Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ziekte van Alzheimer onderzoek, met name de vroege gebeurtenissen die betrokken zijn bij de groei kegel instorten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om het mogelijk te maken om axonale groeikegels onmiddellijk na amyloïde bètabehandeling te visualiseren en te analyseren. Begin met het gebruik van micro-schaar om vers geïsoleerde cerebrale cortices gehakt van embryonale dag-14 muizen in neuron cultuur medium zonder antibiotica.

Verzamel de weefsels en centrifugeren de weefsels op 87G gedurende drie minuten. Na centrifugatie, verwijder de supernatant en voeg twee milliliter van 0,05% trypsine aan de pellet. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en meng door elke vijf minuten te tikken.

Voeg na 15 minuten vier milliliter medium A toe om de trypsine te neutraliseren en meng door te tikken. Dan centrifugeren de weefsels op 178 keer G gedurende drie minuten. Na het verwijderen van de supernatant, voeg DNAse en soja trypsin remmer oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius met het mengen van elke vijf minuten als voorheen.

Wanneer de incubatietijd is verstreken, voeg vier milliliter medium A.Mix en centrifuge als voorheen. Voeg na het verwijderen van de supernatant vier milliliter medium A toe en trituraat de weefsels met een gepolijste Pasteur pipet totdat er geen vuil wordt waargenomen. Vervolgens filteren de triturated weefsels met 70-micron porie-sized mesh.

Tel na filtratie de cellen met een hemocytometer en bereken de celdichtheid. Pipette 0.8 keer 10 aan de vierde cellen in middel A in elke put van een acht-goed cultuurdia. Dan incubeer in een bevochtigde atmosfeer van 10%CO2 bij 37 graden Celsius.

Na vier uur kweken, verander de cultuur medium tot medium B.De zuiverheid van neuronen met behulp van deze methode is ongeveer 75%Begin deze test ten minste een week van tevoren door het openen van een verse flacon van commercieel verkregen full-length A beta 42 en het oplossen van de inhoud in steriel, gedestilleerd water tot een concentratie van 0,5 millimolar. Incubeer zeven dagen lang bij 37 graden Celsius om aggregatie en toxiciteit te veroorzaken. Bereid aliquots van geaggregeerde A beta 1-42 en op te slaan op min 80 graden Celsius tot gebruik.

Behandel op dag vier van de neuronale cultuur de putten met 100 microliter van 0,5 micromolar geaggregeerd Een bèta 1-42 of voertuigoplossing in medium B gedurende een uur zoals eerder aangetoond. Nadat het uur is verstreken, verwijder het kweekmedium en bevestig onmiddellijk de neuronen met 4%paraformaldehyde met 4% sacharose in PBS gedurende een uur bij 37 graden Celsius op een hete plaat. Fixatie is het belangrijkst omdat het behoud van de vorm van groeikegels van cruciaal belang is voor dit protocol.

Na fixatie, was de neuronen drie keer met PBS. Dan na het verwijderen van de kamer, monteer de neuronen met een waterige montage medium. Droog het montagemedium twee tot vier dagen op vier graden Celsius.

Leg het hele gebied van elke put vast met een 20X droge objectieve lens op een omgekeerde microscoop. Het vastleggen en analyseren van het hele gebied in elke put is belangrijk voor het vermijden van subjectiviteit. Classificeer de langste neurites van elk neuron in fase drie of vier als axonen.

Axonale groeikegels zonder lamellipodia of met minder dan drie filopodia worden beschouwd als ingestorte groeikegels. Een bèta 1-42 oligomers, hier getoond vóór incubatie, aggregaat na zeven dagen incubatie bij 37 graden Celsius. Na behandeling met geaggregeerde A beta 1-42, immunostaining met een antilichaam voor de giftige oligomer van A beta toont positieve kleuring in rood op Een beta 1-42 behandeld neuronen, maar niet voertuig behandeld neuronen.

De vroege verschijnselen veroorzaakt door A beta 1-42 behandeling werden geanalyseerd na vier dagen in de cultuur. Geïdentificeerde axonen werden als zodanig bevestigd door positieve immunostaining voor de axonale marker tau-1 getoond in rood en negatief immunostaining voor de dendritische marker, MAP-2, weergegeven in groen. Na een uur van de behandeling van het voertuig, had de groeikegels lamellipodia en verscheidene filopodia uitgespreid.

Deze werden geïdentificeerd als gezonde groeikegels. Omgekeerd, een uur van A beta 1-42 behandeling leidde tot gekrompen groei kegels, die geen lamellipodia of filopodia ontwikkeld. Deze werden geïdentificeerd als ingestorte groeikegels.

Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de cellen vast te stellen met 4%PFA en 4% sacharose op 37 graden Celsius om my-nor-idge deze fixatie protocol in de beste. Volgens dit protocol kunnen andere methoden zoals live-celbeeldvorming en gentransfectie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wanneer en hoe de axongroeikegels worden ingestort en hoe de ingestorte groeikegels worden hersteld.