Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van NK-celbiologie over de rol en functie van specifieke genen en paden die de effectorcelfunctie reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is de hoge slagingsgraad in vergelijking met DNA-afhankelijke benaderingen, wat een zeer efficiënte knockout mogelijk maakt van een van de meest klinisch relevante genen in NK-celtherapie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de immunotherapie van solide tumoren en hersentumoren die TGF-beta tot expressie brengen als middel voor immuunecht.

Voor primaire NK-celtransductie, incubeer drie keer 10 tot vijf vers geïsoleerde NK-cellen per milliliter RPMI-medium gesupplementeerd met 100 IE per milliliter IL2 per T75-fles gedurende vier dagen en ververs het medium om de dag en de dag voor transductie. Voor uitgebreide NK-celtransductie, stimuleer de primaire NK-cellen op dag nul met een bestraalde membraangebonden IL21-expresserende K562-feedercellen in een een-op-een-verhouding en ververs het medium om de dag en de dag voor transductie. Op de dag van elektroporatie, vul een T25-fles met acht milliliter vers kweekmedium gesupplementeerd met 100 IE per milliliter IL2 per experimentele celconditie en plaats de flessen in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius en 5%CO2.

Terwijl het medium in evenwicht komt, voeg drie tot vier keer 10 tot de zesde cellen per conditie per 26 microliter transductiemix toe aan een kegelbuis en pel de cellen door centrifugatie. Was vervolgens de cellen drie keer in 12 milliliter steriel PBS per was om alle FBS uit de celsuspensies te verwijderen. Terwijl de cellen worden gewassen, resuspendeer elk CRISPR RNA en tracrRNA tot 200 micromolar eindconcentraties.

Meng 2,2 microliter van elk CRISPR RNA met één 200 micromolar volume tracrRNA per monster en verhit de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar de CRISPR RNA/tracrRNA complexen bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Om de ribonucleoproteïnecomplexen te vormen, voeg Cas9-endonuclease toe aan het corresponderende CRISPR RNA/tracrRNA-complex met draaien gedurende 30 tot 60 seconden en incubeer de resulterende Cas9-ribonucleoproteïnecomplexen gedurende 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur.

Na de laatste wassing, voeg het volledige volume van het elektroporatiesupplement uit het Nucleofector-oplossing P3-kit toe en resuspendeer elke celpellet in 20 microliter van de P3 primaire 4D-Nucleofector-oplossing, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Voeg onmiddellijk vijf microliter van elk ribonucleoproteïnecomplex toe aan de juiste celsuspensie en voeg één microliter van 100 micromolar Cas9-elektroporatie-versterker toe aan het Cas9-ribonucleoproteïnecomplex celmengsel. Breng 26 microliter van de Cas9-ribonucleoproteïne celoplossing over in afzonderlijke putjes van een Nucleocuvette-strip en tik voorzichtig op de strip om ervoor te zorgen dat de monsters de bodem van elke put bedekken.

Start vervolgens het 4D-Nucleofector-systeem EN138-programma. Laat de cellen aan het einde van de transductie drie minuten rusten. Voeg vervolgens 80 microliter van het vooraf geëquilibreerde kweekmedium toe aan elke cuvette en breng de monsters voorzichtig over in één fles per conditie bij 37 graden Celsius incubatie.

Na 48 uur kweek, extraheer het genomische DNA van vijf keer 10 tot vijf getransduceerde cellen voor gendeletiescreening volgens standaardprotocollen. Stimuleer vervolgens de rest van de getransduceerde cellen met verse membraangebonden IL21-expresserende feedercellen in een een-op-een-verhouding en extraheer het RNA na vijf dagen co-cultuur volgens standaardprotocollen voor genexpressieanalyse door kwantitatieve PCR. Flowcytometrie-analyse toont aan dat het EN138-programma resulteert in het hoogste percentage celviabiliteit en transductie-efficiëntie van de beschikbare Nucleofector-systeemprogramma's.

Bijvoorbeeld, met behulp van de commercieel geleverde guide RNA's, wordt het menselijke HPRT1 succesvol uitgeschakeld in uitgebreide menselijke NK-cellen. Bovendien, Cas9-ribonucleoproteïnen met guide RNA2, guide RNA1 plus guide RNA2 en guide RNA3 vertonen een succesvolle TGF-beta-receptor twee ectodomein-gen-knockout, terwijl guide RNA1 alleen geen T7E1 detecteerbare invoegingen en deleties induceert. Inderdaad, het gebruik van het EN138-programma voor Cas9-ribonucleoproteïne-elektroporatie resulteert in een 60% reductie van TGF-beta-receptor twee mRNA-expressie in cellen die via dit programma zijn getransduceerd.

Bovendien heeft co-cultuur van de getransduceerde cellen met TGF-beta en een humane primaire medulloblastoomcellijn geen significant effect op de NK-celcytotoxiciteit in vergelijking met controle niet-TGF-beta-behandelde getransduceerde cellen, wat een overeenkomstig gebrek aan TGF-beta-receptor twee-functie in de Cas9-ribonucleoproteïne gemodificeerde cellen op het eiwitniveau aantoont. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vijf uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Terwijl deze procedure wordt uitgevoerd, is het belangrijk om te onthouden om verschillende guide RNA's te ontwerpen om het beste genbewerkingsresultaat te vinden.

Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals DNA-sequencing of de T7E1-mutatie-assay worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de efficiëntie van genbewerking of hoe potentiële off-target genetische mutaties kunnen worden bepaald. Na de ontwikkeling van deze techniek heeft het de weg geopend voor onderzoekers op het gebied van kankerimmunotherapie om het potentieel voor het gebruik van genbewerkte NK-cellen in kankerbehandeling te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u genbewerking van primaire humane NK-cellen uitvoert.

Voor meer informatie over NK-celexpansie na dit proces, zie ons eerdere Jove-artikel. Vergeet niet dat werken met menselijk bloed buitengewoon gevaarlijk kan zijn en dat universele gezondheids- en veiligheidsmaatregelen altijd moeten worden genomen bij