Name: Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer longitudinale intravital imaging van thymocyten door laser scanning microscopie in muizen. Deze methode volgt progenitorrecrutering en T-cel egressie in vivo voor inzicht in auto-immuniteit en immuundeficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) en R21ES025673 (AC), en door de beste/2015/043-subsidie (Consellería de Educació, cultura ik esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanje) (EO). Auteurs bedanken het team van de verzonden van de Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanje en Alberto Hernandez at Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanje voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.

De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami goedgekeurd alle experimenten volgens IACUC richtlijnen.
1. isolatie en trimmen van pasgeboren Thymi
<ol><li>Bereiden alle reagentia en instrumenten door autoclaaf of andere methoden, steriele omstandigheden te waarborgen.</li>
	<li>Uitvoeren om te minimaliseren van verontreinigingen, alle chirurgische ingrepen onder de motorkap van een laminaire flow.</li>
	<li>Voorafgaand aan euthanizing donor muizen, vul een steriele schotel van 60 mm met steriele prechilled 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en plaats deze op het ijs. Het zal worden gebruikt voor het spoelen en opslaan van de verwijderde thymi van donor muizen voorafgaand aan de transplantatie.</li>
	<li>Ga verder met het euthanaseren van pasgeboren donor muizen door onthoofding, overeenkomstig ethische richtsnoeren.</li>
	<li>Plaatst u de muisaanwijzer op steriel absorberend keukenpapier in een dorsale rechtop en spray, en later veeg, de buik van de muis met 70% ethanol.</li>
	<li>De borstholte bloot doordat een oppervlakkige V-vormige insnijding op het niveau van de onderbuik en snijd de huid met een paar rechte 10 cm ontrafeling van schaar na een ventral midline te verlaten een opening van ongeveer 0,5-1 cm op de borstniveau. Vouw de huid over elke kant van de borst bloot van de borstholte.</li>
	<li>Maak twee dieper 0,5-1 cm zijdelingse insnijdingen door middel van het middenrif en de ribbenkast met hetzelfde type schaar voor toegang tot de superieure mediastinum in de voorste borstholte. De zwezerik moet worden weergegeven als twee bleke kwabben pal boven het hart.</li>
	<li>Plaats een aantal gebogen pincet onder de thymus en trek verticaal om op te halen de volledige orgel. Voorkomen dat de foldback van de ribbenkast met een paar pincet. Indien nodig kunt fijne pincet zorgvuldig scheuren het bindweefsel rondom het orgel zonder het verstoren van de capsule voor het extraheren van het orgel. Opmerking: Deze stap wordt vergemakkelijkt met behulp van een ontleden scope.</li>
	<li>De geïsoleerde zwezerik onderdompelen in koude steriele 1 x PBS (pH 7.4) eerder weergegeven in een steriele schotel van 60 mm, en snijd de bindweefsel landengte met een scalpel te scheiden van de serie lobben. Verwijder eventuele puin uit de schotel zonder nadelige gevolgen voor de capsule. Om te minimaliseren van de tijd thymi zijn blootgesteld, trim tijm lobben vlak voor implantaat. Opmerking: Elke geïsoleerde pasgeboren thymus zal meestal zes segmenten van ongeveer 1 mm breed voor een maximum van drie host muizen maken wanneer het ontvangen van implantaten in beide ogen.</li>
	<li>Herhaal stap 1.4-1.9 voor elke donor muis. Isoleren om te minimaliseren van de tijd thymi zijn blootgesteld, een thymus tegelijk.</li>
</ol>2. thymus implantatie in de voorste kamer van het oog
<ol><li>Voorafgaand aan de transplantatie, tag en weeg elke ontvangende muis.</li>
	<li>Gebruik een dosis tussen 1-2% van de isofluorane dampen te anesthetize de ontvangende muis. Zorg ervoor u juiste afstomping door het ontbreken van reflex volgende teen snuifje voordat de chirurgische ingreep.</li>
	<li>Met zwezerik segmenten transplantatie als volgt:<ol>
<li>Plaatst u de muisaanwijzer in een ligfiets zijligging kant dus dat ene oog boven ligt rechtstreeks blootstaan aan de lens van het ontleden toepassingsgebied.</li>
		<li>Één van de geïsoleerde serie lobben liggen in de koude 1 x PBS (pH 7.4) accijnzen-60 mm schotel gevuld in stukjes met maximaal 1 mm breedte voor implantaat. Een zig-zag patroon om ervoor te zorgen dat elk segment serie cortex en medulla bevat volgen. Gebruik vannas schaar voor trimmen volgens richtlijnen in figuur 1A. Opmerking: Trimmen van de thymus moet gebeuren vlak voor het implantaat te optimaliseren weefsel engraftment.</li>
		<li>Beginnend in de basis van het hoornvlies overeenkomt met het chirurgische gebied, voeren de tip van een 40 mm G18 naald te maken een kleine snede in externe hoornvlies lagen zodat de ontleden schaar tip kan worden ingevoerd.</li>
		<li>Het maken van een 5-10 mm flank incisie direct rond de basis van het hoornvlies met behulp van vannas schaar terwijl de hoornvlies-opening stevig om te voorkomen dat opnieuw verzegelen. Gebruik pincet met platte uiteinden om weefselschade te voorkomen.</li>
		<li>Pak de gesneden hoornvlies epitheel en bloot de opening door het hoornvlies met een paar van flat-ended verlostang terwijl het duwen van een serie segment door de opening. Natte het oog met steriele 1 x PBS (pH 7.4) of kunstmatige tranen zo nodig ter voorkoming van uitdroging van de weefsels, totdat de manipulatie voltooid is.</li>
		<li>Druk zachtjes op het oppervlak van het oog de geïntroduceerde weefsel segment aan een laterale positie ten aanzien van de leerling voor het behoud van de eye´s functie glijden. Ervoor zorgen dat de prothese op een locatie tegenover het oog openen posterieure om interferentie te voorkomen met beeldvorming ligt door hazing.</li>
		<li>Met de hulp van platte Tang, drukt u op stevig, voor ongeveer 3-5 s, de twee zijden van de cornea opening tegen elkaar om zelfsluitende. De operatie vereist geen nieten of naaien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de transplantaten zijn uitgevoerd op beide ogen, zet u de muis over de laterale overkant rechtstreeks bloot het tweede oog aan de ontleden Microscoop lens en herhaal stappen 2.3.2-2.3.7.</li>
	<li>Na de operatie is voltooid, keren de muis naar een lege kooi voorverwarmde met een warmte lamp.</li>
	<li>Zorg ervoor dat elke getransplanteerde muis herwint volledige mobiliteit en bewustzijn alvorens het te plaatsen in een kooi gedeeld met andere dieren. Dit vindt meestal plaats binnen 1 uur na de operatie.</li>
	<li>Na transplantatie, behandelen van de muizen met pijnstillers, zo nodig, en de muizen voorzien van paracetamol met een concentratie van 1,6 mg/mL in het drinkwater.</li>
	<li>Herhaal stap 2.2-2.9 voor elke geadresseerde muis.</li>
	<li>Post-operatieve dierlijke activiteiten controleren, alsmede het uiterlijk van de geïmplanteerde ogen te detecteren van mogelijke gezondheidscomplicaties.</li>
</ol>3. confocal beeldvorming van geïmplanteerde Thymi met behulp van 3D één foton fluorescentie confocale microscopie
<ol><li>Anesthetize de geadresseerden muis met behulp van een dosis tussen 1-2% van de isofluorane dampen. Juiste afstomping zorgen door het ontbreken van reflex volgende teen snuifje voordat de imaging procedure</li>
	<li>Plaats de muis op een vaste fase Microscoop platform in een kant ligfiets zijligging dus dat ene oog boven ligt. Een warmte pad is geplaatst op het platform van de Microscoop om constante lichaamstemperatuur van muizen tijdens opnames. Opmerking: Zie aanvullende figuur 1 voor meer informatie.</li>
	<li>Het hoofd van de muis aansluit op een stereotaxic headholder en de knop om te bedwingen van de kop van de muis op een positie van de laterale zijde waardoor directe toegang van de doelstelling van de Microscoop voor het oog houden van de thymus prothese aan te passen.</li>
	<li>Plaats de snuit van de muis in een gasmasker te houden van het dier verdoofd gedurende de gehele procedure. Hierdoor is de aanpassing van de isofluorane dampen zo nodig.</li>
	<li>Om te vergemakkelijken de stabilisatie van het oog tijdens opnames terwijl het vermijden van de intrekking van de oogleden, trek terug de oogleden terwijl het oog in de cornea marge met een pincet, die hebben hun tips gedekt door een polyethyleen buis die zijn aangesloten op een Oest-2 stevige cardanische koppeling. Deze regeling toelaat een gestage fixatie van het hoofd en ogen en biedt flexibiliteit zonder verstoring van de doorbloeding in het oog, als eerder beschreven22. Opmerking: Aanvullende cijfers 1B, C Toon de volledige vergadering.</li>
	<li>Voeg een paar druppels van steriele zoutoplossing of kunstmatige tranen als de immersie vloeistof tussen het hoornvlies en de lens, alvorens de Microscoop doelstelling in het oog van de muis te brengen. Opmerking: extra druppels zijn verstrekt over noodzaak gedurende de hele procedure te houden van de Microscoop pad en voorkomen dat oog drogen.</li>
	<li>Eerst lage vergroting (5 X) objectief zoekt u de zwezerik in het veld Microscoop. Schakel over naar een hogere resolutie (10, 20 en 40 X) water onderdompeling dompelen doelstellingen met de lange afstand. Vermijd LSM photodamage en bleken van de serie implantaat door minimale laser macht toe te passen en scannen tijd zoveel mogelijk te verminderen. Dit wordt bereikt met behulp van de resonerende scanner van de Microscoop. Opmerking: De confocal microscoop die we gebruiken is uitgerust met resonant scannen spiegels geschikt voor het verzamelen van beelden bij 25 frames/s. Andere merken hebben hun eigen microscopen met resonant scanners.</li>
	<li>Selecteer de modus van de overname met behulp van de Microscoop software en de startmodus van de resonerende scanner. Vervolgens kiest u de XYZT imaging modus en de overname-instellingen als volgt configureren:<ol>
<li>De Argon laser inschakelen en aanpassen van de macht tot 30% voor fluorescentie excitatie.</li>
		<li>Kies van een laser lijn van excitatie en stel het akoestisch-optische lichtbundel besturingselement voor splitsing (AOBS) voor de verschillende emissie golflengten. Bovendien, om te ontdekken van backscatter en structuur van het weefsel af te bakenen, reflectie detectie gelijktijdig gebruiken. Opmerking: Bij het selecteren van een reeks van kleuren voor excitatie (GFP en RFP), de AOBS is automatisch geprogrammeerd voor directe deze excitatie-lijnen op het model en het doorgeven van de uitstoot tussen hen. Bijvoorbeeld, voor GFP en RFP, gebruiken we smalle reflectie bands voor excitatie licht rond 488 nm en 561 nm, respectievelijk. Dit laat de brede banden voor het verzamelen van uitgestoten fluorescentie fotonen, waardoor de noodzaak voor laser power en overname keer. In de reflectie modus, wordt de AOBS gebruikt als een 50/50 balk splitter om het imago van de gereflecteerde licht in elke golflengte uit de buurt van degene die gebruikt zijn voor de detectie van de emissie van de fluorescentie.</li>
		<li>Verzamelen van de uitstoot bij geselecteerde golflengte, kies een resolutie van 512 x 512 pixels en begin live imaging door op de knop Live , de winst-niveaus aan te passen als nodig (typisch winst is ongeveer 600 V).</li>
		<li>Definiëren van het begin en einde van de z-stack door zich te concentreren op de bovenkant van de serie implantaat en selecteer beginnen, dan verplaatsen naar de laatste vliegtuig dat kan worden gericht in de geïmplanteerde zwezerik en selecteer einde. Gebruik een z-stap grootte van 5 µm. De software zal automatisch het aantal confocal vliegtuigen berekenen.</li>
		<li>Kies het tijdsinterval voor de overname van elke z-stack (meestal 1,5 tot 2 seconden) en selecteer de optie verwerven totdat deze wordt gestopt voor continue imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Druk op de knop Start om te initialiseren.</li>
	<li>Het imago van de transplantaten herhaaldelijk op verschillende tijdstippen van hetzelfde dier herhaalt u stap 3.1-3.9. Opmerking: Als het dier protheses op beide ogen houdt, opnames van beide ogen kunnen worden genomen door stappen te herhalen 3.2-3.9 nadat u bent overgeschakeld van de kant van de verticale positie van het hoofd van de muis.</li>
</ol>

<ol><li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
<li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+find+your+way+through+the+thymus%3A+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li>
<li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+egress+from+the+thymus%3A+Should+I+stay+or+should+I+go%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li>
<li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration%3A+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li>
<li>Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoned+out%3A+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li>
<li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li>
<li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652(2008).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li>
<li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160(2005).</li>
<li>Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development%3A+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li>
<li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).</li>
<li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li>
<li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li>
<li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li>
<li>Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li>
<li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemestry%22%5BJournal%5D)">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege het belang van het rijpingsproces van de T-cel voor individuele immuun competentie4 en de vermoedelijke gevolgen van voorloper cel dynamiek op volwassen T-cellen geproduceerd door de thymus2,3, hebben uitgebreide inspanningen geïnvesteerd om alternatieven te ontwikkelen voor de aanpak van de momentopname klassieke vaste weefsel.
Hoewel weefsel segmenten en andere explantaten duidelijk superieur zijn op h...

Intrathymic differentiatie van de T-cel en T-cel populaties selectie vormen belangrijke processen voor de ontwikkeling en het onderhoud van cel-gemedieerde immuniteit in gewervelde dieren1. Dit proces omvat een complexe opeenvolging van strak georganiseerde evenementen, waaronder de aanwerving van progenitoren uit de bloedbaan, celproliferatie en migratie, differentiële expressie van membraaneiwitten en massale geprogrammeerde celdood voor subsets selectie. Het resultaat is de release van volwassen T-cellen reactieve tot een ruim spectrum van vreemde antigenen tijdens het weergeven van geminimaliseerde reacties op zelf-peptides, welke eind-up koloniseren de perifere lymfoïde organen van de afzonderlijke2,3. Afwijkende thymocyte selectie van het repertoire van de αβTCR leidt tot auto-immune ziekte of onbalans immuun4 die voornamelijk voortvloeien uit gebreken tijdens de processen van de voorloper van de negatieve of positieve selectie, respectievelijk.
Directionele migratie van thymocytes over de zwezerik is intrinsiek op alle stadia van T-cel rijping en het is bedoeld als een reeks van gelijktijdige of opeenvolgende meerdere stimuli, met inbegrip van chemokines, lijm, en de lijm extracellulaire matrix (ECM) eiwit interacties3,5. De studie van vaste weefsels heeft verricht kritische informatie over de patronen van meningsuiting voor de trekkende signalen van de thymocyte in de gedefinieerde serie microenvironments5,6, terwijl ex vivo studies is gebleken dat twee bekende trekkende gedrag van thymocytes in twee histologisch vlakken van het orgel: slow stochastic bewegingen in de cortex en snelle, beperkte beweeglijkheid in de medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. verhoogde trekkende tarieven correleren met serie positieve selectie13 en negatieve selectie wordt geassocieerd met kruipende gedrag ondersteunen de hypothese dat de kinetiek van de reis door de zwezerik juiste bepaalt rijping van de thymocytes. Ondanks hun relevantie blijven de topologie van thymocyte-stromale cellen interacties en de dynamiek van de beweeglijkheid van de thymocyte over orgel microenvironments tijdens de rijping van de T-cel vaag.
De meeste ex vivo studies tot dusver verrichte omvatten foetale of reaggregate serie orgel culturen14,15, weefsel segmenten of intact serie kwab explantaten waar thymocyte bewegingen worden gevisualiseerd door twee-foton laser scannen microscopie (TPLSM)8, een intravital beeldvormende techniek met een beperkte maximale afstand werken en imaging diepte van 1 mm overeenkomstig het weefsel onderzocht16. In tegenstelling tot de moeizame serie orgel-culturen die afhankelijk van uitgebreide incubatie keer aan formulier 3D-structuren zijn, zowel de serie segment techniek en de intact serie kwab aanpak vergunning gecontroleerd invoering van bepaalde deelverzamelingen van vooraf met het label thymocytes in een inheemse weefsel het platform omgeving. Echter, aangezien de doorbloeding is afwezig in deze modellen, ze zijn duidelijk beperkt voor het bestuderen van het recruitment proces van zwezerik afwikkeling progenitoren (TSPs) naar de thymus parenchym of de dynamiek van de serie egression van volwassen T-cellen.
In vivo modellen voor de studie van de serie T-rijping celfysiologie in muizen bevatten de transplantaties van fragmenten of gehele orgaan lobben geplaatst ofwel binnen de nier capsule17 of intradermaal18. Hoewel deze opties hun nut toonde te ondervragen systemische functionele engraftment van het weefsel, beperkt de positie van de serie transplantaten diep binnen het dier of gedekt door ondoorschijnend weefsellagen hun gebruik voor in vivo onderzoek van implantaten door TPLSM.
De voorste kamer van het oog voorziet in een gemakkelijk toegankelijke ruimte direct toezicht van een geënte weefsel op grond van de transparantie van de cornea lagen. Voordeel is de basis van de kamer gevormd door de iris rijk aan bloedvaten en autonome zenuwuiteinden, waardoor snelle revascularisatie en reinnervation van protheses19,20. Dr. Caicedo heeft deze anatomische ruimte met succes gebruikt voor het onderhoud en longitudinaal onderzoek naar alvleesklier eilandjes in de afgelopen21. Hier, laten we zien dat deze strategie vormt niet alleen een geldige benadering van thymocytes dynamiek binnen de structuur van de native orgel te studeren, maar ook uniek toelaat om uit te breiden de in vivo longitudinale opnamen naar de studie van voorlopercellen werving en rijpe T-cel egression stappen in muis.

<table><tbody><tr><td>Isofluoraan verdamper m/isofluoraan</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>VetFlo-1215</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop m/lichtbron</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Fijne dissectiestangen</td><td>WPI</td><td>500455</td><td></td></tr><tr><td>Medium dissectiestangen</td><td>WPI</td><td>501252</td><td></td></tr><tr><td>Fijne dissectiestangen met gebogen punt</td><td>WPI</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Vannas schaar</td><td>WPI</td><td>503371</td><td></td></tr><tr><td>Dissectieschaar</td><td>WPI</td><td>503243</td><td></td></tr><tr><td>Schelp</td><td>WPI</td><td>500353</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 18G naalden</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Veelvoudig te gebruiken overdrachtpijpje</td><td>Thermofisher</td><td>201C</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspad en verwarmingslamp</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>Infrarood</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR</td><td>83,813,360</td><td></td></tr><tr><td>60 mm steriele schaal</td><td>SIGMA</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1x PBS pH(7,4)</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Steriele doekjes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>LD004</td><td></td></tr><tr><td>Geneesmiddelen voor pijnbestrijding</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3035-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Zoutoplossing of Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ FLIII</td><td></td></tr><tr><td>Hoofdharingadapter</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td></td></tr><tr><td>Gasmasker</td><td>Narishige</td><td>GM-4_S</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire stroomkap</td><td>Telstar</td><td>BIO IIA</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time in vivo tracking van thymocytes in de voorste kamer van het oog door laser scanning microscopie

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Het doel van de methode die wordt voorgesteld is om te laten zien, voor de eerste keer, van de transplantatie van pasgeboren thymi in de voorste oog kamer van isogene volwassen muizen voor in vivo longitudinale real-time bewaking van thymocytes´ dynamiek binnen een gevacuoliseerd Thymus segment. Na de transplantatie kan laser scanning microscopie (LSM) via het hoornvlies in vivo noninvasive herhaalde beeldvorming op het niveau van de cellulaire resolutie. Nog belangrijker is, de aanpak wordt toegevoegd aan eerdere intravital T-cel rijping imaging modellen de mogelijkheid voor continue progenitor cel werving en rijpe T-cel egress opnames in hetzelfde dier. Extra voordelen van het systeem zijn de transparantie van het geënte gebied, toelaat macroscopische snelle controle van de geïmplanteerde weefsels, en de toegankelijkheid van het implantaat waardoor gelokaliseerd naast systemische behandelingen. De belangrijkste beperking wordt het volume van het weefsel dat past in de beperkte ruimte van de kamer van de ogen die voor kwab trimmen eist. Integriteit van orgel wordt gemaximaliseerd door de ontrafeling van de thymus kwabben in patronen die eerder functioneel voor volwassen T-cel-productie te zien. De techniek is potentieel geschikt voor het ondervragen van een milieu van medisch relevante vragen met betrekking tot de functie van de thymus autoimmuniteit, immunodeficiëntie en centrale tolerantie; processen die mechanistically slecht gedefinieerde blijven. De fijne dissectie van mechanismen begeleiden thymocyte migratie, differentiatie en selectie moet leiden tot nieuwe therapeutische strategieën gericht op ontwikkeling T-cellen.

Thymus van pasgeboren muizen werden geïsoleerd uit B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas muizen zoals beschreven in dit protocol (stappen 1.1-1.9). In deze transgene muizen regisseert de kip bèta actine promotor de uitdrukking van de rode fluorescerende eiwit variant DsRed. MST onder invloed van de onmiddellijke vroege enhancer vergemakkelijken van het volgen van implantaten cytomegalovirus (CMV).
Om te voorkomen dat weefs...

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie over de mechanismen van auto-immuniteit, immunodeficiëntie, centrale tolerantie en thymus-involutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo longitudinale opname van voorloper werving en volwassen T-cel uitgang binnen gevasculariseerde en geënte muis thymus segmenten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling en functie van de thymus, kan ook worden toegepast op andere weefsels zoals alvleesklier eilandjes of nierglomeruli.Om de thymus te isoleren, plaatst u de muis op steriele absorberende papieren handdoeken in de rechtopstaande rug in een laminaire stroomkap en spuit en veeg de muisbuik af met 70% ethanol. Maak een oppervlakkige V-vormige incisie in de onderbuik om de borstholte bloot te leggen en gebruik een paar rechte 10-centimeter ontleden schaar om een 0,5 tot een centimeter incisie in de borst langs de ventrale middellijn te maken. Vouw de huid over elke kant van de borst om de borstholte bloot te stellen en maak twee extra diepere 0,5 tot een centimeter laterale insnijdingen door het middenrif en de ribbenkast om toegang te krijgen tot h

real-time-vivo-tracking-thymocytes-anterior-chamber-eye-laser

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time...

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

This video describes the imaging of resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Real-Time Analysis of Resident T-cell Migration in Different Tumor Regions Using Confocal Microscopy

Een nieuwe benadering van het combineren van de intra-oculaire transplantatie en confocale microscopie maakt longitudinale, niet-invasieve real-time beeldvorming met single-cell resolutie binnen geënt...

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming met Single-cell resolutie in real-time

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Dit protocol beschrijft een methode om te afbeelding resident tumor-infiltreren CD8 T cellen aangeduid met fluorescently gekoppelde antilichamen binnen de menselijke longen tumor segmenten. Deze techniek staat real-time analyses van CD8 T-cel migratie met behulp van de confocal microscopie.

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

Dit protocol beschrijft hoe hoge resolutie beeldvormende technieken zoals spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen van laser ophthalmoscopy kan worden gebruikt in kleine knaagdieren, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem, om informatie te verkrijgen over netvlies dikte en microglial cel distributie, respectievelijk.

In Vivo Beeldvorming van Cx3cr1gfp/gfp Reporter muizen met spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen Laser Ophthalmoscopy

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Leer longitudinale intravital imaging van thymocyten door laser scanning microscopie in muizen. Deze methode volgt progenitorrecrutering en T-cel egressie in vivo voor inzicht in auto-immuniteit en immuundeficiëntie.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

Meer video's verkennen