functies niet. Omdat Aβ in de hersenen voor het uiterlijk van geheugen waardeverminderingen aggregaten, kan gericht op Aβ inefficiënt voor de behandeling van AD-patiënten die al geheugen tekorten vertonen worden. Dus moet stroomafwaarts signalering door Aβ afzetting geblokkeerd worden vóór AD ontwikkeling. Aβ induceert axonale degeneratie, leidt tot verstoring van de neuronale netwerken en geheugen waardeverminderingen. Hoewel er veel studies op de mechanismen van toxiciteit Aβ, is de bron van Aβ toxiciteit onbekend. Om te helpen bij het identificeren van de bron, stellen wij voor een nieuw protocol dat gebruikmaakt van microscopie, gene transfectie en levende cel imaging voor het onderzoek naar vroege wijzigingen veroorzaakt door Aβ in axonale groei kegels van beschaafde neuronen. Dit protocol is gebleken dat Aβ clathrin-gemedieerde endocytose in axonale groei kegels gevolgd door groei kegel ineenstorting geïnduceerde, waaruit blijkt dat de remming van endocytose Aβ toxiciteit voorkomt. Dit protocol nuttig zal zijn in het studeren van de vroege effecten van Aβ en kan leiden tot meer efficiënte en preventieve behandeling van AD.

In dit protocol was Aβ1-42 geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 7 dagen vóór gebruik, omdat de incubatie van Aβ1-42 moest worden voor de productie van giftige vormen27,28,30,35. Na deze incubatie, werden geaggregeerde vormen van Aβ waargenomen (figuur 1A). Er werd gemeld dat soortgelijke incubatie van Aβ1-42 fibril devormvan Aβ<sup clas...

Hier wordt een protocol bij het onderzoeken van de vroege effecten van amyloid-β (Aβ) in de hersenen gepresenteerd. Dit toont aan dat Aβ clathrin-gemedieerde endocytose en ineenstorting van axonale groei kegels induceert. Het protocol is nuttig bij het bestuderen van de vroege effecten van Aβ op axonale groei kegels en preventie van de ziekte van Alzheimer kan vergemakkelijken.

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ziekte van Alzheimer onderzoek, met name de vroege gebeurtenissen die betrokken zijn bij de groei kegel instorten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om het mogelijk te maken om axonale groeikegels onmiddellijk na amyloïde bètabehandeling te visualiseren en te analyseren. Begin met het gebruik van micro-schaar om vers geïsoleerde cerebrale cortices gehakt van embryonale dag-14 muizen in neuron cultuur medium zonder antibiotica.Verzamel de weefsels en centrifugeren de weefsels op 87G gedurende drie minuten. Na centrifugatie, verwijder de supernatant en voeg twee milliliter van 0,05% trypsine aan de pellet. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en meng door elke vijf minuten te tikken.Voeg na 15 minuten vier milliliter medium A toe om de trypsine te neutraliseren en meng door te tikken. Dan centrifugeren de weefsels op 178 keer G gedurende drie minuten. Na het verwijderen van de supernatant, voeg DNAse en soja trypsin remmer oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius met het mengen van elke vijf minuten als voorheen.Wanneer de incubatietijd is verst

visualizing-axonal-growth-cone-collapse-early-amyloid-effects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video demonstrates the generation of a neuronal injury model in mouse primary cerebellar granule neurons. It outlines the steps involved in inducing neuronal injury using NMDA, an excitatory neurotransmitter receptor agonist, and glycine, a co-agonist. NMDA and glycine bind to specific neuronal receptors, causing their overstimulation and resulting in a massive intracellular calcium influx, which leads to neuronal cell damage and death.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video demonstrates an in vitro assessment of neuronal growth cone collapse by amyloid-β (Aβ) aggregates. Treating the neurons with Aβ aggregates causes cytoskeletal destabilization, leading to the collapse of growth cones at the tip of the axons. The treated cells are compared with control cells to assess the extent of growth cone collapse.

In Vitro Assessment of Aggregated Amyloid-&beta; on Neuronal Growth Cone Collapse

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hier presenteren we een protocol voor directe stereotactische herseninfusie van amyloid-beta. Deze methodologie biedt een alternatief in vivo muismodel om de kortetermijneffecten van amyloid-beta op hersenneuronen aan te pakken.

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Leer een protocol om axonale groeiconusinstorting te visualiseren bij muizeneuronen na amyloïde-β behandeling. Deze methode helpt onderzoekers vroege pathologische mechanismen van Alzheimer te begrijpen.

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Meer video's verkennen