Name: Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Leer het genereren van knock-out menselijke NK-cellen met Cas9-ribonucleoproteïnen via elektroporatie. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie mogelijk voor immunotherapie-onderzoek tegen tumoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Brian Tullius voor zijn vriendelijke hulp bij het bewerken van het manuscript.

Gezonde donor buffy jassen werden verkregen als bronmateriaal uit de Centraal Ohio regio Amerikaanse Rode Kruis. Dit onderzoek werd vastgesteld te worden vrijgesteld van onderzoek door de institutionele Review Board van landelijk Children's Hospital.
1. menselijke NK cel zuivering en uitbreiding
<ol><li>Isoleren PBMCs van Buffy Coat12.<ol>
<li>Laag 35 mL van buffy coat monster op 15 mL densiteitgradiënt-Paque.</li>
		<li>Centrifugeer bij 400 x g gedurende 20 minuten zonder rem en verzamelen de PBMC vanuit de interface.</li>
		<li>Spoel de herstelde PBMCs driemaal door toe te voegen ten minste een gelijk volume van PBS, centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten, en aspirating de PBC wassen. NK-cel kan worden geïsoleerd in dit stadium door RosettesSep13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK-cellen uit te breiden door het stimuleren van bestraalde 10 x 106 mbIL21-tot uitdrukking te brengen feeder cellen op dag 0, 7, en 14. Media vervangen door verse RPMI met 10% FBS, 1% Glutamine, 1% penicilline streptomycine en 100 IU/mL IL-2 voor de hele media-volume om de andere dag.</li>
</ol>2. gRNA ontwerp en selectie
<ol><li>Kies de specifieke genomic loci te richten, met behulp van online tools, zoals NCBI, Ensemble. In het volgende voorbeeld. Beschrijving: Transforming groeifactor bèta receptor 2 (TGFBRR2) ectodomain Record bekijken: PF08917 InterPro bekijken: IPR015013 Functie: 49-157 aa Gerichte reeks: Exon 4 van TGFBR2 gen (ENSG00000163513)</li>
	<li>Voor het ontwerpen van de gRNAs, CRISPR ontwerp Webhulpmiddelen gebruiken zoals http://crispr.mit.edu en 'Benchling.'<ol>
<li>Voer in de opeenvolging van DNA gekozen in stap 2.1. Kies mens (hg 19) als een doel genoom. CRISPR gidsen (20 nucleotiden gevolgd door een reeks van PAM: NGG) uit de opeenvolging eerder zullen worden afgetast. Het toont ook mogelijk uit doelsoort zijn wedstrijden in het geselecteerde genoom.</li>
		<li>Kies de beste drie gRNAs hebben de hoogste score, op basis van hun op-target en af-target tarieven. Tabel 1 geeft bijvoorbeeld de ontworpen CRISPR RNAs te richten exon 4 van TGFBR2 gen gesuggereerd door CRISPR web ontwerpgereedschappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestel de RNAs CRISPR als synthetische reeks-specifieke crRNAs.</li>
	<li>Bestel een geconserveerde, RNA (tracrRNA) om te communiceren door middel van gedeeltelijke homologie met de crRNA transactivating.</li>
</ol>3. ontwerp-schrapping Screening Primers
<ol><li>Inleidingen verspreid over de gRNA decollete sites voor T7E1 mutatie assay ontwerpen.</li>
	<li>Gebruik inleidingen ten minste 100 bp uit de buurt van de voorspelde breukzijde om kleine invoegpositie verwijderen (microdeleties) op de doelsite sgRNA verschijnt op 1,5% agarose gel na de bepaling van de mutatie. Tabel 2 toont de inleidingen die worden gebruikt voor het versterken van de TGFBR2 ectodomain.</li>
</ol>4. transductie van menselijke primaire en uitgebreide NK-cellen
Opmerking: Transductie van Cas9/RNPs elementen in NK wordt gedaan door electroporation met 4D systeem als volgt.
<ol><li>
Cel Voorbereiding
	<ol>
<li>
Voor primaire NK-cellen, vers geïsoleerde NK cellen in RPMI medium in aanwezigheid van 100 IU/mL IL-2 Incubeer gedurende 4 dagen en het uitvoeren van de electroporation op dag 5. Vervang de media om de andere dag zoals beschreven eerder en eergisteren transductie.</li>
		<li>
Voor uitgebreide NK-cellen, het stimuleren van de cellen op dag 0 met geïrradieerde feeder cellen bij een verhouding van 1:1 en de electroporation op dag 5 of 6 of 7 uit te voeren. Vervang de media om de andere dag zoals beschreven eerder en eergisteren transductie.</li>
		<li>Op de dag van electroporation, bereiden een T25 kolf gevuld met 8 mL verse RPMI met 100 IU/mL IL-2 voor cellen ondergaan electroporation en vooraf incubate kolven in een bevochtigde 37 ° C en 5% CO2 incubator. Opmerking: Ontdooide cellen of cellen die 2nd of 3rd stimulatie hebben ondergaan kunnen electroporated op elk gewenst moment na hun herstel zoals beschreven.</li>
		<li>Neem 3-4 × 106 cellen per voorwaarde voor 26 µL van signaaltransductie mix. Opmerking: Zeer hoge concentratie van NK-cellen in electroporation oplossing verbetert de signaaltransductie tarief.</li>
		<li>Wassen van de cellen 3 keer met PBS te verwijderen alle FBS, waarin vaak RNase activiteit. Draaien ze elke uitvaltijd bij 300 x g gedurende 8 minuten. Opmerking: Overwegen 7 electroporation voorwaarden voor Cas/RNPs als één gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) en een combinatie van twee gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) en één besturingselement met geen Cas9/RNPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De crRNA:tracerRNA vormen het areaal
	<ol>
<li>Resuspendeer crRNAs (gRNA1, gRNA2 en gRNA3) en tracerRNA in 1 x TE oplossing voor eindconcentraties van 200 μM. Mix-2.2 μL van elke 200 μM-gRNA met 200 μM tracerRNA zoals aangegeven in tabel 3.</li>
		<li>Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laat afkoelen op de top van de Bank op kamertemperatuur (15-25 ° C). Winkel geresuspendeerde RNAs en crRNA: tracerRNA/complex bij-20 ° C voor later gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vormen van het RNP-complex Opmerking: om tijd te besparen, vormen de complexe tijdens het wassen RNP stap 4.1.5.
	<ol>
<li>Verdun voor één crRNA:tracrRNA dubbelzijdig reactie, Cas9 endonuclease tot 36 μM, zoals blijkt uit het voorbeeld in tabel 4.</li>
		<li>Verdun voor combinatie transductie van crRNA:tracrRNA duplexen, Cas9 endonuclease tot 36 μM zoals blijkt uit het voorbeeld in tabel 5.
</li>
		<li>Voeg Cas9 endonuclease te crRNA:tracrRNA duplexen langzaam terwijl wervelende pipette uiteinde, meer dan 30 s tot 1 minuut.</li>
		<li>Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. inwerken. Als niet gereed voor gebruik het mengsel na incubatie, houd het mengsel op het ijs tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation
	<ol>
<li>De gehele toeslag toevoegen aan de electroporation oplossing P3 en bewaar deze bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel (3-4 × 106 cellen uit stap 4.1.5) in 20 μL van P3 primaire 4 D electroporation oplossing. Luchtbellen voorkomen terwijl pipetteren. Opmerking: de cellen mag niet worden overgelaten voor een lange tijd in P3 oplossing.</li>
		<li>Onmiddellijk vergroten met 5 µL van RNP complexe (stap 4.3) de celsuspensie.</li>
		<li>Voeg 1 μl van 100 μM Cas9 electroporation enhancer naar de Cas9/RNPs/cel mengen.</li>
		<li>Overdracht Cas9/RNPs/cel mix in 20 μL electroporation reepjes.</li>
		<li>Tik zachtjes op de strips om ervoor te zorgen dat het monster heeft betrekking op de bodem van de strips.</li>
		<li>Start van de 4D electroporation systeem en kies het programma nl-138 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. post transductie
<ol><li>Laat de cellen gedurende 3 minuten in de strips rusten.</li>
	<li>80 µL van de pre-equilibrated cultuur-media toevoegen aan de meetcel en zachtjes Pipetteer van de monster in kolven.</li>
	<li>48 uur na de signaaltransductie, pak genomic DNA uit 5 × 105 cellen voor de verwijdering van de gene screening.</li>
	<li>Versterken van het gen van belang met behulp van de inleidingen ontworpen bij stap 3.2 met DNA van Taq polymerase kits.</li>
	<li>Vormen van PCR amplicon heteroduplexes voor de T7EI spijsvertering en Incubeer het product gedurende 30-60 minuten met een T7EI enzym in 37 ° C. Opmerking: De T7EI test heeft de voorkeur voor het screenen, zoals het is snel, eenvoudig en biedt schone elektroforese resultaten vergeleken met de landmeter assay. Echter, deze methode kan niet speurder invoegingen en verwijderingen van < 2 bases die worden gegenereerd door niet-homologe einde (NHEJ) activiteit meedoen Cas9 RNPs experimenten14.</li>
	<li>Het verteerd DNA draaien op 1,5% agarose gel op 110 V gedurende 30-45 minuten, om de 15 minuten visualiseren de gel.</li>
	<li>Stimuleren van de rest van de cellen met de mbIL21-uiten feeder cellen bij een verhouding van 1:1.</li>
	<li>Vijf dagen na stimulatie pak het RNA voor gen expressie niveau met behulp van qPCR.</li>
	<li>Gedrag calceïne testen zoals eerder gemeld12. Kort, laden doelcellen met calceïne AM (in het voorbeeld, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY cellen werd gebruikt). NK cellen voorbereiden cytotoxiciteit testen door het rusten 's nachts in IL2 (100 IU/mL) plus of minus 10 ng/mL oplosbare TGFβ. Voeren calceïne testen in de dezelfde cytokines als de NK-cellen werden rustte in overnachting.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
<li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li>
<li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%3A+Techniques+and+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266(2015).</li>
<li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9(2018).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li>
<li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261(2017).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li>
<li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition%2C+preparation%2C+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL dient/heeft gediend als consultant voor Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories en Miltenyi Biotec, en heeft eigen vermogen/leiderschap in CytoSen Therapeutics.

DNA-afhankelijke wijziging van NK-cellen heeft zijn uitdagend4,9. Wij dientengevolge, rechtstreeks een synthetisch voorgevormde ribonucleoprotein (RNPs) complex en Cas9 eiwit als gezuiverde eiwit in primaire en uitgebreide NK cellen8. Deze methode konden we elimineren aftopping, staart, en andere transcriptionele en translationele processen gestart door RNA polymerase II, die NK cellen apoptosis gekoppeld aan DNA-afhankelijke transductie m...

Kanker immunotherapie heeft in de afgelopen jaren naar voren geschoven. Genetisch gemodificeerde chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen zijn een uitstekend voorbeeld van gemanipuleerde immuuncellen geïmplementeerd in kanker immunotherapie. Deze cellen zijn onlangs goedgekeurd door de FDA voor behandeling tegen CD19 + B cel maligniteiten, maar succes tot nu toe beperkt gebleven tot ziekten dragen van een paar targetable antigenen en richten van dergelijke beperkte antigene repertoires is gevoelig voor storing door immuun ontsnappen. AUTO T cellen hebben bovendien gericht geweest op het gebruik van autologe T cellen vanwege het risico van graft - versus - host-ziekte veroorzaakt door allogene T-cellen. In tegenstelling, NK-cellen zijn in staat om te doden van tumor doelen op een antigeen-onafhankelijke manier en niet leidt tot GVGH, waardoor ze een goede kandidaat voor kanker immunotherapie6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 technologie heeft onlangs zijn gebruikt in engineering immune cellen is, maar genetisch herprogrammering NK-cellen met plasmiden altijd uitdagend. Dit is vanwege problemen in de transgenic levering in een DNA-afhankelijke manier zoals lentivirale en retrovirale transductie veroorzaakt aanzienlijke procedure-geassocieerde NK cellen apoptosis en de beperkte productie van genetisch gemanipuleerde NK cellen4 , 9.
Vele ingeboren immune cellen express hoge niveaus van receptoren voor pathogen-geassocieerde moleculaire patronen zoals Retinoic acid-afleidbare gene ik (RIG-ik), waardoor verhoogde erkenning van buitenlandse DNA. Onderdrukking van deze trajecten heeft hogere efficiëntie van de signaaltransductie in NK-cellen, bij het gebruik van DNA gebaseerde methoden voor genetische modificatie10.
Hier beschrijven we de methode voor het gebruik van een DNA-vrije genoom bewerken van primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 ribonucleoprotein complexen (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs bestaat uit drie onderdelen, recombinant Cas9 eiwit complexvorm met synthetische single-gids RNA bestaat uit een complexvorm crRNA en tracerRNA. Deze Cas9/RNPs zijn geschikt voor het splijten van genomic doelen met hogere efficiëntie ten opzichte van buitenlandse DNA-afhankelijke benaderingen toe te schrijven aan hun levering als functionele complexen. Daarnaast, snelle goedkeuring van de Cas9/RNPs van de cellen kan het verminderen van de gevolgen van de af-target zoals inductie van apoptosis. Dus kunnen ze worden gebruikt voor het genereren van knock-outs of knock-ins wanneer gecombineerd met DNA voor homologe recombinatie6,7. We toonden dat electroporation van Cas9/RNPs is een makkelijk en relatief efficiënte methode die de eerdere beperkingen van genetische modificatie in NK-cellen overwint.
TGFβ is een grote immunosuppressieve cytokine, die de activering en de functies van NK-cellen remt. Er is gesuggereerd dat het gericht op de TGFβ-pathway immuun cel functies kan verhogen. We gericht de regio codering TGBR2 ectodomain die TGFβ11. bindt De representatieve resultaten tonen een significante afname in het niveau van mRNA uitdrukking van dit gen en verder aantonen dat het gewijzigde NK-cellen resistent voor TGFβ geworden. Bovendien, behouden de gewijzigde cellen levensvatbaarheid en proliferatieve potentieel, zoals ze zijn in staat om uitgebreide post-electroporation bestraalde feeder cuvetten. Daarom de volgende methode is een veelbelovende aanpak om genetisch te manipuleren NK-cellen voor een verdere klinische of onderzoek doeleinden.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep&trade; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>De RosetteSep&trade; Human NK Cell Enrichment Cocktail is ontworpen voor het isoleren van NK-cellen uit volbloed door negatieve selectie.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072532</td><td>TracrRNA dat eigendomsbeschermde chemische modificaties bevat die verhoogde nuclease-resistentie verlenen. Hybridiseert met crRNA om het Cas9-enzym te activeren</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Synthetisch geproduceerd als Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA, gebaseerd op de volgorde van ontworpen gRNA die het gen van belang target</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Genome Editing Detection Kit</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1075931</td><td>Elk kit bevat T7EI endonuclease, T7EI reactiebuffer en T7EI assay controles.</td></tr><tr><td>Platinum&reg; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; System</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IL-2 Protein</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>Bevat pmaxGFP&trade; Vector, Nucleofector&trade; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&trade; Strips</td></tr><tr><td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nuclease</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; Blood &amp; Tissue Handbook</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072554</td><td>Bevat tracrRNA, HPRT positieve controle crRNA, negatieve controle crRNA#1, HPRT Primer Mix en Nuclease-Free Duplex Buffer.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Electroporation Enhancer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1075915</td><td>Cas9 Electroporation Enhancer</td></tr></tbody></table>

generatie van knock-out primaire en uitgebreide menselijke nk-cellen met behulp van cas9 ribonucleoproteins

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technologie versnelt genoom engineering in vele celtypes, maar tot dusver, gene levering en stabiele genetische modificatie geweest uitdagende in primaire NK-cellen. Bijvoorbeeld resulteerde transgenic levering met behulp van lentivirale of retrovirale transductie in een beperkte opbrengst van genetisch gemanipuleerde NK cellen als gevolg van substantiële procedure-geassocieerde NK cellen apoptosis. Hier beschrijven we een DNA-gratis methode voor het bewerken van het genoom van menselijke primaire en uitgebreide NK cellen met behulp van Cas9 ribonucleoprotein complexen (Cas9/RNPs). Deze methode mag efficiënte knock-out van de TGFBR2 en HPRT1 genen in NK-cellen. RT-PCR gegevens toonden een significante afname in gen expressie niveau, en een bepaling van de cytotoxiciteit van een representatieve cel product gesuggereerd dat de RNP gemodificeerde NK-cellen werd minder gevoelig voor TGFβ. Genetisch gemodificeerde cellen zou uitgebreide post-electroporation door stimulatie bestraalde mbIL21-tot uitdrukking te brengen feeder cellen.

Electroporation efficiëntie
Om te optimaliseren electroporation van Cas9/RNPs, we getest 16 verschillende programma's met transductie van GFP niet-targeting siRNA en DNA plasmide in NK-cellen. Stroom cytometry assay toonde aan dat het nl-138 had het hoogste percentage van cel levensvatbaarheid en transductie efficiëntie (35% levende GFP positieve cellen) voor beide deeltjes (Figuur 1 e...

Hier presenteren we een protocol om genetisch wijzigen van primaire of uitgebreide menselijke natural killer (NK) cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Met behulp van dit protocol, we genereerden menselijke NK cellen tekort voor Transformeren groeifactor-b receptor 2 (TGFBR2) en hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van NK-celbiologie over de rol en functie van specifieke genen en paden die de effectorcelfunctie reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is de hoge slagingsgraad in vergelijking met DNA-afhankelijke benaderingen, wat een zeer efficiënte knockout mogelijk maakt van een van de meest klinisch relevante genen in NK-celtherapie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de immunotherapie van solide tumoren en hersentumoren die TGF-beta tot expressie brengen als middel voor immuunecht. Voor primaire NK-celtransductie, incubeer drie keer 10 tot vijf vers geïsoleerde NK-cellen per milliliter RPMI-medium gesupplementeerd met 100 IE per milliliter IL2 per T75-fles gedurende vier dagen en ververs het medium om de dag en de dag voor transductie. Voor uitgebreide NK-celtransductie, stimuleer de primaire NK-cellen op dag nul met een bestraalde membraangebonden IL21-expresserende K562-feedercellen in een een-op-een-verhouding en ververs het medium om de dag en de dag voor transductie. Op de dag van elektroporatie, vul een T25-fles met acht milliliter vers kweekmedium gesupplementeerd met 100 I

generation-knock-out-primary-expanded-human-nk-cells-using-cas9

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a technique for Cas9 ribonucleoprotein-mediated genetic modification of primary natural killer (NK) cells. A Cas9 ribonucleoprotein, consisting of a Cas9 endonuclease bound to a guide RNA (gRNA) formed by base pairing a CRISPR RNA (crRNA) and a trans-activating crRNA (tracrRNA), is introduced into primary natural killer cells via electroporation. The ribonucleoprotein targets and cleaves the host DNA at the target site, leading to gene knockout via modification of the...

A Technique for Gene Editing in Natural Killer Cells Using CRISPR Cas9

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

We hebben een eenvoudig en goedkoop protocol ontwikkeld om Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnecomplexen in virusachtige deeltjes te laden. Deze deeltjes, genaamd "Nanoblades", maken een efficiënte levering van het Cas9 / sgRNA-complex mogelijk in onsterfelijke en primaire cellen, evenals in vivo.

Levering van het Cas9/sgRNA Ribonucleoproteïne Complex in onsterfelijke en primaire cellen via virusachtige deeltjes ("Nanoblades")

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende reporters en celsortering om knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen. Twee plasmiden worden gebruikt voor deze vereenvoudigde knock-in experimenten, namelijk een CRISPR/Cas9- en DsRed2-tot expressie brengend plasmide en een homoloog recombinatiedonorplasmide dat EBFP2 tot expressie brengt, dat permanent is geïntegreerd op de Rosa26-locus in immuuncellen.

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Het protocol beschrijft hoe knock-out myoblasten kunnen worden gegenereerd met CRISPR / Cas9, van het ontwerp van guide-RNA's tot het cellulair klonen en karakteriseren van de knock-out klonen.

Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking

Naarmate CRISPR-gerelateerde protocollen steeds nuttiger en toegankelijker worden, kunnen er onder specifieke experimentele omstandigheden nog steeds complicaties en obstakels optreden. Dit protocol schetst de creatie van een receptor-interagerende serine/threonine-proteïne kinase 1 (RIPK1/RIP1) knock-out menselijke cellijn met behulp van CRISPR/Cas9 en benadrukt mogelijke uitdagingen die zich tijdens dit proces voordoen.

Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Leer het genereren van knock-out menselijke NK-cellen met Cas9-ribonucleoproteïnen via elektroporatie. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie mogelijk voor immunotherapie-onderzoek tegen tumoren.

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

Meer video's verkennen