Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling
25 augustus 2018
Hier presenteren we een volgende-generatie sequencing-protocol voor het 16S rRNA rangschikken waarmee identificatie en karakterisering van microbiële gemeenschappen binnen de vectoren. Deze methode houdt het DNA-extractie, versterking en barcoding van monsters door middel van PCR, rangschikking op een stroom-cel, en bio-informatica aan sequencedata tot fylogenetische informatie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ecologie van door vectoren overgedragen ziekten, zoals, welke rol speelt het vectormicrobioom in de dynamiek van pathogenen, en hoe vormen en variëren vectormicrobiomen? De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het hoge replicatie, hoge resolutie en identificatie mogelijk maakt, waardoor de gebruiker het vectormicrobioom nauwkeurig kan karakteriseren onder verschillende ecologische en omgevingscondities. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, omdat de stappen voor de instelling van het microbioomsequentie-opzet moeilijk te leren zijn, en er zijn veel verschillende producten en technieken beschikbaar, maar weinig beschikbare bronnen om deze stappen te leren.
Begin deze procedure met het verzamelen van teken, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om oppervlakteverontreinigingen van de teken te verwijderen, voeg 500 microliter waterstofperoxide toe en vortex gedurende 15 seconden. Herhaal deze wassing met 70% ethanol en vervolgens twee keer gedistilleerd water.
Plaats de teken in een nieuwe PCR-buis en laat ze aan de lucht drogen. In deze buis mechanisch verstoring van tekenweefsels door de teken met een mortel en pestel te pletten. Zuiver DNA van individuele teken, volgens de instructies in een commercieel verkrijgbaar DNA-extractiekit.
Elueer tot een eindvolume van 100 microliter. Het maken van een negatieve controle bij de extractiestap is cruciaal voor het later onderscheiden van vermoedelijke contaminanten van echte vectormicroben. Het gebruik van steriele techniek tijdens de extractiestap en latere PCR-stappen is ook noodzakelijk om de impact van contaminatie, die gebruikelijk is in 16S-sequentie, tot een minimum te beperken.
Stel de amplicon-PCR op in een 27,5 microliter reactie bevattende vijf microliter van elke primer bij een micromolar en 12,5 microliter van een commercieel verkrijgbaar PCR-mengsel. Voeg ook vijf microliter DNA toe dat is geëxtraheerd uit individuele teken bij een concentratie van vijf nanogram per microliter. Verplaats de buizen naar een thermocycler en voer het programma uit dat in het tekstprotocol is vermeld.
Zodra de PCR is voltooid, visualiseer het PCR-product door vier tot zes microliter per monster te laden op een 1,5% agarosegel. Zoek naar een band bij 460 basenparen om amplificatie te bevestigen. Gebruik voor elk monster een nieuwe PCR-buis en combineer het PCR-product met twee keer gedistilleerd water om een totaal van 60 microliter te verkrijgen.
Voor monsters met lage DNA-concentraties, voer amplicon PCR uit in drievoud om amplificatiebias te verminderen en pool de monsters om te concentreren. Breng paramagnetische kralen op kamertemperatuur en vortex ze goed voor gebruik. Voeg 48 microliter paramagnetische kralen toe aan 60 microliter van het monster en incubeer gedurende vijf minuten.
Plaats de buizen gedurende vijf minuten op een magnetische rek tot de oplossing helder wordt. Verwijder vervolgens het supernatant. Met buizen op de magnetische rek, voeg 500 microliter vers bereid 80% ethanol toe.
Direct na het toevoegen van ethanol aan alle buizen, pipet de vloeistof eruit, verwijder de kralen niet. Herhaal de toevoeging en verwijdering van ethanol nog een keer. Laat de monsters aan de lucht drogen om overtollig ethanol te verwijderen door de buizen vijf minuten open op de magnetische rek te laten staan of tot kleine scheuren zichtbaar zijn in de kralen.
Voeg nu 20 microliter TE-buffer toe en incubeer de monsters buiten de magneet bij kamertemperatuur. Plaats de buizen na vijf tot tien minuten weer op de magneet. Zodra de kralen en vloeistof gescheiden zijn, breng de supernatanten over naar een nieuwe buis om het gereinigde PCR-product te verkrijgen.
Ken unieke primercombinaties toe aan elk monster, door voorwaartse of achterwaartse primers of beide te selecteren uit een commercieel verkrijgbaar bibliotheekindexkit. Om de dubbele primers of indices aan de monsters te hechten, bereid een PCR-reactie voor met 2,5 microliter van elke primer, 12,5 microliter van een commercieel verkrijgbaar PCR Master Mix, vijf microliter twee keer gedistilleerd water en 2,5 microliter van het gereinigde ampliconproduct. Verplaats de buizen naar een thermocycler geprogrammeerd zoals beschreven in het tekstprotocol.
Zodra de PCR is voltooid, visualiseer het PCR-product door vier tot zes microliter per monster te laden op een 1,5% agarosegel. Zoek naar een band bij 550 basenparen om amplificatie te bevestigen voordat u de opruimprocedure uitvoert zoals eerder. Om een nauwkeurige kwantificering van elk gezuiverd barcodeproduct uit te voeren, voert u qPCR uit op elk monster en standaard in drievoud en voert u elk monster uit op drie of meer verdunningsniveaus.
Bereid 10 microliter qPCR-reacties voor met zes microliter qPCR Master Mix, twee microliter twee keer gedistilleerd water en twee microliter van het monster of de standaard. Verplaats de qPCR-plaat naar een real-time PCR-instrument geprogrammeerd zoals beschreven in het tekstprotocol en voer de run uit. Na kwantificering, creëer de gecombineerde bibliotheek door gelijke volumes van alle individuele bibliotheken in een enkele buis toe te voegen.
Na het verdunnen en denatureren van de gecombineerde bibliotheek en de sequentiecontrole, laadt u het gecombineerde mengsel op de sequentieflowcell. Reinig de flowcell grondig voor het laden voor optimale optica. Laad vervolgens de flowcell op de sequencer en voer ampliconsequentie-analyse uit.
Rarefactiecurven voor normalisatie van sequentietelling worden hier getoond. Deze curven geven aan dat het verdunning tot 2000 sequenties per monster voldoende zou moeten zijn om de volledige diversiteit van waargenomen operationele taxonomische eenheden te vangen. Na verdunning en kwaliteitsfiltering van de sequentiereads, worden alpha en beta diversiteit uitvoer uitgevoerd.
Hier wordt een automatisch gegenereerd hoofdcoördinatenanalyseplot getoond die aangeeft hoe de microbioomsamenstelling van de teek verschilt op basis van behandeling. Verder worden visualisaties van de microben die in elk monster aanwezig zijn, hier getoond op fylumniveau, automatisch voor alle monsters gemaakt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om steriele techniek te hand
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een next-generation sequencing-protocol voor 16S rRNA-sequencing, gericht op het identificeren en karakteriseren van microbiële gemeenschappen in vectoren, met een specifieke focus op teken. Het protocol maakt een hoge replicatie en resolutie mogelijk, wat bijdraagt aan een nauwkeurige karakterisering van vector-microbiomen onder diverse ecologische omstandigheden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Ecologie van door vectoren overgedragen ziekten
- Dynamiek van microbiële gemeenschappen
- Interacties van pathogenen met het microbioom
Achtergrond
- De rol van vectormicrobiomen in de ziekte-ecologie is onvoldoende begrepen.
- Huidige methoden missen uitgebreide bronnen voor microbioomsequencing.
- Microbiële contaminanten kunnen de analyse bij 16S rRNA-sequencing bemoeilijken.
Gebruikte methoden
- DNA-extractie, amplificatie en barcoding van monsters
- Tekenverzameling en verwijdering van oppervlakteverontreiniging
- High-throughput sequencing en bio-informatische analyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van microbiële taxa geassocieerd met teken
- Verbeterde methodologische transparantie voor microbioomkarakterisering
- Validatie van sterilisatietechnieken om contaminatie te beperken
Conclusies
- Deze methodologie biedt een robuust kader voor het bestuderen van vectormicrobiomen.
- Het draagt waardevolle inzichten bij aan de ecologie van door vectoren overgedragen ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Hoge-resolutie 16S rRNA amplicon sequencing van tekenmicrobiomen stelt biopharma R&D-teams in staat om interacties tussen vector, pathogeen en microbioom op grote schaal te onderzoeken, wat vroege target-validatie voor de bestrijding van vectoroverdraagbare ziekten ondersteunt. Deze aanpak beantwoordt aan de kritieke behoefte aan robuuste, kwantitatieve microbiële profilering in discovery-workflows, waar traditionele kweekmethoden en microscopie tekortschieten in gevoeligheid en doorvoer. Door identificatie op soort- en genusniveau over een groot aantal replica's mogelijk te maken, versterkt deze methode het voorspellend vertrouwen in onderzoekspijplijnen voor vectormicrobiomen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematische analyse van de samenstelling van het vectormicrobioom mogelijk onder diverse ecologische en experimentele omstandigheden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door echte microbiële bewoners te onderscheiden van contaminanten via negatieve controles en steriele technieken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door verschuivingen in het microbioom in kaart te brengen die geassocieerd zijn met de aanwezigheid van pathogenen of interventies.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor daaropvolgende vectorbestrijding of strategieën gericht op het microbioom.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde microbiële gemeenschapsprofielen voor voor gebruik bij het screenen van vector-pathogeeninteracties.
- Standaardiseert assay-outputs via kwantitatieve, reproduceerbare sequencing en normalisatie op basis van rarefactie.
- Maakt schaalbare, high-throughput analyse van meerdere monsters mogelijk met unieke barcoding en multiplexing.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van kandidaat-interventies die vector-microbiomen beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontdekking van translationele biomarkers door kwantitatieve metrieken voor diversiteit en compositie te bieden.
- Maakt continuïteit mogelijk van ecologische ontdekking naar preklinische validatie van microbiome-modulerende interventies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door microbiome-pathogeenrelaties te verduidelijken die relevant zijn voor ziekteoverdracht.
- Biedt mechanische risicoreductie voor therapeutische strategieën gericht op vectoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door robuuste microbiomanalyse mogelijk te maken, van vroege hypothesetoetsing tot translationeel onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesegestuurde analyse van microbiome-pathogeen dynamiek en ecologische variatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve microbiële profielen voor assay-ontwikkeling en het testen van interventies.
- Analytics: Biedt alpha/beta diversiteitsmetrieken, rarefactiecurves en principale coördinatenanalyse voor comparatieve studies.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ecologische bevindingen en preklinische modellen door microbiome-verschuivingen te kwantificeren die relevant zijn voor het ziekterisico.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbare, reproduceerbare workflow die aanpasbaar is voor andere studies naar het microbiome van vectoren of gastheren.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de karakterisering van het vector-microbioom.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt high-throughput schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen voor interventies gericht op het microbioom en strategieën voor vectorbestrijding.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor de beperking van door vectoren overgedragen ziekten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, steriele technieken en bioinformatica-analyse.
- Vereist toegang tot next-generation sequencing-platforms en real-time PCR-instrumentatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams om contaminatie te minimaliseren en de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpasbaar aan diverse vectorsoorten, maar beperkt in functionele of ruimtelijke microbiële resolutie.
- Kan microbiële functie, lokalisatie of antibioticumrespons niet direct beoordelen zonder complementaire methoden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Tick Surface Sterilization, DNA Purification, and 16S rRNA Gene Amplification
2:30
16S Amplicon Purification
3:59
Sample Barcoding and Purification
4:58
Library Quantification and Normalization
6:01
Results: Community Ecology of the Ixodes Microbiome
6:43
Conclusion
