Gebruik van Autometallography om te lokaliseren en semi-kwantificeren zilver in walvisachtigen weefsels

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van milieutoxicologie over suborgelverdelingen en concentratie van zware metalen binnen biologische systemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat AMG is een eenvoudig te gebruiken en goedkope methodologie, dat is een waardevolle adjuvans voor het onderzoeken van zware metalen in weefsels. We gebruiken de weefsels van dolfijnen en walvissen om het protocol aan te tonen.

Wij zijn echter van mening dat het protocol kan worden gebruikt in een verscheidenheid van diersoorten. Het demonstreren van de procedure met Wen-Ta Li zal Shun Theng, een clinicus van ons instituut. Begin met het verzamelen van paar-matched lever en nierweefsels voor AMG analyse van een gestrande walvisachtige, en de vaststelling van het weefsel in 10 keer het volume van 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 24 tot 48 uur.

Gebruik vervolgens wegwerp roestvrijstalen microtomebladen om de formaline vaste lever- en nierweefsels te trimmen in twee centimeter bij één centimeter, drie millimeter secties, en plaats zowel lever- als niersecties van hetzelfde individu in dezelfde gelabelde cassettes. Dehydrateer de secties in een weefselprocessor door middel van een reeks van gesorteerde ethanol en xyleen onderdompees, gevolgd door een uur en twee uur paraffine onderdompee onderdompees. Breng na de twee uur durende paraffine-onderdompeling de weefsels over naar de bodems van stalen histologiemallen en veranker de uitgedroogde weefselmonsters met verse gesmolten paraffine.

Chill de formaline vaste, paraffine-embedded weefsel blokken op een koude plaat, totdat de paraffine stolt, en trim elk blok op het microtometje totdat het weefsel oppervlak wordt blootgesteld. Chill de monsters bij min 20 graden Celsius gedurende 10 minuten, en het verkrijgen van vijf micrometer weefsel secties op het microtome. Met behulp van pincet en borstels, til de linten van weefsel sectie als ze worden verworven, en drijven ze op het oppervlak van een 45 graden Celsius dubbel gedestilleerd waterbad, totdat ze kunnen worden gescheiden, en plaats op individuele microscoop dia's.

Plaats vervolgens de dia's een uur lang op een glijbaanwarmer, op 60 graden Celsius. Plaats vervolgens de dia's in diarekken en deplamiseer de secties in drie verschillende kleurplaten met 200 tot 250 milliliter zuivere niet-xyleen voor acht-vijf-en drie minuten incubaties. Hydrateer de gedepareerde monsters in verschillende kleuringsschotels van gesorteerde ethanoloplossingen, gevolgd door spoelen in dubbel gedestilleerd water.

Spoel de secties een keer in PBS aangevuld met 5%Triton X 100, meerdere malen in PBS alleen, en een keer in vers dubbel gedestilleerd water gedurende 30 seconden per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, label elk monster met 300 microliters van gemengde zilveren enhancement kit oplossing, voor niet meer dan 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de glijbanen met dubbel gedestilleerd water, en counter-vlek de secties in 300 microliter van hematoxylin per glijbaan, gedurende 10 seconden.

Was de glijbanen met stromend leidingwater. Droog ze en monteer de secties met montagemedium. Leg vervolgens 10 willekeurige histologische beelden van elke weefselsectie vast, onder de 40X-doelstelling van een lichtmicroscoop.

Als u de autometallografie of AMG- positiviteit van de voorbeelden wilt analyseren, opent u de afbeeldingen in een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en selecteert u de stapel afbeelding, type en RGB om de eerste afbeelding op te splitsen in de rode, blauwe en groene kleurkanalen. Selecteer in het blauwe kanaal afbeelding, aanpassen en drempelwaarde om het percentage van het gebied te meten met AMG-positieve signalen in elk beeld, waarbij handmatig de cut-offwaarde voor de drempelwaarde van elke afbeelding wordt aangepast op basis van de aanwezigheid van fout-positieve gebieden in de kernen of rode bloedcellen. Klik op analyseren en stel metingen in en controleer de gebiedsfractie om op te geven dat de gebiedsfractie wordt geregistreerd.

Klik op analyseren en meten om het positieve percentage van elke histologische beeldpercentagegebiedkolom van het resultaatvenster weer te geven. Om de correlatie tussen de resultaten van inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie en AMG-positieve waarden te evalueren, opent u de juiste grafische software. Maak een nieuw projectbestand en selecteer XY en correlatie.

Voer de resultaten van de inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie en AMG-analyses in, en selecteer analyse en correlatie om de sterkte van de associatie tussen de resultaten van de analyse door Pearson correlatieanalyse te analyseren. Selecteer in de parameters, niet-lineair regressievenster, een ander regressiemodel op de fit-pagina en selecteer de vergelijkingsmethoden op de vergelijkingspagina. Neem de extra som van vierkanten F-test, en Akaike's Information Criterium.

Selecteer volgens de resultaten van de vergelijkingsmethoden een relatief geschikt regressiemodel in de histologische zilvertest en gebruik de test om de zilverconcentraties van de walvisachtige lever- en nierweefsels met onbekende zilverconcentraties te schatten. AMG-positieve signalen omvatten variably-sized, bruin tot zwarte korrels in het cytoplasma van hepatocyten en Kupffer cellen, en af en toe amorf, goudgeel tot bruin AMG-positieve signalen in het lumen en keldermembraan van sommige proximale nierbuisjes. Er is een positieve correlatie tussen de resultaten van inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie en AMG-positivity waarden in de geanalyseerde lever- en nierweefsels, met een voorkeurs lineaire regressie door de oorsprong, volgens de extra som van de vierkanten F-test, en Akaike's Informatiecriterium.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de AMG-methode is een adjuvans methode, en moet worden gebruikt met andere specifieke methode, zoals ICPMS, voor het toezicht op de werkelijke samenstelling van zware metalen in weefsels.