Name: Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Ontdek 16S rRNA-ampliconsequentiebepaling voor karakterisering van het teekmicrobioom met hoge resolutie. Deze methode biedt een robuust kader voor onderzoek naar vectorovergedragen ziekte-ecologie en pathogeeninteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door National Science Foundation verleent aan A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

1. Vink collectie en oppervlakte sterilisatie
<ol><li>Verzamelen teken door te slepen een 1 m2 witte doek over een teek-geassocieerde habitat, het verwijderen van teken gekoppeld aan host soorten of fokken teken in het lab15,16. Fijne pincet gebruiken om te manipuleren teken en bewaar ze bij-80 ° C.</li>
	<li>Teken in de individuele PCR buisjes plaatsen en verwijderen van oppervlakte verontreinigingen door de vortexing voor 15 s achtereenvolgens met 500 μL van waterstof peroxide (H2O2), 70% ethanol en ddH2O.</li>
	<li>Plaats het teken in een nieuwe PCR-buis en laten drogen.</li>
	<li>In deze buis, mechanisch teek weefsels door het breken van het teken met een mortier en een stamper (gebruikt in deze studie), kleine kralen met een kraal klopper, verstoren of snijden van de teek na elkaar, met een scalpel.</li>
</ol>2. DNA zuivering
<ol><li>Zuiveren van DNA van individuele teken, na de instructies in een commercieel beschikbare DNA-extractie kit. Elueer voor een eindvolume van 100 μl. Nota: Verwijs naar Figuur 1 voor een overzicht van stappen 2.2-2.8. Alternatieve extractiemethoden omvatten fenol-chloroform extractie17,18, ethanol neerslag19of extractie met een chelaatvormers materiële20,-21.</li>
	<li>Bevestig succesvolle DNA zuivering met behulp van een Fluorimeter of spectrofotometer. Voor fluorometry, 10 μL van DNA sjabloon in een 190 μL double-stranded DNA test te gebruiken. Het verwachte rendement is 0.1-1.0 ng/μL22. Voor spectrofotometrie, 1 μL van DNA sjabloon in een nucleïnezuur kwantificering te gebruiken. De verwachte verhouding van A260/280 is ongeveer 1,823.</li>
	<li>Als geen procedure onmiddellijk om versterking, opslag van de monsters bij-20 ° C.</li>
</ol>3. 16S rRNA Gene versterking
<ol><li>Instellen van de amplicon PCR in een 27.5 μL reactie bevattende: 5 μL van elke primer op 1 μM; 12.5 μL van commercieel beschikbare PCR-mix; en 5 μL van DNA geëxtraheerd uit individuele teken bij een concentratie van 5 ng/μL. Opmerking: Gebruik de volgende inleidingen voor versterking van de hypervariable V3-V4-regio van het 16S rRNA gene13: 5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3', 5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'</li>
	<li>Buizen verplaatsen naar een thermocycler geprogrammeerd voor: een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 25 cycli van 1) 95 ° C gedurende 30 s, 2) 57 ° C gedurende 30 s, 3) 72 ° C gedurende 30 s; een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten; een laatste Houd bij 10 ° C.</li>
	<li>Zodra de PCR wordt gedaan, visualiseer het PCR-product door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% agarose gel. Zoekt u een band op 460 bp te bevestigen versterking. Opmerking: Amplicon PCR product mogelijk niet zichtbaar op de gel als de concentratie van de steekproef te laag is (< 10 ng). Primer dimeer aanwezigheid is gebruikelijk in lage concentratie monsters. Als andere niet-doelbandbreedtes aanwezig zijn, de onthardende temperatuur aanpassen of verminderen van het aantal cycli.</li>
	<li>Als geen procedure onmiddellijk naar zuivering, opslag van de monsters bij 4 ° C.</li>
</ol>4. 16S Amplicon zuivering
<ol><li>Met behulp van een nieuwe PCR-buis voor elk monster, het combineren van het PCR-product met ddH2O te verkrijgen van 60 μL totale. Voor monsters met een lage concentraties van DNA, uitvoeren van amplicon PCR in drievoud te verminderen amplificatie bias en bundelen van de monsters te concentreren.</li>
	<li>Paramagnetisch kralen brengen op kamertemperatuur en vortex die hen goed vóór gebruik.</li>
	<li>48 μL van paramagnetisch kralen toevoegen aan 60 μL van het monster en incubeer gedurende 5 min. plaats de buizen op een magnetische rek voor 5 min tot oplossing wordt duidelijk. Verwijder het supernatant. Opmerking: De concentratie van deze parel richt zich op het wegnemen van inleidingsdimeer (< 60 bp). Wijzig indien nodig, de concentratie van de kraal Schakel andere aspecifieke "banding".</li>
	<li>Met buizen op magnetische rek, voeg 500 l 80% vers bereide EtOH. Onmiddellijk na het toevoegen van EtOH alle buizen, Pipetteer uit de vloeistof. Verwijder niet de kralen. Herhaal de EtOH toevoeging en verwijdering nog een keer.</li>
	<li>Het drogen van de monsters Schakel overtollige EtOH door bloot op het magnetische rek voor 5 minuten, of totdat de scheurtjes zijn zichtbaar in de kralen van de buizen.</li>
	<li>Voeg 20 μL van TE buffer en Incubeer de monsters uit de magneet, bij kamertemperatuur, voor 5-10 min.</li>
	<li>Plaats die de buizen terug aan de magneet. Zodra de kralen en de vloeistof worden gescheiden, overbrengen in het supernatant een verse buis de schoongemaakte PCR product te verkrijgen.</li>
	<li>(Optioneel) Visualiseren van het product om te bevestigen van succesvolle amplicon zuivering door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% gel. De 460 bp band zichtbaar moet zijn, en er moet geen primer dimeer.</li>
	<li>Indien geen vooruitgang onmiddellijk naar index PCR, slaan de monsters 4 ° C.</li>
</ol>5. proef Barcoding en zuivering
<ol><li>Toewijzen uniek primer combinaties aan elk monster door vooruit of omgekeerde inleidingen, of beide, van een commercieel beschikbare bibliotheek index kit te selecteren. Opmerking: Uniek labeling monsters zorgt voor differentiatie na sequencing. Kits bieden meestal genoeg inleidingen te volgnummer 96-384 monsters.</li>
	<li>De dubbele inleidingen of indexen, aan de monsters door het uitvoeren van PCR 25 μL reactie met 2,5 μL van elke primer (N7xx en S5xx), 12,5 μL van commercieel beschikbare PCR master mix, 5 μL van ddH2O en 2.5 μL van de schoongemaakte amplicon product toevoegen.</li>
	<li>Verplaatsen van de buizen naar een thermocycler geprogrammeerd voor: een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 8-14 cycli van 1) 95 ° C gedurende 30 s, 2) 55 ° C gedurende 30 s, 3) 72 ° C gedurende 30 s; een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten; een laatste Houd bij 10 ° C.</li>
	<li>Zodra de PCR wordt gedaan, visualiseer het PCR-product door het laden van 4-6 μL/monster op een 1,5% agarose gel. Zoekt u een band op 550 bp te bevestigen versterking. Opmerking: Gebruik de visualisatie resultaten te informeren index PCR fietsen voorwaarden. De cyclus telt aspecifieke bindende beperken of verhogen de telling van de cyclus te verkrijgen van de zichtbare banden voor elk monster Verlaag.</li>
	<li>Herhaal de procedure van de schoonmaakoperaties vermeld in stap 4. Om te voorkomen dat de verdunning tijdens opschonen, index PCR uitvoeren in tweevoud en bundelen het product hier.</li>
	<li>Als geen procedure onmiddellijk aan de kwantificering van de bibliotheek en de normalisatie, opslag van de monsters bij 4 ° C.</li>
</ol>6. bibliotheek kwantificering en normalisatie
<ol><li>Schatten van de concentratie van elk gezuiverde, barcoded product uit stap 5.5 met behulp van een Fluorimeter of spectrofotometer (zie stap 2.2). Verdun de monsters in de buffer TE verkrijgen van concentraties van ongeveer 1 uur. Opmerking: Bibliotheek kwantificering nodig is om het monster laden concentratie aanbevolen voor de sequencing-platform. Kwantificering van de bibliotheek wordt bereikt door qPCR, maar de concentratie van het monster vóór qPCR schatten slaat reagentia en tijd. De 1 pM-concentratie wordt aanbevolen om het maximaliseren van de nauwkeurigheid van de kwantificering van de bibliotheek, zoals dit de gemiddelde concentratie van de normen van de qPCR waarin de kwantificering kit24 is.</li>
	<li>Voer qPCR in een reactie van de 10 μL met 6.0 μL van de master mix qPCR (uit de bibliotheek kwantificering kit), 2.0 μL van ddH2O en 2.0 μL van het monster of standaard. Elk monster en standaard in drievoud voor meer nauwkeurigheid en precisie uitvoeren. Elk monster worden uitgevoerd op drie of meer niveaus van verdunning (bv., 0: 1 pm, 1 pm en 10 pm voor de geschatte startende concentraties) om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering. Opmerking: Gedetailleerde informatie over de verstrekte primers en normen zal variëren op basis van de kwantificering kit gebruikt en zijn beschikbaar in de technische fiche van producten. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de kwantificering kit die wordt gebruikt in deze studie.</li>
	<li>De qPCR plaat of buizen naar een real-time PCR-instrument dat is geprogrammeerd voor verplaatsen: een initiële denaturatie van 95 ° C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 1) 95 ° C voor 30 s en 2) 60 ° C gedurende 45 s; en een stap in de dissociatie van 1) 95 ° C gedurende 15 s, 2) 60 ° C gedurende 30 s, en 3) 95 ° C gedurende 15 s.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde concentratie voor elk monster met behulp van de kwantificering waarden, verkregen uit de resultaten van de qPCR en de monster verdunning niveaus gebruikt. Opmerking: bijvoorbeeld een gemiddelde concentratie van 2 pM voor een monster verdunde 1:100,000 levert een originele beginconcentratie van 200 nM. Als geen van de niveaus van de verdunning voor een monster binnen het bereik van de standaard curven valt, kwantificering resultaten mogelijk niet nauwkeurig zijn; in dat geval de verdunning niveaus aanpassen en opnieuw uit te voeren qPCR.</li>
	<li>Verdun elk gezuiverde, barcoded monster 4 nM in TE buffer, gebaseerd op de gemiddelde concentraties berekend in stap 7.5. Opmerking: bijvoorbeeld, voor de concentratie van een gemiddeld monster van 200 nM, verdunde de monster 1:50 TE buffer naar een 4 nM-concentratie wordt bereikt. De precieze monster concentratie zal variëren op basis van de volgorde systeem en reagens kit gebruikt. Raadpleeg de gebruikershandleiding van sequencing systeem voor de aanbevolen concentratie.</li>
	<li>De gecombineerde bibliotheek maakt door gelijke hoeveelheden (meestal 5-10 μl) toe te voegen van alle individuele bibliotheken in een enkele buis. Opmerking: zoals alle monsters op een 4 nM concentratie moeten, toevoegen van gelijke hoeveelheden behaalt een gelijke concentratie van alle monsters in de gepoolde bibliotheek.</li>
	<li>Herhaal stap 6.2-6.4 op de gecombineerde bibliotheek om te bevestigen de 4 nM-concentratie.</li>
	<li>Bereken de concentratie van de gecombineerde bibliotheek en verdunnen of opnieuw vormen de finale, gebundelde bibliotheek gebruiken Tris buffer als dit nodig is om te bereiken van 4 nM.</li>
	<li>Als geen procedure onmiddellijk bij het laden van de steekproef, opslag van de monsters bij-20 ° C. De volgorde uitvoeren kort na kwantificering te minimaliseren verlies of veranderingen in DNA concentratie tijdens de opslag uit te voeren.</li>
</ol>7. bibliotheek denaturatie en verdunning en Sequencing Run (uitvoeren op dezelfde dag)
<ol><li>Het denatureren van de 4 nM gecombineerde bibliotheek vanaf stap 6.9 met NaOH. Opmerking: Deze laatste bibliotheek voorbereiding stappen verschillen voor elk rangschikkend systeem. Raadpleeg de gebruikershandleiding van sequencing systeem voor meer gedetailleerde en bijgewerkte protocollen. Nieuwe gebruikers zullen waarschijnlijk moeten worden opgeleid over het gebruik van het platform sequencing of hun bibliotheken kunnen verzenden met een core sequencing faciliteit.</li>
	<li>Verdun de gedenatureerde bibliotheek bij de concentratie van de gewenste laden met behulp van de buffer waarin de sequencing reagens kit (Tabel van materialen). Opmerking: Optimale laden concentraties verschillen door sequentiebepaling systeem en meestal variëren van 1-250 uur25.</li>
	<li>Denatureren en Verdun het rangschikken-besturingselement. Opmerking: Het toevoegen van een besturingselement sequencing corrigeert voor sequencing kwesties die voortvloeien uit lage diversiteit bibliotheken. Denatureren van de controle van de sequencing met behulp van NaOH en Verdun tot dezelfde concentratie als de bibliotheek.</li>
	<li>Het combineren van de bibliotheek en de sequencing controle. Opmerking: De verhouding van sequencing besturingselement gecombineerde bibliotheek zal afhangen van de diversiteit van de bibliotheek en rangschikkend systeem gebruikt, maar het is meestal 1:1-26.</li>
	<li>De gecombineerde bibliotheek en sequencing controle mengsel naar de cel sequencing stroom laden.</li>
</ol>8. Amplicon sequentieanalyse
<ol><li>Beoordelen van het algehele succes van de run door het onderzoek van de looppas metriek op de cloud computing omgeving overeenkomt met de sequencing-systeem gebruikt. Opmerking: De run statistieken, zoals aantal sequencing leest, zal variëren afhankelijk van sequencing platform en reagens kit gebruikt. Streefwaarden voor gemeenschappelijke sequencing systemen staan in tabel 1.</li>
	<li>Download de ruwe sequencing gegevens en gewenste bioinformatics open bronsoftware, kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie (QIIME)27 of Mothur28. Opmerking: Beide QIIME en Mothur zijn open-source en gratis te downloaden. Gedetailleerde instructies over het gebruik van deze programma's zijn online te vinden en zijn voldoende gedetailleerd voor first-time gebruikers. De volgende stappen geven een algemeen overzicht van een pijpleiding van de bioinformatica uitgevoerd in QIIME. Vertrouwdheid met python is niet nodig maar vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van de volgende scripts</li>
	<li>Maak en valideer het toewijzingsbestand met behulp van de "validate_mapping_file.py" script in QIIME. Opmerking: Het toewijzingsbestand bevat alle metagegevens nodig voor het uitvoeren van data-analyse, waaronder de ID van de steekproef, amplicon primer sequenties, en beschrijving van het monster. De stap van de validatie wordt gecontroleerd dat alle benodigde gegevens zijn ingevoerd in het juiste formaat.</li>
	<li>Demultiplex en filteren van sequenties met behulp van de "split_libraries.py" script (Figuur 1). Opmerking: Dit script wijst barcoded leest aan samples gebaseerd op de index primer combinaties en monster-id invoeren in het toewijzingsbestand. Het voert ook verschillende kwaliteit filteren stappen om te bepalen voor het rangschikken op basis van gebruiker gedefinieerde cut-offs voor minimale kwaliteitsscore, de lengten van de volgorde en einde-trimmen fout.</li>
	<li>Operationele taxonomische eenheden (OTUs) aan sequenties met behulp van de "pick_open_references_otus.py" script toewijzen. Opmerking: In deze stap sequenties zijn geclusterd tegen een reeks referentieverzameling gebaseerd op een drempel van identiteit (gewoonlijk 97%). Leest die niet overeenkomen met de volgorde van de referentieverzameling geclusterd zijn tegen elkaar. De novo en gesloten-reference OTU plukken opties zijn ook beschikbaar, maar open-reference picken wordt aanbevolen door QIIME ontwikkelaars.</li>
	<li>Normaliseren de OTU tabel met behulp van de "alpha_rarefaction.py" of "normalize_table.py" script. Opmerking: Deze stap corrigeert voor variatie in kolom bedragen, of totaal volgorde leest per monster, die voortvloeien uit het rangschikken van de moderne technologieën. Normalisatie kan worden uitgevoerd met behulp van traditionele rarefaction, of via alternatieve methoden zoals het cumulatieve totaal over schalen.</li>
	<li>Verschillende alpha-diversiteit, bèta-diversiteit en taxonomische samenstelling diversiteit analyses tegelijk met het "core_diversity_analysis.py" script uitvoeren Opmerking: U kunt ook deze analyses kunnen worden uitgevoerd afzonderlijk met behulp van de afzonderlijke scripts (b.v., "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is geworden van een standaardaanpak voor microbiële identificatie en de studie van de invloed van vector microbiomes op pathogen transmissie ingeschakeld. Het protocol hier geschetste details het gebruik van deze methode te onderzoeken van de microbiële Gemeenschap vergadering in I. pacificus, een vector soorten voor de ziekte van Lyme; het kan echter gemakkelijk worden toegepast om te bestuderen van andere geleedpotigen vector of teek soorten.
<p class="...

De heropleving en de verspreiding van de vector-overgedragen ziekten in de afgelopen decennia bedreiging een ernstige voor globale gezondheid van mensen en dieren in het wild. Effectieve vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, en controle-inspanningen worden belemmerd door de complexe biologische aard van vectoren en vector-gastheer interacties. Inzicht in de rol van microbiële interacties binnen een vector in pathogen transmissie kan zorgen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën die het omzeilen van deze uitdagingen. In het bijzonder, interacties tussen vector-geassocieerde microbiële commensals, symbionten en ziekteverwekkers, hierna aangeduid als de microbiome, kunnen belangrijke gevolgen hebben voor pathogen transmissie. Overweldigend bewijs nu ondersteunt deze bewering, met voorbeelden waaruit blijkt van een koppeling tussen de vector microbiome en bekwaamheid voor ziekten zoals malaria, Zika-virus en de ziekte van Lyme1,2,3. Het vertalen van deze bevindingen in strategieën voor ziektepreventie en-bestrijding vereist echter een veel gedetailleerder inzicht in de structuur, functie en herkomst van de vector microbiomes. Identificatie en karakterisering van de microbiële Gemeenschap van vector onder variërende ecologische en experimentele omstandigheden vormen een belangrijke weg vooruit op dit gebied.
Een procedure voor de identificatie van de microbiële bewoners van een ziekteverwekker vector is hier geboden door gebruik te maken van de westerse zwart-legged teek, Ixodes pacificus, een vector soorten van de verwekker van de ziekte van Lyme Borrelia burgdorferi. Terwijl teken meer soorten menselijke pathogenen dan elke andere arthropod haven, is relatief weinig bekend over de ecologie van de biologie en de Gemeenschap van de teek microbiomes4. Het is duidelijk dat teken haven een divers scala aan virussen, bacteriën, schimmels en protozoa, waaronder commensals, endosymbionten en voorbijgaande microbiële bewoners5,4. Voorafgaande werk heeft aangetoond sterke variaties in de Ixodes microbiomes geografie, soort, geslacht, leven stadium en bloedmeel bron6,7,8is gekoppeld. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze variatie onbekend blijven en garandeert u dat meer gedetailleerde onderzoek van de oorsprong en samenstelling van deze microbiële gemeenschappen. Teken kunnen verwerven microben via verticale transmissie, contact met hosts en opname van het milieu door middel van de spiracles, mond en anale poriën9. Inzicht in de factoren die het vormgeven van de initiële vorming en ontwikkeling van de microbiome van de teek, is specifiek de relatieve bijdrage van verticale en milieu transmissie, belangrijk voor het begrip van de natuurlijke patronen en variaties in de teek microbiome diversiteit en de wisselwerking van deze gemeenschappen tijdens pathogen transmissie, met mogelijke toepassingen aan ziekte of vector.
Krachtige moleculaire technieken, zoals de sequencing van de volgende generatie, nu bestaan voor de identificatie van microbiële gemeenschappen en kunnen worden gebruikt om te karakteriseren vector microbiomes onder uiteenlopende milieu- of experimentele omstandigheden. Voorafgaand aan de komst van deze high-throughput sequencing benaderingen, de identificatie van microben ingeroepen overwegend microscopie en cultuur. Terwijl microscopie een snelle en gemakkelijke techniek is, zijn morfologische methoden voor het identificeren van microben inherent subjectief en grof en beperkt door lage gevoeligheid en detectie10. Cultuur gebaseerde methoden zijn over het algemeen gebruikt voor microbiële identificatie en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de gevoeligheid van bacteriën voor drug behandelingen11. Echter, deze methode ook lijdt aan lage gevoeligheid, als er wordt geschat dat minder dan 2% van milieu microben kunnen worden gekweekt in een laboratorium, instelling van12. Histologische kleuring benaderingen zijn ook tewerkgesteld te detecteren en lokaliseren specifieke microben binnen vectoren, onderzoek van verschillende taxa distributies binnen de teek mogelijk te maken en studeren hypothesen over microbiële interacties. Voorafgaande kennis van microbiële identiteit is echter vereist voor het selecteren van de juiste vlekken, maken deze aanpak niet geschikt voor microbiële karakterisering en de identificatie. Anderzijds histologische kleuring is een zeer tijdrovende en moeizame proces en niet schaalt ook bij grote steekproeven. Traditionele moleculaire benaderingen zoals Sanger sequencing zijn ook beperkt in hun gevoeligheid en opsporen van microbiële cultuurgemeenschappen.
Volgende-generatie sequencing zorgt voor de snelle identificatie van microben uit een groot aantal monsters. De aanwezigheid van standaard-markers en verwijzing databases verdere hiermee verbeterd taxonomische resolutie, vaak naar het geslacht of de soort niveau. Kleine subeenheid ribosomaal RNAs worden vaak gebruikt om dit te bereiken, met 16S rRNA worden de meest voorkomende als gevolg van de aanwezigheid van geconserveerde en variabele regio's binnen het gen, waardoor voor de totstandbrenging van universele inleidingen met unieke waarbij voor elk bacteriële soorten13,14. Dit verslag beschrijft in detail een procedure voor de identificatie van taxa in de microbiome van de teek door 16S rRNA volgende-generatie sequencing. Dit protocol onderstreept met name de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van monsters voor het rangschikken. Meer algemene informatie over de volgorde en bioinformatics stappen dienen, aangezien er een verscheidenheid van sequencing platformen en analyse programma's die momenteel beschikbaar, elk met uitgebreide bestaande documentatie. De algehele haalbaarheid van deze next-generation sequencing aanpak wordt aangetoond door het toe te passen op een onderzoek van microbiële Gemeenschap vergadering binnen een belangrijke ziekte vector.

<table><tbody><tr><td>Item</td><td>Naam van materiaal/apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnr.</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>AMPure XP beads</td><td>Agen Court</td><td>A63880&nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>Magnetic Rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>TE buffer</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Nextera Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>MiSeq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>MiSeq Reagent Kit v3&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 mM Tris-HCl met 0,1% Tween 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

karakterisering van het microbiome van de teek door next-generation 16s rrna amplicon sequentiebepaling

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In de afgelopen decennia hebben vector-overgedragen ziekten weer naar voren en uitgebreid op alarmerend tarieven, veroorzaken aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Effectieve en wijd-beschikbaar vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, waardoor de ontwikkeling van nieuwe ziekte risicobeperkende strategieën. Te dien einde houdt een veelbelovende laan van ziektebestrijding gericht op de vector microbiome, de Gemeenschap van microben bevolken de vector. De vector microbiome speelt een centrale rol in pathogen dynamiek en manipulaties van de microbiome hebben geleid tot verminderde vector overvloed of pathogen transmissie voor een handvol vector-overgedragen ziekten. Het vertalen van deze bevindingen in disease control toepassingen vereist echter een gedegen kennis van vector microbiële ecologie, historisch beperkt door onvoldoende technologie op dit gebied. De komst van de volgende generatie sequencing benaderingen heeft snelle, zeer parallelle sequencing van cultuurgemeenschappen microbiële ingeschakeld. Gericht op het zeer geconserveerd 16S rRNA gen heeft vergemakkelijkt karakterisaties van microben in vectoren onder variërende ecologische en experimentele voorwaarden aanwezig. Deze techniek gaat om versterking van het 16S rRNA gen, monster barcoding via PCR, laden monsters naar een cel van de stroom voor het rangschikken, en bio-informatica benaderingen aan sequencedata met fylogenetische informatie. Soort of geslacht-niveau identificatie voor een groot aantal replicatieonderzoeken kan meestal worden bereikt door deze aanpak, dus het omzeilen van uitdagingen van loeien speurder, resolutie en uitvoer van traditionele kweken, microscopie of histologische kleuring technieken. Daarom deze methode is geschikt voor het karakteriseren van vector microben onder uiteenlopende omstandigheden, maar op dit moment geen informatie worden verkregen op microbiële functie, locatie binnen de vector of reactie op de behandeling met antibiotica. Over het geheel genomen is 16S volgende-generatie rangschikken een krachtige techniek voor het beter begrijpen van de identiteit en de rol van vector microben in de dynamiek van de ziekte.

Een totaal van 42 teken uit drie aparte ei klauwen en twee omgevingsblootstelling periodes, 0 en 2 weken in de bodem, werden verwerkt voor het rangschikken van de microbiome. Alle behandelde groepen, beschouwd als een interne koppeling en blootstelling tijd, opgenomen 6-8 repliceren teek monsters. Deze verwerkte teek-extracten werden geladen op een volgende-generatie sequencer en 12,885,713 gekoppeld-einde leest passeren filter opgeleverd. Inbegrepen in deze run 3 negatieve controles werd...

Hier presenteren we een volgende-generatie sequencing-protocol voor het 16S rRNA rangschikken waarmee identificatie en karakterisering van microbiële gemeenschappen binnen de vectoren. Deze methode houdt het DNA-extractie, versterking en barcoding van monsters door middel van PCR, rangschikking op een stroom-cel, en bio-informatica aan sequencedata tot fylogenetische informatie.

Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ecologie van door vectoren overgedragen ziekten, zoals, welke rol speelt het vectormicrobioom in de dynamiek van pathogenen, en hoe vormen en variëren vectormicrobiomen? De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het hoge replicatie, hoge resolutie en identificatie mogelijk maakt, waardoor de gebruiker het vectormicrobioom nauwkeurig kan karakteriseren onder verschillende ecologische en omgevingscondities. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, omdat de stappen voor de instelling van het microbioomsequentie-opzet moeilijk te leren zijn, en er zijn veel verschillende producten en technieken beschikbaar, maar weinig beschikbare bronnen om deze stappen te leren.Begin deze procedure met het verzamelen van teken, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om oppervlakteverontreinigingen van de teken te verwijderen, voeg 500 microliter waterstofperoxide toe en vortex gedurende 15 seconden. Herhaal deze wassing met 70% ethanol en vervolgens twee keer gedistilleerd water.Plaats de teken in een nieuwe PCR-buis en laat ze aan de lucht drogen. In deze buis mechanisch verstoring van te

tick-microbiome-characterization-next-generation-16s-rrna-amplicon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Ontdek 16S rRNA-ampliconsequentiebepaling voor karakterisering van het teekmicrobioom met hoge resolutie. Deze methode biedt een robuust kader voor onderzoek naar vectorovergedragen ziekte-ecologie en pathogeeninteracties.

Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling

Meer video's verkennen